原生质体融合技术及其在微生物遗传育种上的应用

进行融合子的筛选 。 已经报道 的融合子选择 方法 有 :利用营养缺陷型互补选择 , 利用抗性互补选择 ,
来的研究表明 :突变 、外源 DNA 片断的插入以及种 内或种间的杂交都可能使某些链霉菌产生原来没有
应用灭活原生质体作为标记进行选择 , 利用荧光染 色选择 , 利用某些特殊生理特征作为标记选择 。 在
Key words :pr oto plast ;pro toplast fusion ;g ene tic and breeding
原生质体融合(prot oplast fusio n)是细 胞融合 (cell fusio n)的一个组成部分 。 由于对植物细胞和 微生物细胞进行细胞融合时 , 必须除去细胞壁 , 而剩
[ 收稿日期] 2006-12-22 ;2007-02-14 修回
[ 作者简介] 丁朋晓(1980 - ), 女 , 在读硕士, 研究方向 :环境微生物学 。 ＊通讯作者 :杨季芳 , 男 , 研究员 , E-mai l :jf kw lq @163 .com
· 140 · 贵 州 农 业 科 学
Abstract :T he technique of pro to plast fusio n with advantages of transmitting a la rge quantity o f g enetic info rmatio n,
having little influence f rom blo od relationship , selecting pare nt str ains on pur po se fo r breeding the ideal fusio n str ains a nd operating easily , has the w ide applica tion pro spect in microbial genetic and breeding .T he pape r summarize s the prepa ratio n o f proto plast and its influencing facto rs , the accelerating method o f pro to plast fusion , the selectio n o f fusants and the application of pro toplast fusion in micro bial str ains breeding , etc .
育种工作中可根据实验目的和 微生物不同加 以选 择。
的新物质 。 4 .4 优化菌发酵特性
许多种微生物能在 45 ～ 65 ℃生存 , 有的甚至更 高 。有种耐热菌可在 98 ℃温泉 中生长繁殖 。 关于
4 原生质体融合技术在微生物菌种选育中 的应用[ 4 , 5 , 12]
微生物耐热性的机理研究还不是很清楚 , 但其耐热 性却有很重要的应用价值 。 如在酒精酿造中 , 酿酒
在抗生素的研究中 , 原生质体融合技术可用于 提高抗生素的产量 。 但是 , 种间融合获得的融合子
菌株往往会产生一些不希望有的组分 。 为了解决这 一问题 , 张瑾阳等[ 20] 在进行去甲基金霉素产生菌与 金霉素产生菌原生质体融合以选育产去甲基金霉素
的菌株时 , 对金霉素产生菌的原生质体进行热灭活 , 减少了既产生金霉素和四环素又产生去甲基产物的
通过原生质体融合技术使两个菌株的遗传物质
得到重组 , 从而获得兼具两个亲本优良性状的新菌 株 。如苏云金 杆菌以色列变种(Baci I lus thuri ngiensi s subsp .i sraelensi s)产生的杀虫毒素主要杀死 双翅目昆虫 , 而苏云金杆菌库斯塔基变种(B aci l lus thuringiensi s subsp .k urstaki H D-I)产生的毒素蛋 白主要杀鳞翅目昆虫 。 将这两个菌株的原生质体进
