hzau微生物遗传第四章微生物诱变育种
微生物的诱变育种
微生物的诱变育种作者：佚名来源：生物秀时间：2008-4-18实验仪器大全实验试剂大全一、实验目的和内容目的：以紫外线诱变获得用于酱油生产的高产蛋白酶菌株为例，学习微生物诱变育种的基本操作方法。
内容：1．对米曲霉(Aspergills oryzae )出发菌株进行处理，制备孢子悬液。
2．用紫外线进行诱变处理。
3．用平板透明圈法进行两次初筛。
4．用摇瓶法进行复筛及酶活性测定。
二、实验材料和用具米曲霉斜面菌种；豆饼斜面培养基、酪素培养基、蒸馏水、0.5%酪蛋白；三角瓶(300mL、500mL)、试管、培养皿(9cm)、恒温摇床、恒温培养箱、紫外照射箱、磁力搅拌器、脱脂棉、无菌漏斗、玻璃珠、移液管、涂布器、酒精灯。
三、操作步骤(一)出发菌株的选择及菌悬液制备1．出发菌株的选择可直接选用生产酱油的米曲霉菌株，或选用高产蛋白酶的米曲霉菌株。
2. 菌悬液制备取出发菌株转接至豆饼斜面培养基中，30℃培养3～5d 活化。
然后孢子洗至装有1mL 0.lmol/L pH6.0 的无菌磷酸缓冲液的三角瓶中(内装玻璃珠，装量以大致铺满瓶底为宜)，30℃振荡30min，用垫有脱脂棉的灭菌漏斗过滤，制成把子悬液，调其浓度为106～108 个/mL，冷冻保藏备用。
(二)诱变处理用物理方法或化学方法，所用诱变剂种类及剂量的选择可视具体情况决定，有时还可采用复合处理，可获得更好的结果。
本实验学习用紫外线照射的诱变方法。
1．紫外线处理打开紫外灯(30W)预热20min。
取5mL 菌悬液放在无菌的培养皿(9cm)中，同时制作5 份。
逐一操作，将培养皿平放在离紫外灯30cm(垂直距离)处的磁力搅拌器上，照射l min 后打开培养皿盖，开始照射，与照射处理开始的同时打开磁力搅拌器进行搅拌，即时计算时间，照射时间分别为15 s、30 s、l min、2 min、5 min。
照射后，诱变菌液在黑暗冷冻中保存1～2h 然后在红灯下稀释涂菌进行初筛。
微生物诱变育种技术
微生物诱变育种技术介绍了微生物诱变育种的各种方法，对经典的诱变技术、复合诱变和新型的诱变技术等处理方法进行了比较。
对离子注入法和等离子体诱变育种等新型诱变育种技术的机理进行了阐述，并对其优缺点以及潜在的研究方向进行了论述。
标签：微生物诱变；离子注入法；等离子体诱变微生物诱变育种是一种基因突变技术，通过技术手段改变微生物的遗传结构和功能，进而筛选出具有特定性状的，优良突变型微生物。
这种育种方式，具有较高的微生物变异率，变异速度快，效率高等优点，是食品加工和医药生产等工业的首选方法。
常用的微生物诱变育种方法包括物理法、化学法和生物法等，其中物理法诱变包括：紫外诱变、X射线诱变和γ射线诱变等，化学法诱变包括烷基磺酸盐和烷基硫酸盐、亚硝基烷基化合物、次乙胺和环氧乙烷类和芥子气类），生物法包括基因转导、基因转化和转座子诱变等。
复合诱变是指采用两种及以上的诱变方法，对微生物进行诱变，制的目标菌株。
通常仅采用一种方法进行诱变，会使微生物产生抗性，从而降低突变率，复合诱变具有补充不同诱变方法之间缺陷的优势。
近些年涌现出一批创新的诱变技术，如离子注入诱变法、大气压冷等离子诱变，其中离子注入诱变法具有与复合诱变相似的特性，日趋成为研究诱变技术的主流方向。
