原生质体融合技术及其在微生物遗传育种上的应用
原生质体融合技术简介
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中国科学院青岛生物能源与过程研究所
Qingdao Institute of Bioenergy and Bioprocess Technology
原生质体研究的发展
1838 1873 1896 1931 1954 1958 1970 1972 1972 1974 1976 1976 1977 1978 1981 1988 2002 Muller Lugmbuthl Unna Wathin Bnders et al Marston Power et al Carlson Ferenczy et al Michayluk Ferenczy et al Fodor et al Hopwood Gleba et al Menczel Kirimalra et al Stemmer et al 动物病理组织中发现多核细胞 天花病脓胞周围发现多核细胞 水痘侵害过的皮肤中发现多核细胞 麻疹病人扁桃腺中发现多核细胞 组织培养中发现麻疹病毒能诱导细胞用和成多核体 用副流感病毒诱发细胞融合 探索用硝酸钠诱导植物原生质体融合 用NaNO3进行了烟草种间原生质体融合 以白地霉营养缺陷型为材料经原生质体融合首次完成异核体形成 发现PEG是一种良好的聚合剂用于原生质体融合 是一种良好的聚合剂用于原生质体融合 发现 以曲霉 青霉营养缺陷型为材料经原生质体融合首次完成异核体形成 巨大芽孢杆菌内株间原生质体融合成功 链霉菌原生质融合并获融合重组子 用PEG+高pH-Ca2+研究原生质体融合 高 用高pH-Ca2++9℅DMSO与少量 与少量PEG获得较高的融合率 用高 与少量 获得较高的融合率 原生质体PEG融合获得黑曲霉二倍体柠檬酸高产菌株 融合获得黑曲霉二倍体柠檬酸高产菌株 原生质体 一种新的体内分子育种方法——全基因组改组技术 全基因组改组技术 一种新的体内分子育种方法
微生物工程思考题
微生物工程指导1、什么是微生物工程？它是由哪四大技术结合发展起来？(1)微生物工程：利用微生物的特定性状和功能，通过现代化工程技术生产有用物质或直接应用于工业化生产的技术体系。
(2)传统发酵，DNA重组，细胞融合，分子修饰与改造2、微生物反应过程的特点（与化学工程相比）(1)优点：（与化学工程相比）①生产过程通常在常温常压下进行，操作条件温和②原料以碳水化合物为主，不含有毒物质。
③能高度选择性地进行复杂化合物在特定部位反应，如氧化、还原、官能团导入等。
④生产产品的生物体本身也是发酵产物，富含维生素、蛋白质、酶等有用物质；⑤通过微生物菌种改良，能够利用原有设备使生产飞跃上升。
(2)发酵过程中尚存在的问题：①底物不能完全转化成目的产物，副产物的产生不可避免，因而造成提取和精制困难②微生物反应是活细胞的反应，产物的获得除受环境因素影响外，也受细胞内因素的影响，且菌体易发生变异。
③原料是农副产品，虽然价廉，但质量波动较大。
④生产前准备工作量大，花费高，相对化学反应而言，反应器效率低。
⑤发酵废水常具有较高的BOD 和COD，需处理后排放。
3、微生物工程的发展经历哪几个阶段？(1)传统的微生物发酵技术——天然发酵(2)第一代微生物发酵技术——纯培养技术(3)第二代（近代）微生物发酵技术——深层培养技术(4)第三代发酵技术——微生物工程4、微生物工程产品类型有哪些？(1)微生物菌体的发酵(2)微生物酶发酵(3)微生物代谢产物发酵(4)微生物的生物转化(5)微生物特殊机能的利用5、作为发酵工业用的微生物菌种应符合哪些要求？(1)能在廉价原料制成的培养基上迅速生长，并形成所需的代谢产物，产量高。
(2)可以在易于控制的培养条件下迅速生长和发酵，且所需酶活力高。
(3)根据代谢控制的要求，选择单产高的营养缺陷型突变株或调节突变株或野生菌株。
