梨黑斑病病原菌的生物学特性及其致病性观察_杨晓平
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菌液准备 :洗出在 PSA 培养基上培养的菌株孢 子 , 用 无菌水分别配 成孢子悬浮液浓 度为 2 ×105 个/ m L 。
取湘南梨的新梢顶端第 2 ～ 3 片完全展开的无 病虫害的叶片 , 用 0 .2 %的次氯酸钠和 75 %酒精表
面消毒各 5 s 后 , 再用无菌水冲洗干净 , 待用 。 将配 置好的病原菌孢子悬浮液用喷雾法接种到叶片 , 以 清水喷雾叶片作对照 。 置于 28 ℃恒温培养箱培养 , 14 d 后调查接种离体叶的发病情况 。 每个处理 30 片叶 , 重复 3 次 。
A
Hale Waihona Puke Baidu
8 .33 ×104 def
不同培养基上的生长速率有明显差异 。 其中 , A 、C 、
面粉 Fl ou r
C H
8 .50 ×104 def 1 .45 ×105 de
H 3 个菌株在 PSA 培养基上日平均生长速率最快 。 1)纵列数据后字母相同者 , 表示差异不显著(P >0 .05 , 下表同)
1 材料与方法
每天同一时间测量菌落直径并观察和记载菌落 颜色及厚度 。 培养 2 周后测量产孢量 。 每处理重复
1 .1 供试材料
3次 。
砂梨叶片 :采自位于湖北省武汉市江夏区的国 1 .4 不同时期孢子发芽率的观察
家果树种质武昌砂梨圃 , 品种为湘南 。
供试病原菌培养 2 周后 , 洗出菌株的孢子液 , 置
5 .67 ×104 edf 9 .37 ×105 b 1 .83 ×106 a
A
P DA
C
H
3 .83 ×104 ef 5 .52 ×105 c
1 .47 ×106 de
A
查氏 Cz apek's
C
H
1 .17 ×104 f 1 .55 ×105 de
1 .70 ×105 d
1)菌丝生长速率 。 试验结果表明 :供试菌株在
主要仪器 :恒温培 养箱 GZP-250 , 上海精 宏试
1933 年 T anaka 首次在日本报道梨黑 斑病[ 1] ;1999 验设备有限公司产品 ;生物显微镜 XSZ-4G , 重庆光
年 Baudry 在法国发现该病[ 2] ;中国于 1935 年发现 电仪器有限公司产 品 ;血球计数板 X B-K-25 , 上海
培养基 :P SA 培养基 、PDA 培养基和查氏培养 于 28 ℃恒温培养 箱培养 , 分别于 0 h 、 2 h 、 4 h 、
基(Czapek′s medium), 培养基配方详见文献[ 7] 。 6 h 、 8 h 、 10 h 、12 h 、14 h 后观察并记录各菌株的
收稿日期 :2009-05-06 ;修回日期 :2009-06-05 ＊国家科技基础条件平台项目(2006DK A 21002-24)、现代农业 产业技术 体系建设 项目(ny cyt x-29-23 、湖北农 业科技 创新 专项资 金(2007620-005-03-03)资助 ＊＊通讯作者 .E-mai l :ypw ang7485 @263 .com 杨晓平, 男, 1981 年生, 硕士, 助理研究员 .工作单位:湖北省农业科学院果树茶叶研究所 , 武汉 430209.E-mail :yangxiaoping1981@163 .com
第 6 期
杨晓平 等 :梨黑斑病病原菌的生物学特性及其致病性观察
681
孢子发芽率 。 1 .5 不同培养基菌丝生长和产孢量的观察
将各供试菌株的菌丝块分别移植于 P SA 培养 基 、P DA 培养基 、查氏培养基和面粉培养基上 , 置于 28 ℃恒温培养箱内光照条件下培养 。 每天测量菌 落直径并观察记录菌落颜色及厚度 。培养 2 周后测 量产孢量 。每处理重复 3 次 。 1 .6 不同光照条件菌丝生长和产孢量的观察
均生长速率为 0 .95 cm/ d , 菌株 C 日平均生长速率 2 .5 光照条件对病原菌的影响