原生质体是包含细胞膜和膜内细胞质及其他具有生命活性细胞器的生物质，对于微生物来说即去除细胞壁的细胞。
原生质体也可以作为诱变的对象，其对外界敏感度很高，因此变异率也很高。
1 经典诱变技术1.1 物理诱变1.1.1 紫外诱变DNA由以嘌呤和嘧啶为碱基的核苷酸组成，紫外线诱变可以使嘧啶形成二聚体，DNA在复制和转录时，因存在嘧啶二聚体而不能分离，进而发生变异。
该方法简单、操作安全且诱变率高，其缺点：诱变原理简单，引起的突变单一，形成的突变体类型较少，而对于基因损伤及其修复的研究却很有意义。
现在，对于细菌、酵母菌或霉菌的紫外诱变往往是对其原生质体的诱变，缺少了细胞壁对细胞的保护，紫外线可以更直接的作用于DNA，提高突变率，从而产生更多的突变体和表现型。
第四章 微生物育种1
出发菌株（注意事项）
• 选择具备一定生产能力或某种特性的菌 株 • 选择纯种（单倍体、单核、少核） • 应考虑其稳定性 • 连续诱变育种过程中如何选择出发菌株 （应挑选每代诱变处理后均有一些表型 上改变的菌株）
二 单细胞（孢子）悬浮液的制备 • 要选幼龄的孢子或菌体做供试菌株 • 菌悬液的制备方法
三 诱变剂及诱变剂量 • 诱变剂种类的选择 • 最适诱变剂量的选择
第四章 微生物育种
第一节 突变的一般规律
• 基因突变：指DNA特定部位上核苷酸顺序 的变化，致使蛋白质的结构改变，最后 导致个体表型不同。 • 表型：基因突变形成新的基因型在一定 环境条件下表现出来的个体性状。 • 突变体：突变产生新表型的个体。
一 突变引起遗传性状改变
同义突变 无义突变 错义突变 移码突变
突变的表型效应
• 突变不改变遗传性状 • 显性突变和隐性突变的表型效应 • 突变的表型与环境
突变型的种类
• • • • • 形态突变型 生化突变型 条件致死突变型 致死突变型 产量突变型
抗性突变体产生原因
• 驯化？ • 突变？
103个/产生原因
• 突变 • 质粒 • 生理适应
四 了解菌种有效产物中的各种组分在代谢 合成过程中与培养条件的关系 五 建立一个准确、简便、快速检测产物的 方法 六 研究最佳的菌种保藏培养基和培养条件
第三节 诱变育种的步骤与方法
• 诱发突变 • 突变株的筛选 • 高产突变株最佳环境的调整
一
出发菌株（来源）
• 野生菌株 • 经过自然选育的生产用菌种 • 经人工选育的生产用菌种
突
• 自发突变 • 诱发突变
变
自发突变的原因
• 环境因素：宇宙间的紫外线、短波辐射、 高温、病毒等。 • 互变异构效应和碱基错配 • 自身代谢产物的作用：过氧化氢、硫氰 化合物、咖啡碱等。 • 环出效应
微生物 诱变育种
紫外损伤的光复活作用
DNA损伤的修复
切补修复 切补修复是在内切核酸酶、
外切核酸酶、DNA聚合酶以及 连接酶的协同作用下将嘧啶 二聚体酶切除去，继而重新 合成一段正常的DNA链以填补 酶切所留下的缺口，使损伤 的DNA分子恢复正常的修复方 式。由于整个过程不依赖于 可见光，所以切补修复也称 暗修复。切补修复几乎存在 于所有的微生物中。
也可用长了菌落的平板直接照射。 一般照射剂量4~10万伦琴。
此外还能引起染色体畸变，即因 染色体断裂引起染色体的倒位、 缺损和重组等。但发生了染色体
断裂的细胞常常不稳定。
化学诱变因素