(4)选育抗噬菌体能力强的菌株，使其不易感染噬菌体(5)菌种纯，不易变异退化，以保证发酵生产和产品质量的稳定性(6)菌种不是病原菌，不产生有害的生物活性物质和毒素，以保证安全6、微生物工程工业生产水平取决于哪些因素？(1)生产菌种的性能(2)发酵和提取工艺条件(3)生产设备7、微生物菌种分离与筛选工作程序分哪几步？样品采集→增殖培养→纯种分离→生产性能测定8、微生物菌种选育的方法有哪些？(1)自然选育(2)诱变育种(3)杂交育种(有性、准性)(4)原生质体融合育种(5)基因工程育种9、菌种保藏方法中，常用于产孢子和芽孢的保藏的方法是哪一个？现逐渐被哪一种方法取代？沙土管保藏法，现被真空冷冻干燥法取代10、微生物酶活性调节的方式有哪些？(1)共价修饰(2)变(别)构效应(3)缔合与解离(4)竞争性抑制11、酶合成调节的类型有哪些？(1)诱导（2）阻遏<末端产物阻遏，分解代谢产物阻遏>12、了解酶合成调节的分子机制（乳糖操纵子和色氨酸操纵子）13、了解分支生物合成途径的调节类型(1)同工酶调节：某一分支途径中的第一步反应可由多种酶催化，但这些酶受不同的终产物的反馈调节.(2)协同反馈调节: 需有一种以上终产物的过量存在方有明显的效果。
食用菌原生质体融合育种技术简介
食用菌原生质体融合育种技术简介原生质体（protoplast）这个术语最早是由Hanstein 在1880年提出来的。
确切地说，食用菌原生质体是指细胞壁完全消除后余下的那部分包裹的裸露的细胞结构。
原生质体虽然失去了细胞壁存在时的原有细胞形态，变成了圆球体，但它仍然具有原生质膜和整体基因组，是一个具有生理功能的单位。
食用菌原生质体融合（protoplastfusion）是指通脱壁后的不同遗传类型的食用菌菌株原生质体，在融合剂的诱导下进行融合，最终达到部分或者整套基因组（核基因、线粒体基、胞质基因）的交换和重组，生产出新的食用菌品种和类型，也就是说，食用菌原生质体融合育种技术上是一种不通过有性生活史（sexualcycle）而达到遗传重组或有性杂交的育种手段。
近日，在佛山科技学院召开的“草菇原生质体融合育种研究”成果鉴定会上获悉，该院农学系利用现代生物工程原生质体融合育种技术，成功地选育出草菇新品种Ｖｐ—２、Ｖｐ—３。
专家们实地考察后认为，该研究成果数据可靠，技术新颖，品种表现良好，种性稳定，菌丝生长健壮，爬料速度快，抗杂能力强，子实体结实，基部紧凑，个体适中，兼备双亲优良性状，生物特性明显优于目前生产使用的当家品种。
鉴定专家一致认为，该研究成果居于国内领先水平。
据项目鉴定委员会主任、省微生物研究所研究员丘元盛介绍，该项目成果具有技术的前瞻性和研究的独创性：采用超声波处理结合溶壁酶酶解，很好地解决了草菇细胞壁裂解的难题，为原生质体融合育种提供了大量原生质体，完善了草菇原生质体制备和融合技术；创造性地利用不同草菇品种间存在拮抗作用进行融合子初筛，利用不同草菇种间分解脱脂牛奶、可溶性淀粉、聚半乳糖醛酸等物质的能力差异性，定量检测融合子与亲本间的酶分解能力，通过ＤＮＡ随机多态性差异检测进而确定融合子，技术操作新颖，为食用菌育种开辟新途径；开创性采用液氮研磨与溶壁酶酶解相结合提取草菇菌丝ＤＮＡ技术，获得高纯度遗传物质，圆满解决草菇等真菌ＤＮＡ提取过程中破壁困难和纯度不高等技术难题，实现现代分子生物学水平格测融合子的技术性飞跃。
原生质体融合技术及其在果酒酵母育种上的应用
第１第 期 ２０ ９ ０年９ ３ 月 卷
ｌ ６３ ＝＝ Ｉ
原生质体融合技术及其在 果酒酵母育种上的应用
陈娟 阚建全 杨蓉生 杜木英 ， ， ， （． １西南 民族 大学生命科学 与技术 学院 ， 四川 成都 ６０ ４ ； ． １０ １２西南大学食品科学学 院 ， 重庆 ４ ０ １ ） ０ ７ ５
原 生质体 融合技 术 （ｒ ｏ ｌ ｔｕｉ ） 称为 细胞 ｐｏ ｐ ｓｆｓ ｎ 又 ｔ ａ ｏ 融合技术 ， 是指用 酶法 去除细胞 壁 ， 制成 由原生质膜包 被 的原生质体 ， 然后采用 物理 、 学或生物学方 法诱 导 化
了细胞融 合技术 的发展 ，使该技 术跃上 了新 的阶段 。
摘 要 ： 原 生质 体 融 合技 术 的研 究 进展 进 行 概 括 ， 述 该 技 术 的 重 要 环 节 ， 对 论 包括 遗 传 标 记 选择 、 生 质 体 制 备 、 生 原 再
和融合 以及融合子的鉴定等。通过分析其在降酸、 增香 、 嗜杀活性和抗氧化性等优 良性状整合上 的研 究结果， 表明原
作 中 ， 大地 推动了微生物研究的进程 。 极 ２ 原 生质体 融合技术
生质体 ， 并提 出了原生质体 的概念 。Ｅ ｄ ｄｙ和 Ｅ ｍ ｒ ｎ ｍ ｅｓ ｏ
又 以酶法相 继 制备 出 了酵母 菌 和丝状 真 菌细胞 的原
生质体 ， 为微生物 的细胞融合开辟 了道路 。１７ ９ ４年 ， 加 拿大籍华人高 国楠发现 聚乙二醇（ Ｅ 在 ｃ 参与下 Ｐ Ｇ） ａ 能促进植 物细胞原 生质体融合 ， 这一发 现极 大地促进
时首次发现了细胞融合现象 。１６ 年 ， 本 的 Ｏ ａ ａ ９０ 日 ｋ ｄｔ
基因重组育种