为 0 .96 cm/ d ;3 个菌株在查氏培养基上日平均生长
1)菌丝生长速率 。 试验结果表明 :不同的光照
速率最慢 。
条件对供试病原菌菌丝的生长有显著影响 。 A 菌株
菌株 A 在 PSA 和查氏培养基上均在第 6 天达 在第 1 ～ 4 天时 , 菌丝日生长速率差异不大 , 第 5 天
菌株 A 日平均生长速率为 0 .92 cm/ d , 菌株 H 日平
The dat a w it hin a colu mn foll owed th e same let ter are not signifi cant ly dif f erent at 5 % level(t he sam e as f ollow ing tables)
关键词 梨黑斑病 ;生物学特性 ;致病性 ;病情指数 中图法分类号 S 436 .612 .1 +4 ;S 661.2 文献标识码 A 文章编号 1000-2421(2009)06-0680-05
梨黑斑病又名裂果病 , 是梨的三大病害之一 , 由
自配面粉培养基(flour medi um)的配方 :锯屑
该病[ 3] 。
安信光学仪器制造有限公司产品 。
梨黑斑病主要危害叶 、果实和新梢 , 导致树体衰 1 .2 病原菌的分离
弱 , 结果年限缩短 , 并引起贮藏期果实发病 , 造成重
采集梨黑斑病叶片 , 按常规方法进行组织分离 、
大经济损失[ 4-5] 。 2003 年底至 2004 年初 , 美国以中 单孢纯化 、培养 、保存 。根据柯赫氏法则将分离获得
观察结果表明 :在不同培养时间菌株孢子的发 芽率有显著不同 , 培养 6 h 时 , A 、C 、H 3 个菌株的 发芽率均能达到最高峰 , 其中菌株 A 发芽率最高达 84 .5 %, 菌 株 C 最 高 达 73 .3 %, 菌 株 H 达 到 85 .8 %;8 h 和 10 h 计数时 , 孢子发芽率基本不变 ; 3 个菌株在不同时期的发芽趋势大体相同 。 2 .4 不同培养基对病原菌的影响
田间接种在国家果树种质武昌砂梨圃进行 。 采 用湘南嫁接苗 , 用供试孢子液喷雾 , 30 d 后每个处 理随机调查 300 片叶 , 并计算各处理的病情指数和 发病率 。
病情指数的分级标准和计算公式参见文献[ 8] 。 1 .9 数据处理
应用 SAS 8 .0 版本统计软件对试验数据进行 统计分析 。
真菌的链格孢菌 Al ternaria al ternate (F r .)Keissl 200 g , 麦麸 150 g , 玉米面 100 g , 米面 25 g , 蔗糖
侵染引起 。该病是梨树上广泛发生的世界性病害 , 25 g , 水 625 m L 。
尤其在 亚 洲的 日 本 、韩 国和 中 国发 病十 分 严重 。
DO I :10.13300/j .cnki .hnlkxb.2009.06.013
第 28 卷 第 6 期
华 中 农 业 大 学 学 报
2009 年 12 月
Journal o f Huazho ng A g ricultura l U nive rsity
Vo l.28 No .6 Dec .2009, 680～ 684
2 结果与分析
2 .1 病原菌的鉴定 把分离获得的 11 株病原菌接种到幼嫩的健康
梨叶片上 , 其中 A 、C 、H 3 个菌株能产生典型的黑斑 病病斑 。 通过对产生的病斑进行再次分离 , 挑取单 孢纯化 , 可获得病原菌菌株 。
在显微镜下分别观察供试病原菌的形态特征 , 结果表明 :供试 3 个病原菌菌株的分生孢子梗单生 或数根束生 , 褐色或 暗褐色 ;分 生孢子棒状或 倒棒 状 , 褐色或黑褐色 , 有纵隔 1 ～ 3 个 , 横隔 2 ～ 4 个 , 横 隔处有缢缩现象(图 1)。根据供试病原菌的形态特 征和培养性状 , 鉴定该病原菌为半知菌亚门丝孢纲 丝孢目链格孢属真菌 。
梨黑斑病病原菌的生物学特性及其致病性观察 ＊
杨晓平 胡红菊 王友平＊＊ 田 瑞 陈启亮 张靖国
(湖北省农业科学院果树茶叶研究所 , 武汉 430209 )
