hzau微生物遗传第六章质粒

革兰氏阴性细菌中多数质粒是 以θ型方式复制，R1、R100等 是单向复制，F、R6k等是双 向复制类型。
在革兰氏阳性细菌 中大多数质粒是以 滚环方式复制。
2. 复制起点(ori)区的功能 复制起点是一段特定的DNA序列，长约几百碱基对，在其相 关的调控元件中含有由质粒或宿主染色体编码的、参与DNA 合成起始调控因子的结合位点。 ori区域常决定了质粒的许多特性，如质粒的寄主范围和质粒 的拷贝数。
第二节 质粒的遗传特征
一、 质粒的大小和拷贝数 质粒的大小：一般在1-200kb，最大的可达1400kb(如苜蓿 根瘤菌质粒pRm141a)。 质粒拷贝数是确定某种质粒特性的一个重要参数，从中也 可获得其复制本质的基本信息。一般而言，质粒的拷贝数 与其分子质量成反比关系，分子质量大的拷贝数低，分子 质量小的拷贝数高。
ColIb-P9, R144, R483, R64, R621a
R69, R466b R46, R15, N3, pKM101 R16, R723
RP1, RP4, R68, R751, R690, RK2
RSF1010, pKT212, pKT230, pGSS
R7K, R388, pSA747 R6K
pRK2013/E.coli
根瘤菌7653R-1（Nod-） 根瘤菌7653R-1（pLAFR1基因文库） 紫云英植株幼苗
根瘤
分离根瘤菌
分离重组质粒
八、质粒的检测
1. 质粒的消除和获得 2. 质粒的提取和检测 琼脂糖凝胶电泳 氯化铯-溴化乙锭密度梯度离心 电镜观察
本章思考题
1、试述质粒在现代生物学研究和应用中的作用和意义？ 2、何谓严谨型质粒、松弛型质粒？划分依据是什么？ 3、质粒宿主范围是由哪些因素决定的？为什么？
第六章
质
粒
质粒：是指存在于细菌、真菌等微生物细胞中、独立于染 色体外、能进行自我复制的遗传因子。 a、可以整合到染色体上，又可以游离于染色体外（附加体） b、质粒通常是共价、闭合、环状双链DNA(covalent closed circular DNA，简称cccDNA)， c、分子大小范围从l kb左右到1000 kb。
二、 质粒编码的遗传表型
大多数的质粒均控制着宿主细胞的一种或几种特殊性，即 具有一定的表型，质粒可依其表型的不同主要划分为以下 几种类型: 1. 2. 3. 4. 5. 6. 致育质粒 抗药性质粒 产生毒素的质粒 降解质粒 致病性质粒 共生固氮质粒
R质粒
这类质粒(R质粒)能 使宿主微生物对抗生 素、化学药物或重金 属离子等杀菌剂表现 出抗性。
质粒可根据其拷贝数分为严谨型质粒（Stringent plasmid）和 松弛型质粒（Relaxed plasmid）。 质粒在细胞内复制时受到控制而与染色体复制同步进行，被称 为严紧型质粒。其拷贝数也低，通常只有1-3个拷贝。如F质粒。
另一类质粒的复制与染色体复制不同步，称为松驰型质粒。通 常每个细胞含有10-100个拷贝，属于高拷贝质粒。如分子量小 的CoLEl质粒。
细菌种类
质粒不相容群
Байду номын сангаас
革兰氏阴性细菌
革兰氏阳性细菌
IncFⅠ IncFⅡ IncFⅢ IncFⅣ IncA IncC IncH IncI IncM IncN IncO IncP IncQ IncW IncX pT181
pUB110 pSN2
代表性质粒 F, R386, R455, ColV R1, R100 Col1B-K98 R124 RA1 R40a, R55 R27, R726
几种不同质粒的转移性能
质粒 ColE1 ColE2 ColE3 拷贝数 10-18 10-18 10-18 转移性 不能 不能 不能 质粒 R6k RP4 pBR322 拷贝数 1-2 4-7 约20 转移性 能 能 不能
F 因子
R100
1-2
1-2
能
能
pBR325
约20
不能