• 1998 年陈五岭等又报道了激光诱导动物细胞融合。此外， 其融合率还受其它诸因素的影响。
毒性小，仪器昂贵，操作难度高，很难推广。
原生质体融合技术的步骤
• 离心分离，洗涤菌体 • 酶解脱壁 • 原生质体再生及剩余菌数的测定 • 制备的原生质体去除酶液 • 促融 • 融合子再生 • 融合子筛选
参与融合的亲株数并不限于一个，可以多至三个、 四个，这是一般常规杂交所达不到的。
（3）重组频率特别高，因为有聚乙二醇作助融剂。
（4）可以和其他育种方法相结合，把由其它方法得到 的优良性状通过原生质体融合再组合到一个单株中。
（5）可以用温度、药物、紫外线等处理、钝化亲株的 一方或双方，然后使之融合，再在再生菌落中筛选重组 子。这样往往可以提高筛选效率。
• 应用灭活原生质体作为遗传标记选择融合子
原生质体经紫外线照射、加热或经某些化学药剂的 处理，可使其丧失在再生培养基上再生的能力，而只能 作为遗传物质的供体。从而只根据另一亲株特性设计选 择条件而选择融合子。周东坡等通过紫外线照射灭活原 生质体融合选育了啤酒酵母新菌株。用0.11 %碘乙酸， 30 ℃处理产阮假丝酵母( Candida utilis ) 原生质体40min 后，与啤酒酵母( Saccharomyces cerevisiae) 的原生质体融 合，利用形态差异选择融合子。
选定几种有特定整合 位点的 Hfr 菌株，使 之与F–菌株进行接合，
并在不同时间使其中 断，最后，根据F–中 出现Hfr菌株中各种形
状的时间顺序（分
钟），可以绘出较为
完整的环状染色体图 （chromosome map）。
中 断 杂 交 试 验
位点特异性重组
微生物原生质体融合育种技术及其应用
微生物原生质体融合育种技术及其应用摘要：工业微生物菌种选育在发酵工业中占有重要地位。
微生物原生质体融合(microbialprotoplast fusion)技术具有重组频率高、受结合型或致育型限制小以及遗传物质传递完整等优点,是微生物育种最常用的方法之一。
结合相关研究进展,分析了原生质体融合技术的组成,包括制备、再生、融合的影响因素以及融合子的筛选方法,重点评述了原生质体融合技术应用在微生物育种中的最新进展,以及微生物原生质体融合技术的发展前景。
关键词：微生物原生质体融合遗传育种基因组重组引言：微生物菌种是发酵工业中的一个关键因素,它决定了发酵过程的成败及某一发酵产品是否具有工业化价值。
自然界中的原始菌株大多不具有很高的工业化价值,因此需要对菌株进行选育和改良,以提高产品的质量,降低成本。
原生质体融合技术是起源于20世纪60年代的一项重要的菌种改良技术,是将亲株细胞分别去除细胞壁后进行融合,经基因组间的交换重组,获得融合子的过程。
与其他育种技术相比,原生质体融合技术具有重组频率高、受结合型或致育型限制小以及遗传物质传递完整且不需要完全了解作用机制等优点,因而被国内外微生物育种学者广泛应用。
1974年,匈牙利的Ferenczy成功将白地霉(Geotrichum candidum)营养缺陷型突变株的原生质体进行融合,使原生质体融合技术首次应用于微生物中。
接下来的几十年,该技术的基本实验方法逐步完善,现已作为一项十分有用的技术广泛应用于工业微生物菌种选育中。
本文就原生质体融合技术的过程及其应用于微生物育种方面的最新进展做了简要综述,并分析了目前存在的问题及未来的发展方向。
1 资料和方法：1.1 资料来源由第一作者在CNKI进行检索。
网址：/。
英文资料的检索时间范围为2007/2012；中文资料的检索时间范围为2007/2012。
英文检索词为“protoplast fusion、research、progressions”；中文检索词为“原生质体融合、应用、研究进展”。
原生质体融合育种
原生质体融合育种摘要原生质体融合育种克服了远缘杂交不亲和的障碍，可以提高重组频率，使得遗传物质的交换、传递更完整，成为微生物育种的一种重要方式。
其过程包括原生质体制备和再生、原生质体融合以及融合体检出等步骤。
在每个步骤中均要考虑到其应注意的因素，从而提高原生质体育种的效率，达到快速育种的目的。
因原生质体融合育种的优势，其在多功能菌种选育、工程菌选育和工业生产育种等方面应用广泛。
关键词原生质体制备融合育种原生质体再生融合体检出引言传统的杂交育种具有一定的局限性，需要受到亲和力的影响，并且要求亲本有性的分化，而原生质体育种则克服了这些缺点。
当细菌细胞壁被剥离，剩下由原生质膜包围的原生质部分称为原生质体。