摘要 采用室内离体接种和室外孢子喷雾接种方法 , 对 3 株梨黑斑病病原菌的生物学特性和致病 性进行了 观察 。结果表 明 :供试各菌株在 P SA 培养基上培养 , 平均日 生长速 率 、产 孢量 、菌落 颜色及 菌落厚度 差异显 著 ; 各病原菌菌株在光照 、黑暗和 12 h 光暗 交替培养时 , 日 生长速 率和产 孢量有 明显差 异 ;黑 斑病病 原菌最 适生长 和产孢培养基为 PSA ;孢子萌发最适 pH 值 8 ～ 10 ;菌株 A 和菌株 H 的致 病力显著强于菌株 C , 但这 2 个菌株间 的致病性无显著差异 ;A 、C 、H 3 种菌株混合接种时 , 可使梨叶片表现自然发病时的典型病斑 。
国出口鸭梨上检出梨黑斑病新种为由暂停进口我国 的菌株接种到幼嫩的梨叶片上 , 观察能否产生典型
鸭梨 , 随后加拿大也采取了类似的暂停措施 , 给我国 的黑斑病病斑 。
鸭梨产业和出口企业造成严重威胁[ 6] 。目前 , 国内 1 .3 病原菌生长特性的观察
对于梨黑斑病原菌的生物学特性的研究较少 。为了
株 H 日平均生长速率最大 , 为 1 .44 cm/ d , 菌株 A 个/ m L 。 供试 3 个菌株的菌落颜色 、厚度均不同 :菌
6 8 2
华中农业大学学报
第 28 卷
株 A 菌落颜色较浅 , 呈灰色 , 菌落薄 , 气生菌丝密 ; 菌株 C 颜色较深 , 呈深绿色 , 菌落厚 ;菌株 H 颜色最 深 , 呈墨绿色 , 菌落厚 。 2 .3 培养时间对孢子发芽率的影响
观察结果表明 :菌株 A 、菌株 C 和菌株 H 3 个 生长速率居中 , 为 1 .38 cm/ d ;产孢量最大的是菌株
供试菌株在 PSA 培养基上培养后 , 其日平均生长速 H , 为 1 .83 ×106个/ m L , 产孢量最少的是菌株 A , 为
率 、菌落颜色 、产孢量及菌落厚度均有显著差异 。 菌 5 .67 ×104 个/ m L , 菌株 C 的产孢 量为 9 .37 ×105
将各供试菌株的菌丝块接种到 P SA 培养基上 , 置于连续光照 、连续黑暗及 光照 12 h 与 黑暗 12 h 交替条件下 , 每天同一时间测量菌落直径观察菌落 颜色及厚度 。培养 2 周后测量产孢量 。 每处理重复 3次 。 1 .7 pH 值对孢子发芽率影响的观察
取 250 mL 锥形 瓶 , 装入 200 m L 蒸 馏 水 , 用 1 m ol/ L N aO H 和 0 .1 mol/ L H2SO 4 调 pH 值分别 至 1 、2 、3 、4 、5 、6 、7 、8 、9 、10 、11 、12 、13 、14 , 高压灭菌 20 min 。 然后分别将不同菌株的孢子液 2 m L 加入 不同 pH 值的锥形瓶中 , 摇匀后分别置于 28 ℃恒温 培养箱培养 , 6 h 后观察分生孢子发芽率 。 每处理 重复 3 次 。 1 .8 病原菌致病性的测定
将分离获得的病原菌分别移植于 P SA 培养基
解梨黑斑病病原菌的特性 , 笔者对其生物学特性和 上 , 28 ℃保湿培养 2 周后 , 用打孔器(直径 6 mm)在
致病性进行了系统观察 , 旨在为梨黑斑病的防治和 菌落边缘打孔 , 再将菌丝块放置于新鲜的培养基上 。
抗病品种的筛选提供理论依据 。
28 ℃恒温培养箱光照条件下培养 。
表 1 不同培养基对 3 个菌株产孢量的影响1) Table 1 Effect of different medium to the spores
quantity of three strains
培养基 M ediu m
PS A
菌株 St rain
A C H
产孢量/(个 · m L -1) Spo re qu ant it y
图 1 A、H、C 3 个菌株在显微镜下的孢子形态(10 ×40)
Fig.1 The spores of isolated three strains A, H and C observed under the microscope(10 ×40)