1. 自主转移质粒的特点 已 知 大 肠杆 菌 的 F质 粒 、 R1、 R100、 ColV、 Collb-P9、 R6k、RP4等均属于自主转移质粒，它们是低拷贝的大质粒， 其中较小的R6k质粒也有38kb。 许多G-细菌中的自主转移质粒需要大于30kb的DNA来编码 与接合转移有关的蛋白质，如F质粒的转移操纵子(tra)就包 含23个基因，大小为33 kb。 tra基因和oriT在质粒自主转移过程中起着重要作用，所以 大多数自主转移质粒都有tra基因和oriT位点。
六、质粒的转移性
质粒分为转移性和非转移性两大类型 质粒转移性：是指质粒能自动地从一个细胞转移到另一个 细胞，甚至还能带动供体细胞的染色体DNA向受体细胞转 移，这类质粒常常被叫做自主转移质粒(self-transmissible plasmid)。 质粒在细菌间的转移，需要供体和受体细胞间的直接接触 才能进行，即接合作用(conjugation)，这类质粒又被称接合 质粒(conjugative plasmid)。 有些质粒虽然不能自主转移，但能被其他一些自主转移质 粒所转移，这类质粒又被叫做可移动质粒(mobilizable plasmid)。
四、不相容性和质粒的类群
质粒不相容性：是指亲缘关系相近的两种质粒，在非选择性条 件下常不能稳定地存在于同一个细胞中，经过若干代的培养， 只含有同一种质粒的细胞越来越多，而含有两种质粒的细胞相 对减少。这种现象称为质粒的不相容性（incompatibility）。 一般来说，同一类型的质粒是不相容的，而不同类型的质粒则 是相容性的。
几种常见质粒载体所携带的复制子 质 粒 复 制 子
pMB1 pMB1 p15A pSC101 ColE1
拷 贝 数
15-20 500-700 10-12 ∽5 15-20
pBR322及其衍生质粒 pUC系列质粒 pACYC及其衍生质粒 pSC101及其衍生质粒 ColE1
1. 质粒复制的方式
质粒的复制主要是通过θ型复 制和滚环复制两种方式之一进 行的，其中以θ型复制为主。 在θ型复制中，有单向复制和 双向复制两种类型。
pT181, pC221, pS194, pC223, pUB112, pE194
pBC110, pBC16 pSN2, pE12, pIM13
五、质粒的稳定性 (细胞分裂中的质粒分配) 要使质粒能够保持稳定的遗传，至少需要满足下面 两个方面的条件： 1. 每个世代每个质粒平均都必须至少发生一次复制； 2. 当细胞分裂时，复制产生的质粒拷贝必须平均分配 到两个子细胞中去。 在细胞分裂过程中，质粒分配到子细胞的途径可分为： 随机分配(random distribution) 主动分配(active distribution)
4、简述质粒不相容性的作用机理？
5、质粒稳定性遗传，至少需要满足何种条件？ 6、在细胞分裂过程中，质粒分配到子细胞中去的途径有哪些？ 7、何谓自主转移质粒？在G-细菌中，自主转移质粒有何特征？ 8、何谓诱动转移质粒？绘图说明F质粒诱动ColE1质粒转移的原理？ 9、如何判断或鉴定细菌中质粒的存在？
1. IncP质粒的特征 IncP组的质粒的寄主较广。 IncP质粒自身或带动其他质粒能从大肠杆菌转移到几乎所 有的G-细菌中，有研究表明IncP质粒还能接合转移到G+细 菌、酵母、植物细胞中。 IncP质粒虽然能通过接合作用转移到酵母、植物等这些寄 主中，但质粒却不能在这些寄主中复制，属于转移寄主。
F质粒诱动ColEl转移的模型图
不能转移
F- oriT+
tra产物 oriT
F质粒
性菌毛 转移
F+ tra+ oriT+
不能转移 F+ tra -
不能转移
F+ tra+ oriT-
G+细菌如链霉菌中的自主转移质粒，除SCPl是巨大质粒外， 很多都是10kb左右的小质粒，而与转移有关的区域只有 2kb左右。
2. 随机分配机制(random distribution)
随机分配：是指在细胞分裂过程中质粒拷贝数在两个子细 胞之间是随机分配的。在一般情况下，通过随机分配质粒 也能够得到稳定的遗传，但在分裂中也会出现无质粒的子 细胞。