化学诱变剂用量很少，诱变时设
备简单，只要一般实验室的玻璃 器皿就行，所以其应用发展较快。
碱基类似物
碱基类似物是指与DNA结构中的四种碱基 A、T、G、C在化学结构上相似的一类物 质。如5-溴尿嘧啶（BU）和5-溴脱氧尿
紫外损伤的切补修复
紫外线照射的操作方法
在暗室中安装的15瓦紫外线灯管最 好装有稳压装置，以求剂量稳定。
处理时，可将5毫升菌悬液放在直径 5厘米的培养皿中，置磁力搅拌器上， 使培养皿底部离灯管30厘米左右， 培养皿底要放平，处理前应先开灯 20~30分钟预热稳定。照射时启动磁 力搅拌器，以求照射均匀。
诱变育种
第一节基因突变
突变泛指细胞内（或病毒颗粒 内）的遗传物质的分子结构或 数量突然发生的可遗传的变化。
突变往往导致产生新的等位基 因及新的表现型。狭义的突变 专指基因突变，也称点突变， 而广义的突变则包括基因突变 和染色体畸变。
突变的几率一般很低，约为106~10-9。
突变是工业微生物产生变种 的根源，是育种的基础，但 也是菌种发生退化的主要原 因。
微生物的遗传变异与育种优秀课件
❖ 选用TMV和霍氏车前花叶病毒（HRV），分别 拆分取得各自的RNA和蛋白质，将两种RNA分 别与对方的蛋白质外壳重建形成两种杂合病毒：
活R菌
❖①加S菌DNA ❖②加S菌DNA及DNA酶以
外的酶 ❖③加S菌的DNA和DNA酶 ❖④加S菌的RNA ❖⑤加S菌的蛋白质 ❖⑥加S菌的荚膜多糖
长出S菌 只有R菌
只有S型细菌的DNA才能将S. Pneumoniae的R型转 化为S型。且DNA纯度越高，转化效率也越高。说 明S型菌株转移给R型菌株的，是遗传因子。
1928年，Griffith进行了以下几组实验： （1）动物实验
对小鼠注射活R菌或死S菌 ————小鼠存活 对小鼠注射活S菌————————小鼠死亡 对小鼠注射活R菌和热死S菌 ———小鼠死亡
抽取心血分离活的S菌
（2）细菌培养实验 热死S菌—————不生长 活R 菌—————长出R菌 热死S菌+活R 菌—————长出大量R菌和10-6S菌
遗传与变异的概念
❖ 遗传型（genotype）：一个生物体所含有的基 因的总和。
❖ 表型（phenotype）：一个生物体所具有的一切 外表特征和内在特性的总和。
❖ 饰变（modification）：指生物体由于非遗传因 素引起的表型改变，变化发生在转录、转译水 平，特点是几乎整个群体中的每一个个体都发 生同样的变化，性状变化的幅度小，不遗传， 引起饰变的因素消失后，表型即可恢复。
❖ 对微生物遗传规律的深入研究，不仅促进了现 代分子生物学和生物工程学的发展，而且为育 种工作提供了丰富的理论基础，促使育种工作 从不自觉到自觉、从低效到高效、从随机到定 向、从近缘杂交到远缘杂交的方向发展。
微生物育种――诱变育种
微生物育种――诱变育种微生物育种――诱变育种摘要分析了近几年国内外对微生物诱变育种领域的研究新进展，对生物学效应及诱变微生物机理进行总结。
从物理诱变、化学诱变方面的诱变效应和作用机制及育种在酶制剂、抗生素、氨基酸、维生素及杀虫剂等高产菌种选育中的应用；对该技术与空间技术的结合在微生物菌种选育中的应用前景进行了分析。
关键词诱变微生物育种展望诱变育种是通过诱变剂的处理提高菌种突变的几率，从中筛选出具有优良特性的变异菌株，也是通过诱发基因突变为手段的微生物育种技术。