2 .2 菌株的生物学特性
日平均生长速率最小 , 为 0 .91 cm/ d , 菌株 C 日平均
取湘南梨的新梢顶端第 2 ～ 3 片完全展开的无 病虫害的叶片 , 用 0 .2 %的次氯酸钠和 75 %酒精表
面消毒各 5 s 后 , 再用无菌水冲洗干净 , 待用 。 将配 置好的病原菌孢子悬浮液用喷雾法接种到叶片 , 以 清水喷雾叶片作对照 。 置于 28 ℃恒温培养箱培养 , 14 d 后调查接种离体叶的发病情况 。 每个处理 30 片叶 , 重复 3 次 。
A
Hale Waihona Puke Baidu
8 .33 ×104 def
不同培养基上的生长速率有明显差异 。 其中 , A 、C 、
面粉 Fl ou r
C H
8 .50 ×104 def 1 .45 ×105 de
H 3 个菌株在 PSA 培养基上日平均生长速率最快 。 1)纵列数据后字母相同者 , 表示差异不显著(P >0 .05 , 下表同)
1 材料与方法
每天同一时间测量菌落直径并观察和记载菌落 颜色及厚度 。 培养 2 周后测量产孢量 。 每处理重复
1 .1 供试材料
3次 。
砂梨叶片 :采自位于湖北省武汉市江夏区的国 1 .4 不同时期孢子发芽率的观察
家果树种质武昌砂梨圃 , 品种为湘南 。
供试病原菌培养 2 周后 , 洗出菌株的孢子液 , 置
5 .67 ×104 edf 9 .37 ×105 b 1 .83 ×106 a
A
P DA
C
H
3 .83 ×104 ef 5 .52 ×105 c
1 .47 ×106 de
A
查氏 Cz apek's
C
H
1 .17 ×104 f 1 .55 ×105 de
1 .70 ×105 d
1)菌丝生长速率 。 试验结果表明 :供试菌株在
主要仪器 :恒温培 养箱 GZP-250 , 上海精 宏试
1933 年 T anaka 首次在日本报道梨黑 斑病[ 1] ;1999 验设备有限公司产品 ;生物显微镜 XSZ-4G , 重庆光
年 Baudry 在法国发现该病[ 2] ;中国于 1935 年发现 电仪器有限公司产 品 ;血球计数板 X B-K-25 , 上海
培养基 :P SA 培养基 、PDA 培养基和查氏培养 于 28 ℃恒温培养 箱培养 , 分别于 0 h 、 2 h 、 4 h 、
基(Czapek′s medium), 培养基配方详见文献[ 7] 。 6 h 、 8 h 、 10 h 、12 h 、14 h 后观察并记录各菌株的
收稿日期 :2009-05-06 ;修回日期 :2009-06-05 ＊国家科技基础条件平台项目(2006DK A 21002-24)、现代农业 产业技术 体系建设 项目(ny cyt x-29-23 、湖北农 业科技 创新 专项资 金(2007620-005-03-03)资助 ＊＊通讯作者 .E-mai l :ypw ang7485 @263 .com 杨晓平, 男, 1981 年生, 硕士, 助理研究员 .工作单位:湖北省农业科学院果树茶叶研究所 , 武汉 430209.E-mail :yangxiaoping1981@163 .com
第 6 期
杨晓平 等 :梨黑斑病病原菌的生物学特性及其致病性观察
681
孢子发芽率 。 1 .5 不同培养基菌丝生长和产孢量的观察
将各供试菌株的菌丝块分别移植于 P SA 培养 基 、P DA 培养基 、查氏培养基和面粉培养基上 , 置于 28 ℃恒温培养箱内光照条件下培养 。 每天测量菌 落直径并观察记录菌落颜色及厚度 。培养 2 周后测 量产孢量 。每处理重复 3 次 。 1 .6 不同光照条件菌丝生长和产孢量的观察
均生长速率为 0 .95 cm/ d , 菌株 C 日平均生长速率 2 .5 光照条件对病原菌的影响
为 0 .96 cm/ d ;3 个菌株在查氏培养基上日平均生长
1)菌丝生长速率 。 试验结果表明 :不同的光照
速率最慢 。
条件对供试病原菌菌丝的生长有显著影响 。 A 菌株