方法制备的原生质体效果差 , 活性低 , 仅适用于某些 特定菌株 , 因此 , 并未得到推广 。 在实际工作中 , 最
有效和最常用的是酶法 。 该法时间短 , 效果好 。 到 目前为止 , 适合于原生质体制备的各种酶类已经得 到开发和应用[ 6] 。在酶法中使用的酶主要为蜗牛酶 或溶菌酶 , 至于具体使用哪一种酶要根据所研究的 微生物的种类而定 。
DIN G Pengx iao1 , 2 , YA N G Jifang2 ＊ , X IE H e1
(1 .College of Lif e Science , Guizhou Universit y , Guiyang , Guizhou 550025;2 .Colloge of Biological and Environment Science , Wanli Universit y , Ningbo, Zhe j iang 315100 , China)
贵州农业科学 2007 , 35(3):139～ 141 G uizho u A g ricultural Science s
[ 文章编号] 1001-3601(2007)03-0159-0139-03
原生质体融合技术及其在微生物遗传育种上的应用
丁 朋晓1 , 2 , 杨季芳2 ＊ , 谢 和1
由于在自然条件下 , 原生质体发生融合的频率 非常低 , 所以在实际育种过程中要采用一定的方法 进行人为地促融合 。当前常用的方法主要有 :化学 法 、物理法和生物法等 。 这几种方法各有其自身的 特点(表 1)。
3 原生质体融合子的筛选
获得了融合体之后 , 下一步的工作就是原生质 体融合子的筛选 。在融合体中除了重组体外 , 还有 异核体或部分结合子 、杂合二倍体或杂合系 , 这些都
融合子 。 结果在所得的融合子中 85 %以上 只产生 去甲基产物 , 从而提高了目的产物的相对产量 。
4 .3 获得新代谢产物的菌株 贺敏霞等[ 21] 通过诺卡氏菌原生质体融 合重组
研究发现 , 有 4 株融合子产生亲本没有的甾体转化
中间体 , 3 株融合子产生亲本没有的抗生物质 , 还得 到 1 株甾体转化活力明显高于亲本的融合子 。林荣 团等[ 22] 的研究更容易说明这个问题 。他们 以天然
2007 , 35 卷
表 1 原生质体融合的几种方法
方法 化学法
原理
优缺点
用化学融合剂 促进 原生 质 体融 合 。 常 用 化学 试 剂中 最 常用 的 就是 优点 :不需要特别的仪器设备 , 操作简便 。 缺点 :原生 质体聚 集成团的
PEG 结合高 Ca2 + 、pH 诱导法 。
大小不易控制 , 且 PEG 本身对原生质 体具有一 定的毒性 , 可 能影响原 生质体的再生 , 另外融合率不高 。
物理法
用物理的手段(如电场 、激光、超声波 、磁声等)使亲本 的原生质 体发生 融合 。 最常用的主要有 :电处理融合法 、激光诱导融合法以及在电融合 技术上改进的方法如磁-电融合法 、超声-电融合法及电-机械融合法等 。
优点 :电融合条件可控 , 融合率高 , 无毒 。 缺点 :设备条件 要求高 , 费用 较贵 。
另外 , 添加 0 .02 mo l/ L 镁离子或 0 .6m ol/ L 的钾粒 子 , 有利于原生质体的稳定 , 提高原生质体的产 量[ 1 0] 。
1 原生质体制备及其影响因素
2 原生质体融合的促融方法
微生物细胞一般是有细胞壁的 , 因此原生质体
融合的第一步就是制备原生质体 。 当前去除细胞壁 的方法主要有机械法 、非酶法和酶法 。 采用前两种
生物法
紫外灭活的病毒膜片能使细胞间产生凝聚和融合 。
病毒制备困难 , 操作复杂 , 实验重复性差 , 融合率 很低 。 适用 于动物细 胞融合 。
会在再生平板上形成菌落 。为了从融合后的细胞群 中选育目的杂种细胞 , 必须采用合适的筛选方法[ 11]
默基因(Si lent gene), 若能使这些基因得到表达 , 这 类微生物就有可能合成更多的次级代谢产物 。 近年