原生质体融合是指通过人为的方法，使遗传性状不同的两个细胞的原生质体进行融合，借以获得兼有双亲遗传性状的稳定重组子的过程。
[1]原生质体融合不受种属限制，能够完整的传递遗传物质，使得重组几率提高进而提高育种速度。
[1-2]育种步骤可分为五大步骤：直接亲本及其遗传标记的选择、双亲本原生质体制备和再生、亲本原生质体诱导融合、融合重组体分离、遗传标记分析和测定。
1.亲本遗传标记的选择进行原生质体融合的双亲本一般要携带遗传标记，以顺利地筛选到融合子。
常用营养缺陷型、抗性、荧光染色、温度敏感性、孢子颜色、菌落形态等作为标记。
其中营养缺陷型是常用而有效的选择手段。
[3]2.原生质体制备制备原生质体是融合育种的前提，为了制备原生质体，需要将包围细胞的细胞壁去除掉。
去壁的方法很多，主要有机械法、酶法和非酶法，现在使用较多的是酶法。
[4]2.1酶法制备原生质体的条件（1）菌体年龄微生物的生理状态决定了原生质体的形成，而菌龄明显影响了原生质体的形成率，菌龄过长不利于释放原生质体，过短则菌丝体容易破裂。
丝状真菌一般选择年轻的尖端生长点的菌丝；细菌与霉菌一般采用对数生长期，而放线菌以对数期到静止期的转换期为好。
[5]（2）稳定剂原生质体由于失去了细胞壁因此对环境十分敏感，渗透压尤为重要。
微生物原生质体融合育种技术及其应用与展望
融合的优势十分明显 ，当进行融合时，细胞壁 被去除后 ，原生质体的膜就变得极易融合，没
有极性 ，整个细胞质和细胞核发生相互融合 ，
１原生质体融合的程序
主要包括 ：ａ ． 原生质体的制备及再生 ；ｂ ． 对原生质体进行灭活 ；Ｃ ｏ 对原生质体 的纯化 ；
建筑与预算
ＣＯＮ ＳＴ ＲＵ ＣＴｌ ｏＮ Ａ ＮＤ ＢＵＤＧＥ Ｔ
Ｄ Ｏ Ｉ ： １ ０ ． １ ３ ９ ９ ３ ／ ｊ ． ｃ ｎ ｋ ｉ ． ｊ ｚ ｙ ｙ ｓ ． ２ ０ １ ７ ． １ ０ ． ０ ０ ８
２ ０ １ ７ 年第 １ ０ 期
微生物原生质体融合育种技术及其应用与展望
王佳蕊 ，魏
（ 沈阳建筑大学
炜
市政与环境工程学院 ，辽宁 沈 阳）
摘 要 ：细 胞融合 技术 ，其遗传信 息量大 ，且不 受亲缘关 系 的影 响 ，更 能将双 亲的优 良性状遗传 到 自 身 ，只需定 向筛选双亲遗传 性状的融合子 ， 操作 十分简单 ，因此拥有 了广 阔的应用 前景。在工业 、医 药 、农 业等诸多领域 中获得 了开创性的进展 ，不断 扩大其应用的领域 。这项技术 既对基 因的定位 、遗 传 的互补 、核质关 系 、基 因的调 控 、细胞的棉 衣 、疾病 的发 生 、废水 的处理 、膜蛋 白动力学 等领域 中提供了强有 力的处理手段 ，又在免疫 学 、发育 生物学 、遗传 学特别是克 隆抗体 、微生 物菌种选育 、 基 因图谱的绘 制等诸多方 面 ，都具有 重要的意义 。 本 文综述 了原生 质体 的融合程 序 ，及原 生质融合
差异小 ，而且菌丝的活力高 ， 形成原生质体便
变性 ，从而使酶活性受到影 响甚至是消失 ；而
生物高中生物选修1知识点总结
生物高中生物选修1知识点总结一、绪论1. 生物技术的定义与分类生物技术是指利用生物学原理和方法，对生物体及其组分进行操作、改造和利用的技术。
生物技术主要包括基因工程、细胞工程、发酵工程和酶工程等。
2. 生物技术发展简史生物技术的发展经历了传统生物技术和现代生物技术两个阶段。
传统生物技术主要包括酿造、发酵等；现代生物技术则以基因工程、细胞工程等为核心。
二、基因工程1. 基因工程的原理与方法基因工程是通过分子生物学的方法，将目的基因从一个生物体转移到另一个生物体中，使之产生新的遗传特性。
基因工程的基本步骤包括：目的基因的获取、基因载体的选择与构建、受体细胞的转化、转化细胞的筛选与鉴定。
2. 基因表达载体的构建基因表达载体是基因工程中用于携带目的基因并将其导入受体细胞的工具。
常用的基因表达载体有质粒、噬菌体、病毒等。
3. 基因工程的应用基因工程在农业、医药、环保等领域具有广泛的应用。
例如：转基因作物、转基因动物、基因治疗等。
三、细胞工程1. 细胞工程的基本技术细胞工程是指利用细胞生物学原理和方法，对细胞进行操作、改造和利用的技术。
细胞工程的基本技术包括：细胞培养、细胞融合、细胞拆合等。
2. 动物细胞工程动物细胞工程主要包括动物细胞培养、细胞融合、细胞拆合等技术。
动物细胞工程在制备单克隆抗体、生产疫苗等方面具有重要作用。
3. 植物细胞工程植物细胞工程主要包括植物组织培养、原生质体融合等技术。
植物细胞工程在植物繁殖、遗传改良等方面具有广泛应用。