1927年发现X射线具有增加突变率的效应；1944年发现氮芥子气的诱变效应；其后，人们陆续发现了许多物理的和化学诱变因素。
诱变育种其操作简便，突变率高，突变谱也广，不仅提高产量，改良质量还可以扩大产品的品种和简化工艺条件，随着新的诱变因子不断发现和筛选体系进一步的完善，微生物的诱变育种有了开展。
一、诱变方法物理诱变1、紫外照射：是诱发微生物突变的常用的非常有用的物理诱变方法之一，紫外辐射的作用有许多解释，比拟确定的作用是能够使DNA 分子形成嘧啶二聚体，阻碍碱基也碱基之间正常配对。
2、电离辐射：是电离生物学上有高能量的产生电离作用，应用最广泛的电离射线之一，可直接或间接的变化DNA 结构。
直接效应可以氧化脱氧核糖的碱基，间接效应是使水或有机分子产生自由基。
3、激光：是一种光量子流，能量密度高、靶点小而且单色性与方向性都好的光微粒。
这种辐射通过产生光、热等效应的综合应用，直接、间接影响有机体，从而引起细胞染色体畸变效应和酶的激活与钝化。
4、微波：是一种有较强生物效应的低能电磁辐射，对生物体有热效应或非热效应。
热效应指它能引起生物体局部温度上升，非热效应是在其作用下，生物体产生非温度关系的各种反响。
所以，微波也被用作多个领域的诱变育种。
化学诱变1、烷化剂：诱发突变中一类相当有效的化学诱变剂，引起DNA 复制碱基配对的转换而遗传变异。
常用的烷化剂都有甲基磺酸乙酯、亚硝基胍或硫酸二乙酯等。
食品微生物学 第四章微生物遗传与菌种选育 第一节微生物遗传变异
微生物遗传与菌种选育
（5）产量突变型 通过基因突变而获得有用的代谢产物 在产量上高于原始菌株的突变株，也称高产突变株，这在发 酵食品生产及抗生素生产中十分重要。但由于产量性状是由 许多遗传因子决定的，因此产量突变型的突变机制是很复杂 的，产量的提高也是逐步积累的。产量突变型实际上有两种 类型：一类是某代谢产物比原始菌株有明显提高的，可称为 “正突变”；另一类是产量比其亲本有所降低，即称为“负 核微生物的细胞核中，DNA与蛋白质结合在一起形 成染色体，外包裹一层核膜，从而构成的在光学显微镜下清 晰可见的完整细胞核。如霉菌、酵母菌、藻类和原生动物等。 而原核微生物的细胞核无核膜，DNA在细胞内以核质体的形 式存在。如细菌、放线菌和蓝细菌等，也有人把没有细胞结 构的病毒称为原核微生物。
微生物遗传与菌种选育
图5-1 肺炎双球菌动物转化试验
微生物遗传与菌种选育
1944年Avery等人在Griffith工作的基础上，从加热致 死的S型肺炎双球菌中提取了荚膜多糖、蛋白质、RNA和DNA， 分别将它们和R型活菌混合，在动物体外进行培养，观察哪 种物质变化能引起转化作用。结果发现只有DNA能起这种作 用，而经DNA酶处理后，转化现象消失（图5-2）。
（1）营养缺陷型 指微生物经基因突变引起的代谢障碍 而必须添加某种营养物质才能正常生长的突变型。这种突变 型在科研和生产中具有重要的应用价值。
微生物遗传与菌种选育
（2）条件致死突变型 指微生物经基因突变后，在某一 条件下呈现致死效应，而在另一种条件下却不表现致死效应 的突变型。如温度敏感突变型。
微生物诱变育种