酵母于 40 ℃时产酒明显下降 , 为此必须消耗大量能
在工业微生物育种上 , 人们根据不同需求通过 原生质体融合技术培育出了高产 、优质 、抗逆性强等
的微生物菌种 。 4 .1 选育优良的菌种
原生质体融合广泛应用到酿酒酵母的改良 。 彭 帮柱等以酿酒酵母 1605 和苹果酒酵母 E2 为亲本 ,
原生质体融合是一项行之有效的微生物育种技术 。
影响原生质体形成的因素很多 , 不同的微生物
有其较为适当的形成条件 。 在菌龄的选择上 , 多采 用对数生长期或生长中后期的菌 , 这是因为 , 菌体的
不同生理状态直接影响到细胞壁的结构 , 对数生长 期细菌的细胞壁中肽聚糖含量最低 , 细胞壁对酶的
作用最敏感 , 但是对数生长早期的菌相对较为脆弱 , 受酶的过度作用会影响原生质体的再生率 。研究表
明 , 使用微生物产生的酶复合物或商品酶的混合液 比单独使用一种酶的效果好[ 7] 。 陈海昌等[ 8] 证明 ,
在一定范围内 , 酶作用的时间 、浓度都与原生质体的 形成率 成正 相关 , 而 与再生 率成 负相 关 。 林 红雨 等[ 9] 采用酶解 10mi n 后补加 ED T A , 改变酶解环境 中的离子强度和渗透压 , 可以提高原生质体形成率 。
(1 .贵州大学 生命科学学院 , 贵州 贵阳 550025 ;2 .浙江万里学院生物与环境学 院 , 浙江 宁波 315100)
[ 摘 要] 原生质体融合技术是微生物遗传育种上一项重要 技术 , 它具有遗传 信息传递 量大 , 不 受亲缘关 系的影 响 , 可 有
目的地选择亲株以选育理想的融合株 , 便于操作等优点 , 在遗传育种中具有 广阔的应用 前景 。 本文从 原生质体 的制备及其 影
无抗菌活性的链霉菌(S treptom yces liv idans)1326 与链霉菌 1254 营养缺陷型突变株进行种间原生质
源降低发酵液的温度 。 因此 , 将酿酒酵母 396(能利 用甘蔗糖蜜生产酒精)和假丝酵母 C6(45 ℃生长良 好)为亲本 , 进行原生质体融合筛选得到在 40 ℃培 养 条 件 下 原 料 利 用 率 为 94 .3 %、乙 醇 产 量 为 59 .7 g/ L的属间融合株 。 4 .5 改良菌种的遗传特性
余的部分称为原生质体(prot oplast), 所以植物和微 生物细胞的细胞融合实际上就是原生质体融合 。 原
生质体融合具有其独到的优势 。融合时细胞去除了 细胞壁 , 原生质体膜易于融合 , 没有极性 , 相互融合
的是整个胞质与细胞核 , 保持了遗传物质传递的完 整性 , 易于得到杂种 。 此项技术能把亲缘关系比较
响因子 、原生质体融合的促融方法 、原生质体融合子的筛选以及融合技术在微生物菌种选育中的应 用等方面进行了综述 。
[ 关键词] 原生质体 ;原生质体融合 ;遗传育种
[ 中图分类号] S933
[ 文献标识码] A
Application of the Protoplast Fusion Technique in Microbial Genetic and Breeding
远 , 甚至毫无关系的生物体细胞融合在一起 , 为远缘 杂交架起了桥梁 , 是改造细胞遗传物质的有力手段 ,
它不仅在于打破了有性杂交重组基因创造新种的界 限 , 更重要的是扩大了遗传物质的重组范围 。 科技 工作者[ 1 ～ 5] 经过大量的努力 , 利用原生质体融合技 术在微生物育种上取得了大量的成绩 。 事实证明 ,
通过原生质体融合 , 得到融合子 8 #菌株 , 具有产香 能力和发酵能力均强于双亲的优点[ 13] 。黎 永学等 以双歧杆菌和酿酒酵母为亲本进行融合 , 得到的融
合子具有双亲的生物学特性 , 为双歧杆菌生物学功 能的开发提供了新思路 、新途径[ 14] 。 王宪等[ 15] 利用
原生质体融合技术获得具有双亲杀虫谱的新菌株 。 诸如此类的报道国内外均有[ 15 ～ 18]Байду номын сангаас。 4 .2 提高菌株的代谢产物