四、发酵工程1. 发酵工程的原理发酵工程是利用微生物的代谢活性，在生物反应器中进行大规模生产的技术。
发酵工程的原理主要包括：微生物的代谢、发酵条件优化、生物反应器设计等。
2. 发酵过程的主要参数发酵过程中，需要关注的主要参数有：温度、pH、溶氧、搅拌速度、发酵液浓度等。
3. 发酵工程的应用发酵工程在食品、饮料、医药、环保等领域具有广泛应用。
例如：啤酒生产、抗生素生产、生物燃料生产等。
微生物遗传育种名词解释（二）
微⽣物遗传育种名词解释（⼆）1、⾃然选育：从⾃然界直接分离和筛选菌种或在⽣产中利⽤⾃发突变选育优良菌株。
2、诱变育种：对出发菌株进⾏诱变，然后运⽤合理的程序与⽅法筛选符合要求的优良菌株。
3、代谢调控育种：利⽤现有的代谢调控知识，筛选特定突变型，改变代谢流量或流向，从⽽提⾼⽬的产物产量的⼀种育种技术。
4、重组育种；利⽤微⽣物间的遗传重组来改变其遗传物质组成及结构的⼯业微⽣物育种技术。
5、原⽣质体融合育种；通过⼈为⽅法，使遗传性状不同的两细胞的原⽣质体发⽣融合，从⽽实现遗传重组的⼯业微⽣物育种技术。
6、基因⼯程育种技术：在体外构建重组DNA分⼦并导⼊宿主内⾼效表达，从⽽获得重组微⽣物的育种技术。
7、突变：遗传物质核酸中的核苷酸序列发⽣了稳定的可遗传的变化。
8、突变体：带有突变基因的细胞或个体9、突变型：突变体的基因型或表型称为突变型，和其相对的原存在状态称为野⽣型。
10、⾃发突变（spontaneous mutagenesis）：未经任何⼈为处理⽽⾃然发⽣的突变；11、诱发突变（induced mutagenesis）：由⼈们有意识地利⽤物理或化学⼿段对⽣物体进⾏处理⽽引起的突变。
12、整倍体：含有完整的染⾊体组。
13、⾮整倍体：含有不完整状态的染⾊体组，⼀般是指⼆倍体中成对染⾊体成员的增加或减少。
14、部分⼆倍体：原核⽣物中由⼀整条染⾊体和外来染⾊体⽚段所构成的不完整⼆倍体。
增变基因（mutator gene）：其基因突变会导致整个基因组的突变频率明显上升的⼀些基因。
15、前突变：诱变剂所造成的DNA分⼦某⼀位置的损伤16、光复活：指细菌在紫外线照射后⽴即⽤可见光照射，可以显著地增加细菌的存活率，降低突变率。
17、表型延迟phenotype lag：突变体表型改变落后于其基因型改变的现象。
18、分离性延迟segregational lag ：突变基因由杂合状态到纯合状态所造成的表型迟延19、⽣理性延迟physiological lag ：由于基因产物的“稀释”过程所造成的表型迟延野⽣型（wild type）：从⾃然界分离到的任何微⽣物在其发⽣营养缺陷突变前的原始菌株；基因重组：由于不同DNA链的断裂和连接⽽产⽣DNA⽚段的交换和重新组合，形成新的DNA分⼦，进⽽形成新遗传个体的⽅式称为基因重组。
食品生物技术复习题
一、填空1．作为现代生物技术重要分支的食品生物技术的作用：1〕解决食品短缺2〕丰富食品种类3〕开发新型功能性食品4〕生产环保型食品5〕开发新资源食品2．农杆菌是一种天然的植物遗传转化体系。
人们将目的基因插入到经过改造的 T－DNA区，借助农杆菌的感染实现外源基因向植物细胞的转移及整合，然后通过细胞和组织培养技术，再生出转基因植株。
3．常用的植物转基因方法可分成两大类：第一类需要通过组织培养再生植株，常用的方法有农杆菌介导转化法、基因枪法；另一类方法不需要通过组织培养，目前比拟成熟的主要有花粉管通道法。
4．原生质体融合是微生物育种的重要于段，它的最大特点是超越了生物体所具有的性的障碍，给育种和不同细胞间的融合提供了理论的可能性。
例如，酿酒酵母(Saccharomyces cereivisiae)和糖化酵母()种间融合成功，融合子具有糖化和发酵的双重能力。
5．酶生产技术的发酵条件既要有利菌体生长繁殖，又不影响酶的形成。
一般处理是先确定菌体生长的最适条件，然后作出调整以满足酶生成的需要。
6．通俗地讲，转基因食品就是将植物、动物或微生物的基因从细胞中取出并插入到另外的生物细胞中去，以获得某些有利特性的新生物，由这些生物制成的食品或食品添加剂就是转基因食品(90％以上为转基因植物及其衍生产品)。
转基因植物性食品及传统食品的主要差异含有来源于其他生物体的外源基因。
7．运用基因工程设计制造的“DNA探针〞检测肝炎病毒等病毒感染及遗传缺陷，不但准确而且迅速。
通过基因工程给患有遗传病的人体内导入正常基因可“一次性〞解除病人的疾苦。
8．细胞是生物体构造和功能的根本单位，同时，细胞显示出了生命的根本特征：自我复制、新陈代谢、应激性等。