诱变育种：是以人工手段诱发微生物基因突变，改变其遗传 结构和功能，从多种多样的突变体中筛选出产量高、性状优 良的突变株， 并设计出适合该突变株最佳的培养基和条件， 使其在最适的工艺条件下最有效地合成产物。 分三个阶段：菌种基因型改变， 突变体筛选，产量评估 基因突变是微生物变异的主要源泉，人工诱变是加速基因突 变的重要手段。诱变育种有以下几个优点：速度快、收效大、 方法简单。
15
17
18
19
20
21
21
生长因子的配制方法： 把同一组的氨基酸粉末混合置于洁净的瓶中，加入灭菌的 蒸馏水，充分溶解，置冰箱保存。 配制浓度：用于放线菌测定的氨基酸约1mg／ml 用于霉菌测定的约10mg／ml 维生素一般0.1mg／ml 生物素、维生素B12约0.01mg／ml 测定方法：缺陷型菌株和基本培养基混合制成平板，把 6 组生长因子直接点加于同一琼脂平板上，或用滤纸片沾取 后覆于琼脂平板上，培养后，观察哪一组或哪两个组区产 生混浊生长圈，即可确定该菌株缺陷的生长因子。
①
天冬氨酰磷酸
天冬氨酸-β-半醛 ASA ② ③ 二氨基庚二酸 DAP 高丝氨酸 Hse
④
高丝氨酸 磷酸 苏氨酸 Thr
⑤
O-琥珀酸 高丝氨酸
赖氨酸
甲硫氨酸 Met
反馈抑制
异亮氨酸 Ile
优先合成
Asp
ASA DDP DAP Lys
Hse Met
Thr Ile
谷氨酸棒状菌、黄色短杆菌
Asp ASA DDP DAP Lys Hse Met Thr Ile Asp ASA DDP DAP Lys Hse Met Thr Ile
挑菌落
初筛 1瓶/株
微生物诱变育种
微生物诱变育种：生命的奇妙微生物是我们身边最小的生命体，很多时候我们并不能直接感知它们的存在。
然而，它们却能通过一种特殊的方式——诱变（Mutation）——影响着我们生活中的各种生物群体，包括人类、动植物等等。
今天，我们就来谈谈这个新颖而神秘的话题。
什么是？简单来说，指的就是利用微生物对某种生物进行诱变，从而改变它的基因表达，产生新品种、新性状的一种育种方法。
这个方法的基本原理是：用化学或其他手段让微生物基因发生突变，再通过微生物对某种有用的基因进行筛选，最终通过繁殖来获得新生物种。
诱变是什么？这里我们需要先了解诱变的概念。
诱变是指基因发生变异，导致基因型和表型的改变，是一种与遗传和进化有关的生物现象。
地球上存在着各种各样的微生物，它们在不同的环境和生长条件下会产生大量的基因突变。
这些基因突变可能是随机的或者是特定的，在这个过程中，新的基因型可能获得某些新的性状，这样的性状可能比它们的亲代更有生存优势。
为什么是一种前景广阔的育种方法？之所以前途广阔，是因为它具有以下几个优点：首先，基因突变是自然而然的，而方法则是针对性地诱导微生物进行突变。
这一方法大大缩短了新品种的选育时间和成本。
其次，这种方法不涉及基因编辑技术和转基因技术。
这一点非常重要，因为基因编辑技术和转基因技术可能会对人类和环境造成潜在的风险。
最后，方法具有高效、广泛适用性等诸多优点。
由于微生物的数量庞大，不同的微生物可以用于诱变不同的生物，且微生物在实验中具有高容错性。
在实践中有哪些成功案例？在实践中已经有了很多成功案例。
比如，在植物育种方面，通过微生物诱变，我们可以获得既耐旱又耐病的新品种；在饲料育种方面，我们可以获得既营养丰富又易于消化的新饲料等等。