菌株 A 在 PSA 和查氏培养基上均在第 6 天达 在第 1 ～ 4 天时 , 菌丝日生长速率差异不大 , 第 5 天
菌株 A 日平均生长速率为 0 .92 cm/ d , 菌株 H 日平
The dat a w it hin a colu mn foll owed th e same let ter are not signifi cant ly dif f erent at 5 % level(t he sam e as f ollow ing tables)
关键词 梨黑斑病 ;生物学特性 ;致病性 ;病情指数 中图法分类号 S 436 .612 .1 +4 ;S 661.2 文献标识码 A 文章编号 1000-2421(2009)06-0680-05
梨黑斑病又名裂果病 , 是梨的三大病害之一 , 由
自配面粉培养基(flour medi um)的配方 :锯屑
该病[ 3] 。
安信光学仪器制造有限公司产品 。
梨黑斑病主要危害叶 、果实和新梢 , 导致树体衰 1 .2 病原菌的分离
弱 , 结果年限缩短 , 并引起贮藏期果实发病 , 造成重
采集梨黑斑病叶片 , 按常规方法进行组织分离 、
大经济损失[ 4-5] 。 2003 年底至 2004 年初 , 美国以中 单孢纯化 、培养 、保存 。根据柯赫氏法则将分离获得
观察结果表明 :在不同培养时间菌株孢子的发 芽率有显著不同 , 培养 6 h 时 , A 、C 、H 3 个菌株的 发芽率均能达到最高峰 , 其中菌株 A 发芽率最高达 84 .5 %, 菌 株 C 最 高 达 73 .3 %, 菌 株 H 达 到 85 .8 %;8 h 和 10 h 计数时 , 孢子发芽率基本不变 ; 3 个菌株在不同时期的发芽趋势大体相同 。 2 .4 不同培养基对病原菌的影响
田间接种在国家果树种质武昌砂梨圃进行 。 采 用湘南嫁接苗 , 用供试孢子液喷雾 , 30 d 后每个处 理随机调查 300 片叶 , 并计算各处理的病情指数和 发病率 。
病情指数的分级标准和计算公式参见文献[ 8] 。 1 .9 数据处理
应用 SAS 8 .0 版本统计软件对试验数据进行 统计分析 。
真菌的链格孢菌 Al ternaria al ternate (F r .)Keissl 200 g , 麦麸 150 g , 玉米面 100 g , 米面 25 g , 蔗糖
侵染引起 。该病是梨树上广泛发生的世界性病害 , 25 g , 水 625 m L 。
尤其在 亚 洲的 日 本 、韩 国和 中 国发 病十 分 严重 。
DO I :10.13300/j .cnki .hnlkxb.2009.06.013
第 28 卷 第 6 期
华 中 农 业 大 学 学 报
2009 年 12 月
Journal o f Huazho ng A g ricultura l U nive rsity
Vo l.28 No .6 Dec .2009, 680～ 684
2 结果与分析
2 .1 病原菌的鉴定 把分离获得的 11 株病原菌接种到幼嫩的健康
梨叶片上 , 其中 A 、C 、H 3 个菌株能产生典型的黑斑 病病斑 。 通过对产生的病斑进行再次分离 , 挑取单 孢纯化 , 可获得病原菌菌株 。
在显微镜下分别观察供试病原菌的形态特征 , 结果表明 :供试 3 个病原菌菌株的分生孢子梗单生 或数根束生 , 褐色或 暗褐色 ;分 生孢子棒状或 倒棒 状 , 褐色或黑褐色 , 有纵隔 1 ～ 3 个 , 横隔 2 ～ 4 个 , 横 隔处有缢缩现象(图 1)。根据供试病原菌的形态特 征和培养性状 , 鉴定该病原菌为半知菌亚门丝孢纲 丝孢目链格孢属真菌 。
梨黑斑病病原菌的生物学特性及其致病性观察 ＊
杨晓平 胡红菊 王友平＊＊ 田 瑞 陈启亮 张靖国
(湖北省农业科学院果树茶叶研究所 , 武汉 430209 )