细胞具有潜在的全能性,即离体的植物细胞或性细胞，在一定培养条件下能诱导发生器官分化，而且再生的植物具有及母体植株一样根本一样的全部遗传信息。
9.将具有较高活性的酶基因转移至面包酵母(Saccharomyces Cervisiae)，便能使面包酵母显著地提高麦芽糖透性酶(Maltose premease)及麦芽糖酶(Maltase)的活性，使面团发酵时产生大量的CO 2，形成膨发性能良好的面团，从而提高面包质量和生产效率。
原生质体融合育种
原生质体融合育种摘要原生质体融合育种克服了远缘杂交不亲和的障碍，可以提高重组频率，使得遗传物质的交换、传递更完整，成为微生物育种的一种重要方式。
其过程包括原生质体制备和再生、原生质体融合以及融合体检出等步骤。
在每个步骤中均要考虑到其应注意的因素，从而提高原生质体育种的效率，达到快速育种的目的。
因原生质体融合育种的优势，其在多功能菌种选育、工程菌选育和工业生产育种等方面应用广泛。
关键词原生质体制备融合育种原生质体再生融合体检出引言传统的杂交育种具有一定的局限性，需要受到亲和力的影响，并且要求亲本有性的分化，而原生质体育种则克服了这些缺点。
当细菌细胞壁被剥离，剩下由原生质膜包围的原生质部分称为原生质体。
原生质体融合是指通过人为的方法，使遗传性状不同的两个细胞的原生质体进行融合，借以获得兼有双亲遗传性状的稳定重组子的过程。
[1]原生质体融合不受种属限制，能够完整的传递遗传物质，使得重组几率提高进而提高育种速度。
[1-2]育种步骤可分为五大步骤：直接亲本及其遗传标记的选择、双亲本原生质体制备和再生、亲本原生质体诱导融合、融合重组体分离、遗传标记分析和测定。
1.亲本遗传标记的选择进行原生质体融合的双亲本一般要携带遗传标记，以顺利地筛选到融合子。
常用营养缺陷型、抗性、荧光染色、温度敏感性、孢子颜色、菌落形态等作为标记。
其中营养缺陷型是常用而有效的选择手段。
[3]2.原生质体制备制备原生质体是融合育种的前提，为了制备原生质体，需要将包围细胞的细胞壁去除掉。
去壁的方法很多，主要有机械法、酶法和非酶法，现在使用较多的是酶法。
[4]2.1酶法制备原生质体的条件（1）菌体年龄微生物的生理状态决定了原生质体的形成，而菌龄明显影响了原生质体的形成率，菌龄过长不利于释放原生质体，过短则菌丝体容易破裂。
丝状真菌一般选择年轻的尖端生长点的菌丝；细菌与霉菌一般采用对数生长期，而放线菌以对数期到静止期的转换期为好。
[5]（2）稳定剂原生质体由于失去了细胞壁因此对环境十分敏感，渗透压尤为重要。
微生物题库及答案
微生物复习题一、选择题1、微生物是一些个体微小、构造简单的低等生物的总称,它们的大小一般小于 CA、1cmB、1mmC、D、1μm2、在微生物学发展史上曾出现过寻找重要病原菌的“黄金时期”,其原因主要是 CA、显微镜的应用B、消毒灭菌术的建立C、微生物纯种分离技术的成功D、纯种微生物培养技术的创立3、人类已消灭的第一个传染病是 CA、麻疹B、脊髓灰质炎C、天花D、水痘4、微生物五大共性的基础是 A ;A、体积小,面积大B、吸收多,转化快C、生长旺,繁殖快D、适应强,易变异E、分布广,种类多5、在以下四大类微生物中,只含DNA或RNA一种核酸的是 D ;A、真菌B、真细菌C、古生菌D、病毒6、土壤中三大类群体微生物以数量排序为 AA、细菌＞放线菌＞真菌B、细菌＞真菌＞放线菌C、放线菌＞细菌＞真菌D、真菌＞细菌＞放线菌7、在以下六类微生物中,细胞壁不含肽聚糖的是 C ;A、真细菌B、放线菌C、古生菌D、蓝细菌E、支原体F、立克次氏体8、在G+细菌细胞壁中缺乏的化学成分是 DA、肽聚糖B、磷壁酸C、类脂质D、蛋白质9、在G－细菌细胞壁中缺乏的化学成分是 BA、肽聚糖B、磷壁酸C、类脂质D、蛋白质10、革兰氏染色的关键步骤是 CA.结晶紫初染B.碘液媒染C.酒精脱色D.蕃红复染11、多数霉菌细胞壁的主要成分为 BA、纤维素B、几丁质C、肽聚糖D、葡聚糖和甘露聚糖12、下列微生物能通过细菌滤器的是 CA、细菌B、酵母菌C、病毒D、霉菌13、在放线菌发育过程中,吸收水分和营养的为 AA、基质菌丝B、气生菌丝C、孢子丝D、孢子14、分生孢子头呈扫帚状的霉菌是 CA. 毛霉B. 根霉C. 青霉D. 