的应用还不止于此，例如医疗领域，我们可以通过微生物诱变来研制更加安全、有效的药物；在水产养殖中，通过微生物诱变可以获得更加健康和肥壮的水生动物。
结语是生命科学领域的一种创新、前沿的研究方向。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
2. 菌丝过滤法 真菌和放线菌等丝状菌的野生型孢子在基本培ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ基中能萌 发长成菌丝，而营养缺陷型的孢子则不能萌发。 把诱变处理后的孢子移入到基本培养液中，振荡培养10h左 右，使野生型孢子萌发的菌丝刚刚肉眼可见，用灭菌的脱 脂棉、滤纸或玻璃漏斗除去菌丝。继续培养，每隔3-4h过 滤一次，重复3-4次，最大限度地除去野生型细胞。然后稀 释，涂皿分离。
置于检定板上
挑取5-10%透明圈、呈色圈、抑菌圈大的菌落
初筛
选30-50个菌株
复筛
选3-5株（提供第三代诱变出发菌株）
青霉菌的选育
2 U/ml
85000 U/ml
第二节 营养缺陷型菌株的筛选
一、营养缺陷型菌株的分离和筛选
一般包括：诱发突变、淘汰野生型菌株、检出缺陷型、鉴别 缺陷种类等4个步骤。
（一）营养缺陷型的诱发
二、营养缺陷型突变株的应用 1. 生产上：微生物育种，协助解除代谢反馈调控机制，达到 大量积累终产物的目的 天冬氨酸-β-半醛 二氨基庚二酸 赖氨酸
高丝氨酸
苏氨酸
甲硫氨酸
2. 作为杂交育种、重组育种的遗传标记
3. 遗传学研究中，转化、转导、原生质体融合、质粒和转座 子研究中的标记。
天冬氨酸 Asp
挑菌落
初筛 1瓶/株
挑50株复筛
3-5株（提供第三代诱变出发菌株）
简便筛选程序
第一代：出发菌株
诱变
分离到平皿上 打琼脂块挑菌落1000-3000 块
置于检定板上
挑取5-10%透明圈、呈色圈、抑菌圈大的菌落
初筛
选30-50个菌株
复筛
选3-5株（提供第二代诱变出发菌株）
第二代：出发菌株4株
诱变
分离到平皿上 打琼脂块挑菌落1000-3000 块
1. 两个以上因子同时处理
2. 不同诱变剂交替处理 3. 同一诱变剂连续重复使用 4. 紫外线光复活交替处理
五、突变体的分离和筛选
随机突变，定向筛选。 筛选的条件决定了选育的方向，设计一个好的筛 选方案是诱变育种的重要前提。
出发菌株
诱变
绝大多数个体死亡 多数未变 多数负变
少数存活 少数突变 少数正变 少数变幅大
连续诱变育种过程中如何选择出发菌株? 突变株的产量是数量遗传，只能逐步累加，一次性大幅度提 高发酵水平不太容易。 在选择出发菌株时，应挑选每代诱变处理后均有一些表型上 改变的菌株，如发酵单位有一定程度的提高、形态上发生过 一次变异或产生过回复突变的菌株等，以利于突变率的增加
灰黄霉素高产菌D-756诱变系谱菌株表型变异与产量递增的关系
理想的工业生产菌种必须具备： 1. 遗传性状稳定 2. 纯净无污染 3. 繁殖力强、生长速度快、短时间内能产生所需产物 4. 能诱变产生遗传性变异 5. 具有产量高、收得率高
第一节 诱变育种的步骤
• 出发菌株的选择
• 单孢子（单细胞）悬液的制备
• 诱变剂及诱变剂量的选择 • 诱变处理方法 • 高产菌株的分离