但在某些情况下，尤其是在recA+ 的宿主细胞中，ColE1 常能彼此重组而形成多聚体(multimer)，从而使单个细胞 内质粒的拷贝数减少，并增加产生无质粒细胞的可能性。 而ColEl质粒含有不依赖于recA的cer基因，负责多聚体的 解聚作用，使之重新转变为单体质粒以保证质粒在细胞 分裂时的稳定性。
R100
降解质粒
萘
乙醛 丙酮酸盐 水扬酸盐
根癌农杆菌Ti质粒
Opines:冠樱碱 Octopine（章鱼碱） Nopaline（胭脂碱）
三、 质粒的复制
细菌染色体是一个复制子，每一个质粒也是一个复制子。 复制起点是复制于起始复制的部位，作为一个复制子，至 少需要有一个复制起点，即ori位点。大肠杆菌染色体的复 制起点称为oriC，质粒的复制起点叫做oriV。
第一节
质粒的发现和命名
一、质粒的发现 大肠杆菌的F因子是第一个被发现(1946年)的细菌质粒，它 的发现对细菌遗传学的发展产生了深远的影响。
日本学者(1957年)报道了志贺菌(Shigella)中质粒介导抗生 素抗性的转移现象。
在以后的20多年中，陆续发现各种细菌携带质粒，且它们 的表型特征已远远超过了致育性和药物抗性的范围。
自主转移质粒的大小差异可能是因为它们的转移机制不同， G+细菌中质粒的转移不需要性菌毛，因此质粒的容量就较 小。
七、IncP组质粒的特征和接合转移
广寄主范围质粒：指质粒能通过接合转作用转移到很多不 同种甚至不同属的寄主内，并能稳定地存在于这些寄主细 胞内。 IncP、IncN、IncQ、IncW组的质粒属于广寄主范围质粒 (broad host range plasmid)。
二、质粒的命名原则 1976年Novick等提出一个可为质粒研究者普遍接受和遵循的 命名原则： 1. 质粒的名称一般由几个英文字母及编号组成，第一个字母 一律用小写p表示，后两个字母应大写，可以采用发现者 人名、实验室名称、表型性状或其他特征的英文缩写。 2. 编号为阿拉伯数字，用于区分属于同一类型的不同质粒， 如pUC18和pUC19, pBR322等。
GGTCTGATTATTAGTCTGGGACCACGGTCCCACTCGTATCGTC CCAGACTAATAATCAGACCCTGGTGCCAGGGTGAGCATAGCAG
有一对7bp的反向重复序列
-35
-10
SD
12个43bp的正向重复序列
sopA和sopB反 sopA 式作用基因
sopC:顺式作用位点
2. 接合转移质粒的应用 1. 构建广寄主范围的质粒载体 根据自主转移质粒能自主转移及其能带动可移动质粒的 转移这两个特征而设计的。
2. 构建诱动转移的质粒载体进行功能互补
EcoR1
Tet Tet
pLAFR1 21.6kb
(pRK290+COS) oriT
COS
Cosmid Vector
pLAFR1基因文库/E.coli
1. 主动分配的机理
低拷贝质粒的稳定性是通过质粒编码的基因产物来实现 的，如质粒编码的致死蛋白来抑制不含质粒的子细胞。 另外，质粒结构中还存在编码主动分配体系的par区。 par区叫做分配区(partition region)或分配座位(partition locus)：是指在细胞分裂过程中使质粒拷贝数均等的分配 到子细胞中的质粒DNA序列。质粒的复制与分配是分开 独立进行的，而且par区还会使无亲缘关系的其他质粒保 持稳定。
sopB
sopC
SopA
SopB
质粒
细菌质粒DNA的分配模型图
复制
分配复合体 复制体 质粒分配
细胞分裂
如何保证每个子代中都有F质粒的存在？ 主要由F质粒基因组中控制寄主致死功能的基因ccdA和 ccdB负责。在含质粒的细胞中，CcdA蛋白作为解毒剂专 门与毒剂CcdB蛋白结合，并使之失效。 在新产生的无质粒的子细胞中，开始的时候是含有CcdA 和CcdB这两种蛋白质的 。 但由于毒剂 CcdB和解毒剂 CcdA具有不同的稳定性，CcdA蛋白质不稳定，易被蛋 白水解酶(protease)降解，而较稳定的CcdB蛋白质便可 行使其对寄主细胞的致死作用。