曲霉15、用溶菌酶水解G－细菌的细胞壁通常可获得一种称为 D 的缺壁细菌;A、支原体B、L型细菌C、原生质体D、球状体16、目前用于解释细胞膜功能的学说,主要是 BA、渗透调节皮层膨胀学说B、液态镶嵌模型C、化学渗透学说D、构象假说17、异染粒在细菌中的生理功能是 DA、碳源贮藏物B、氮源贮藏物C、能源贮藏物D、磷素贮藏物18、有一种芽孢杆菌可产生具有杀虫作用的伴孢晶体,这种细菌称为 B ;A、地衣芽孢杆菌B、苏云金芽孢杆菌C、蕈状芽孢杆菌D、凝结芽孢杆菌19、在以下六类微生物中,不属于真核微生物的是 DA、真菌B、微藻C、原生动物D、蓝绿藻E、地衣F、黏菌20、在固态基质上会不断蔓延,以致不能形成菌落的霉菌是 D ;A、青霉B、曲霉C、白地霉D、根霉21、决定病毒感染专一性的物质基础是 BA、核酸B、蛋白质C、脂类D、糖类22、病毒对 C 不敏感A、高温B、紫外线C、抗生素D、干扰素23、下列微生物耐温顺序为 BA.营养体＞孢子＞芽孢B.芽孢＞孢子＞营养体C.孢子＞营养体＞芽孢D.芽孢＞营养体＞孢子24、动物病毒在其宿主的单层细胞培养物上所形成的聚集体,称为 CA、包含体B、噬菌斑C、空斑D、枯斑25、在噬菌体一步生长曲线中,若人为地用氯仿等破坏宿主细胞,发现培养液呈现侵染性,此期称 C ;A、潜伏期B、隐晦期C、胞内累积期D、裂解期26、噬菌体属于病毒类别中的 AA. 微生物病毒B. 昆虫病毒C. 植物病毒D. 动物病毒27、对多数微生物来说,最适宜的碳源是 BA、C·G·I·B·N类B、C·H·O类C、C·H类D、C·O类28、在C·H·O类化合物中,微生物最适宜的碳源是 AA、糖类B、有机酸类C、醇类D、脂类29、培养真菌时,培养基常加%乳酸,其目的是 DA.提供能源B.提供碳源C.调节pHD.三者都是30、微酸环境下适宜生长的微生物是 CA、细菌B、放线菌C、真菌D、病毒31、下列哪种培养法适用于厌氧菌的培养 DA. 固体平板B. 固体斜面C. 液体表面D. 高层琼脂柱32、以高糖培养酵母菌,其培养基类型为 AA. 加富培养基B. 选择培养基C. 鉴别培养基D. 普通培养基33、向培养基中加入青霉素筛选转化子,此培养基属 CA.基础培养基B.加富培养基C.选择培养基D.鉴别培养基34、蓝细菌属于 A 微生物;A、光能自养型B、光能异养型C、化能自养型D、化能异养型35、葡萄糖和果糖等营养物进入原核生物细胞膜的机制是通过 DA、单纯扩散B、促进扩散C、主动运送D、基团移位36、发酵是以 D 作为最终电子受体的生物氧化过程C.无机物D.有机物37、高氏1号培养基适合培养 BA、细菌B、放线菌C、酵母菌D、霉菌38、要对含菌量较少的水样进行细菌计数,较好的方法是应用固体培养基中的 C 法;A、固化培养基B、非可逆性固化培养基C、滤膜固体培养基D、天然固态培养基39、要对细菌进行动力观察,最好采用 CA、液体培养基B、固体培养基C、半固体培养基D、脱水培养基40、下列哪种结构与细菌的侵袭力无直接关系 CA. 菌毛B. 链激酶C. 细胞膜D. 荚膜41、新陈代谢研究中的核心问题是 C ;A、分解代谢B、合成代谢C、能量代谢D、物质代谢42、反硝化作用的最终产物 CA. NH3B. HNO3C. N2D. HNO243、在典型生长曲线中,细胞形态最大的时期是 A ;A. 延滞期B. 指数期C. 稳定期D. 衰亡期44、在典型生长曲线中,代时最短的时期是A. 延滞期B. 指数期C. 稳定期D. 衰亡期45、质粒是细菌的 B ;A. 核质DNAB. 胞质DNAC. 胞质RNAD. 核质DNA46、黏质沙雷氏菌在25℃培养时会产生深红色的灵杆菌素,可是,当培养基在37℃下时就不产此色素,但若再降到25℃时又重新恢复产色素能力,此即DA. 遗传型B. 表型C. 变异D. 饰变47、今从土壤中分离到一株菌,欲对其进行鉴定,首先应进行的是： AA、获得该菌株的纯培养B、细胞形态和习性水平研究C、查找权威鉴定手册D、基因或DNA水平鉴定48、干热灭菌法要求的温度和时间为 CA. 105℃,2小时B. 121℃,30分钟C. 160℃,2小时D. 160℃,4小时49、下列哪种情况不属于微生物与生物间共生关系的体现; DA. 根瘤B. VA菌根C. 反刍动物的瘤胃D. 