青霉素淘汰细菌野生型细菌的步骤： 1. 诱变后的菌体用完全培养液振荡培养2-3代，以结束表 型延迟现象 2. 进行离心、洗涤，转移到基本培养基中进行饥饿培养46h 3. 转移到含无机氮的培养基中培养3-4h，加入一定浓度的 青霉素 4. 经涂布培养后，统计完全培养基和基本培养基上菌落的 差数，确定产生最多缺陷型的青霉素溶度
采用影印法检出霉菌营养缺陷型时，要注意两点： 1. 防止菌落扩散和蔓延 可以在培养基中加入0.5％左右的脱氧胆酸钠，或在基本 培养基中用山梨糖作为碳源，再加入适量蔗糖使菌落长得 小而紧密。 2. 克服孢子扩散而带来不纯现象
在完全培养基上的菌落尚未形成孢子之前，用一张灭 菌的薄纸覆盖琼脂平板上，待菌落的菌丝长到纸上后，把 纸转移到基本培养基平板上。薄纸上的菌丝向基本培养基 表面生长，便在相应位置上长出菌落。
要鉴定单缺氨基酸或维生素的营养缺陷型，较为简便的方 法是分组测定法。把21种氨基酸，组合6组，每6种不同氨 基酸归为一组。
组别 一 二 三 四 1 2 3 4 7 7 8 9 组合生长因子 8 12 12 13 9 13 16 16 10 14 17 19 11 15 18 20
五
六
5
6
10
11
14
15
17
18
19
20
21
21
生长因子的配制方法： 把同一组的氨基酸粉末混合置于洁净的瓶中，加入灭菌的 蒸馏水，充分溶解，置冰箱保存。 配制浓度：用于放线菌测定的氨基酸约1mg／ml 用于霉菌测定的约10mg／ml 维生素一般0.1mg／ml 生物素、维生素B12约0.01mg／ml 测定方法：缺陷型菌株和基本培养基混合制成平板，把 6 组生长因子直接点加于同一琼脂平板上，或用滤纸片沾取 后覆于琼脂平板上，培养后，观察哪一组或哪两个组区产 生混浊生长圈，即可确定该菌株缺陷的生长因子。
3．高温差别杀菌法
利用芽孢菌类的芽孢和营养体对热敏感性的差异。 在基本培养液中，野生型芽孢可以萌发，而营养缺陷型 芽孢不能萌发。此时将培养物加热到80℃，维持一定时间， 野生型细胞大部分被杀死，缺陷型则得以保留，起到了浓 缩作用。
(三) 营养缺陷型的检出 1. 点植对照法
CM
MM
CM
2. 影印法
第四章 微生物诱变育种
诱变育种：是以人工手段诱发微生物基因突变，改变其遗传 结构和功能，从多种多样的突变体中筛选出产量高、性状优 良的突变株， 并设计出适合该突变株最佳的培养基和条件， 使其在最适的工艺条件下最有效地合成产物。 分三个阶段：菌种基因型改变， 突变体筛选，产量评估 基因突变是微生物变异的主要源泉，人工诱变是加速基因突 变的重要手段。诱变育种有以下几个优点：速度快、收效大、 方法简单。
3. 夹层法
4. 限量补充培养法
该法有两种情况，如果试验的目的仅是检出营养缺陷型 菌株，则其方法是将富集培养后的细胞接种到含有0.01％ 蛋白胨的基本培养基上，培养后，野生型细胞迅速地长成 大菌落，在平皿底部作好颜色标记，而生长缓慢的小菌落 可能是缺陷型，此称限量培养。
(四) 营养缺陷型的鉴定
一、出发菌株
对出发菌株的要求： 1. 对诱变因素敏感，变异幅度大，正突变率高 2. 具有一定生产能力 3. 具有有利性状，如生长速度快、营养要求低以及产孢子 早而多的菌株