摘要 采用室内离体接种和室外孢子喷雾接种方法 , 对 3 株梨黑斑病病原菌的生物学特性和致病 性进行了 观察 。结果表 明 :供试各菌株在 P SA 培养基上培养 , 平均日 生长速 率 、产 孢量 、菌落 颜色及 菌落厚度 差异显 著 ; 各病原菌菌株在光照 、黑暗和 12 h 光暗 交替培养时 , 日 生长速 率和产 孢量有 明显差 异 ;黑 斑病病 原菌最 适生长 和产孢培养基为 PSA ;孢子萌发最适 pH 值 8 ～ 10 ;菌株 A 和菌株 H 的致 病力显著强于菌株 C , 但这 2 个菌株间 的致病性无显著差异 ;A 、C 、H 3 种菌株混合接种时 , 可使梨叶片表现自然发病时的典型病斑 。
国出口鸭梨上检出梨黑斑病新种为由暂停进口我国 的菌株接种到幼嫩的梨叶片上 , 观察能否产生典型
鸭梨 , 随后加拿大也采取了类似的暂停措施 , 给我国 的黑斑病病斑 。
鸭梨产业和出口企业造成严重威胁[ 6] 。目前 , 国内 1 .3 病原菌生长特性的观察
对于梨黑斑病原菌的生物学特性的研究较少 。为了
株 H 日平均生长速率最大 , 为 1 .44 cm/ d , 菌株 A 个/ m L 。 供试 3 个菌株的菌落颜色 、厚度均不同 :菌
6 8 2
华中农业大学学报
第 28 卷
株 A 菌落颜色较浅 , 呈灰色 , 菌落薄 , 气生菌丝密 ; 菌株 C 颜色较深 , 呈深绿色 , 菌落厚 ;菌株 H 颜色最 深 , 呈墨绿色 , 菌落厚 。 2 .3 培养时间对孢子发芽率的影响
观察结果表明 :菌株 A 、菌株 C 和菌株 H 3 个 生长速率居中 , 为 1 .38 cm/ d ;产孢量最大的是菌株
供试菌株在 PSA 培养基上培养后 , 其日平均生长速 H , 为 1 .83 ×106个/ m L , 产孢量最少的是菌株 A , 为
率 、菌落颜色 、产孢量及菌落厚度均有显著差异 。 菌 5 .67 ×104 个/ m L , 菌株 C 的产孢 量为 9 .37 ×105
将各供试菌株的菌丝块接种到 P SA 培养基上 , 置于连续光照 、连续黑暗及 光照 12 h 与 黑暗 12 h 交替条件下 , 每天同一时间测量菌落直径观察菌落 颜色及厚度 。培养 2 周后测量产孢量 。 每处理重复 3次 。 1 .7 pH 值对孢子发芽率影响的观察
取 250 mL 锥形 瓶 , 装入 200 m L 蒸 馏 水 , 用 1 m ol/ L N aO H 和 0 .1 mol/ L H2SO 4 调 pH 值分别 至 1 、2 、3 、4 、5 、6 、7 、8 、9 、10 、11 、12 、13 、14 , 高压灭菌 20 min 。 然后分别将不同菌株的孢子液 2 m L 加入 不同 pH 值的锥形瓶中 , 摇匀后分别置于 28 ℃恒温 培养箱培养 , 6 h 后观察分生孢子发芽率 。 每处理 重复 3 次 。 1 .8 病原菌致病性的测定
将分离获得的病原菌分别移植于 P SA 培养基
解梨黑斑病病原菌的特性 , 笔者对其生物学特性和 上 , 28 ℃保湿培养 2 周后 , 用打孔器(直径 6 mm)在
致病性进行了系统观察 , 旨在为梨黑斑病的防治和 菌落边缘打孔 , 再将菌丝块放置于新鲜的培养基上 。
抗病品种的筛选提供理论依据 。
28 ℃恒温培养箱光照条件下培养 。
表 1 不同培养基对 3 个菌株产孢量的影响1) Table 1 Effect of different medium to the spores
quantity of three strains
培养基 M ediu m
PS A
菌株 St rain
A C H
产孢量/(个 · m L -1) Spo re qu ant it y
图 1 A、H、C 3 个菌株在显微镜下的孢子形态(10 ×40)
Fig.1 The spores of isolated three strains A, H and C observed under the microscope(10 ×40)
2 .2 菌株的生物学特性
日平均生长速率最小 , 为 0 .91 cm/ d , 菌株 C 日平均