4. 有时可考虑选择已发生其他变异的菌株作为出发菌株。 5. 采用一类被称为“增变菌株”的变异菌株，它们对诱变 剂的敏感性比原始菌株大为提高，更适宜作为出发菌株。 6. 在选择产核苷酸或氨基酸的出发菌株时，应考虑能累积 少量所需产物或其前体的菌株; 而在选择产抗生素的出发 菌株时，最好选择已通过几次诱变并发现每次的效价都 有一定程度提高的菌株作为出发菌株。
Leu
DAP Lys
乳糖发酵短杆菌
大肠杆菌
本章思考题：
1. 何谓诱变育种？试述诱变育种在发酵工业中的作用和地位 2. 在发酵工业生产中，理想的生产菌种应具备哪些性状？ 3. 在诱变育种时，出发菌株如何选择？对菌悬液有何要求？ 4. 针对不同微生物，如何选择诱变剂和诱变剂量？ 5. 筛选产量突变株时，应考虑哪些基本环节？ 6. 试述筛选产量突变株的简便程序。 7. 营养缺陷型菌株的分离和筛选有哪些步骤？ 8. 淘汰野生型菌株的方法有哪些？分别简述其原理？ 9. 试述营养缺陷型检出和生长谱鉴定的方法？ 10. 设计通过UV诱变大肠杆菌而得到组氨酸营养缺陷型突变 株的实验程序或方案。
3. 制备菌悬液通常采用生理盐水。如果用化学诱变剂处理 时，应采用相应的缓冲液配制，以防处理过程中pH变化 而影响诱变效果。
三、诱变剂及诱变剂量的选择
1. 诱变剂种类选择
对遗传稳定的出发菌株，最好采用以前未使用过的、突 变谱较宽的、诱变率高的强诱变剂。
对遗传不稳定的出发菌株，采用温和诱变剂。 对诱变史较长的高产菌株，如多次使用某一诱变剂，可 能出现“钝化”现象，此时则需改用另外的诱变剂。
营养缺陷型的诱变方法和所用的诱变因子与普通诱变育种 基本相同，只是由于营养缺陷型属于单一基因突变，各种诱 变剂的功能不同，有的不宜作为营养缺陷型诱变剂。
（二）淘汰野生型菌株 常用的方法有抗生素法和菌丝过滤法。
1. 抗生素法 常用于细菌和酵母菌营养缺陷型菌株的富集，前者用青 霉素法，后者用制霉菌素法。
菌号 4541
诱变代数 1
菌落大小 /cm 1.3 0.8
菌落表面 结构 平滑疏松 平滑紧密
菌落颜色 可溶性色 变株效价 素 提高/% 龟背灰绿 赭石 白 火泥棕 100 2011
71046 10
B-53
C-04
11
0.6
0.4
平滑紧密
平滑紧密 平滑紧密
白
白 白
海螺橙
鱼鳃红
2642
6911
自然分离后 0.5
通常分别用以下物质来代表氨基酸、维生素、核酸碱基： ①氨基酸混合物、酪素水解物或蛋白胨，代表氨基酸类。 ②酵母浸出液，其中氨基酸、维生素、嘌呤、嘧啶均具有。 ③维生素混合物，代表维生素类。 ④核酸碱基混合液或酵母核酸(0.1％碱水解物)，代表嘌呤、嘧啶类。
(1)缺陷型类别的测定
先选择缺陷型菌株所需用的类别代表物质：
青霉素法的原理为：细菌细胞壁的主要成分为肽聚糖类， 而青霉素能抑制细胞壁肽聚糖链之间的交链，阻止合成完 整的细胞壁。处在生长繁殖过程的细菌对青霉素十分敏感， 因而被抑制或杀死，但不能抑制或杀死处于休止状态的细 菌。 制霉菌素法原理：制霉菌素作用于真菌细胞膜上的甾醇， 引起细胞膜的损伤，杀死生长繁殖过程的真菌，起到富集 营养缺陷型菌株的作用。
①
天冬氨酰磷酸
天冬氨酸-β-半醛 ASA ② ③ 二氨基庚二酸 DAP 高丝氨酸 Hse
④
高丝氨酸 磷酸 苏氨酸 Thr
⑤