固氮菌与纤维素分解菌的共培养50、下列微生物耐温顺序为 BA、营养体＞孢子＞芽孢B、芽孢＞孢子＞营养体C、孢子＞营养体＞芽孢D、芽孢＞营养体＞孢子三、填空1、根据形态、结构等生物学特征,可将微生物划分为原核微生物、真核微生物、非细胞型微生物三大类;2、专性活细胞内寄生的微生物有衣原体、立克次氏体、病毒;3、真核微生物的鞭毛为 9+2 型;4、列出四种观察细菌鞭毛方法电镜观察、鞭毛染色法、悬滴法、半固体穿刺法 ;5、测定噬菌体效价的常用方法是双层平板法 ;6、细菌的特殊结构中,与致病性直接相关的是菌毛和荚膜 ;7、连续培养器的原理按控制方式可分为恒浊器和恒化器 ;8、细菌生长繁殖需要营养 , 温度 , pH , 气体条件;9、细菌的6类营养要素包括碳源、氮源、能源、生长因子、无机盐和水;10、营养物质进入细胞的方式有四种,其中可以逆浓度梯度运输营养物质的方式有主动运输和基团转运 ;11、将病毒分为三种对称体制;例如,腺病毒属于二十面立体对称体制,TMV属于螺旋对称体制;12、利用“曲颈瓶试验”否定自然发生学说的是巴斯德 ,首次分离到衣原体的是我国的微生物学家汤飞凡 ;13、肽聚糖是细菌细胞壁的特有成分,是由肽和聚糖骨架链组成,而后者是Ｎ－乙酰胞壁酸和Ｎ－乙酰葡糖胺经β－１,４—糖苷键连接而成;14、丝状真菌结构由孢子和菌丝体组成,其中菌丝按功能分为营养菌丝和气生菌丝两种;15、细菌的基本形态包括球状 , 杆状 ,螺形状三种;16、采用原生质体融合进行微生物遗传育种时,制备细菌的原生质体常用青霉素处理,酵母菌常用蜗牛酶处理获得相应的原生质体;17、根据核酸的形式,病毒可分为dsRAN 病毒, dsDNA 病毒, -ssRNA病毒 , +ssRNA病毒, ssDNA病毒 , 反转录病毒六种;18、衣原体的生活史包括始体和原体两个阶段,无繁殖能力的阶段是原体 ;19、证实核酸是遗传物质的3个经典实验分别是转化实验、_噬菌体侵染实验和_植物病毒重建实验 ;20、证明基因突变的自发性和不对应性的三个经典实验分别是变量实验 , 涂布实验、影印实验 ;四、名词解释1、microorganism：微生物,指一大类形体微小、结构简单的低等生物的总称;包括真核细胞型、原核细胞型和非细胞结构三大类微生物;2、真核微生物：是一大类群具有真核生物特点的微生物,包括菌物界的真菌、属于植物界的显微藻类和属于动物界的原生动物;3、原核生物：是一大类细胞微小、只有核区的单细胞生物,包括真细菌和古生菌两大类;原核生物和真核生物的主要区别是：原核生物细胞膜无核膜包裹,缺少由单位膜分隔而成的细胞器,核糖体为70S型;4、古生菌：又称古细菌,是一类在进化早期就与真细菌和真核生物的远祖相互独立演化的原核生物,主要包括一些与地球早期环境有联系的极端微生物,如嗜热菌、嗜酸菌、嗜盐菌和产甲烷菌等;主要特点为细胞壁无肽聚糖,细胞膜脂由醚键连接,以及与细菌有明显差别的16S rRNA序列等;5、立克次氏体：是大小介于通常的细菌与病毒之间,在许多方面类似细菌,专性活细胞内寄生的原核微生物;主要特征为：专性寄生于真核细胞内的原核生物；有细胞壁,细胞较大, G-；产能代谢途径不完整；以二分裂方式进行繁殖；需在相应的细胞中进行培养繁殖；对热敏感；对青霉素等抗生素敏感；为斑疹伤寒、恙虫病等疾病的病原体；采用“外斐氏反应”检测病原；通过节肢动物叮咬和排泄物传播给人和其他动物;6、荚膜：糖被的一种,包裹在细菌细胞壁外、有固定层次的胶黏物,一般成分为多糖,少数为多肽或多糖与多肽的复合物;荚膜具有保护、贮藏、附着和堆积代谢废物等生理功能;7、糖被：包被于某些细菌细胞壁外的一层厚度不定的胶状物,其成分一般为多糖;因厚度不同等原因,可把糖被分成荚膜、黏液层或菌胶团等;糖被德生理功能是保护细胞、贮藏养料、附着和堆积代谢产物等;8、 L型细菌：实验室或宿主体内通过自发突变而形成的遗传性稳定的细胞壁缺陷菌株;对渗透压敏感,在固体培养基上形成“油煎蛋”似的小菌落;9、鞭毛:某些细菌细胞表面着生的一至数十条长丝状、螺旋形的附属物,具有推动细菌运动功能,为细菌的“运动器官”;10、水活度：在天然环境中,微生物可实际利用的自由水或游离水的含量,一般用在一定的温度和压力条件下,溶液的蒸汽压力与同样条件下纯水蒸汽压力之比表示,即：αw =Pw/Pow;;11、伴孢晶体：少数芽孢杆菌形成芽孢时产生的菱形、方形或不规则碱溶性蛋白质晶体,可作为生物农药;12、溶原性细菌：温和噬菌体基因组整合到宿主基因组中去,并随细菌基因组的复制而复制,不能形成子代噬菌体;此时的宿主菌就是溶原性细菌;13、前噬菌体：温和噬菌体感染宿主菌后, 其基因整合到宿主染色体上,随宿主染色体的复制而复制.14、呼吸：又称好氧呼吸,指葡萄糖等底物按一定途径脱氢后,氢经完整呼吸链的传递,最终被外源分子氧接受并释放水,在此过程中完成氧化磷酸化作用而产生ATP形式的能量;15、无氧呼吸：又称厌氧呼吸,一类呼吸链末端的氢受体为外源无机氧化物或有机氧化物的生物氧化,是在无氧条件下进行的、产能效率较低的特殊呼吸;其特点是葡萄糖等底物按常规途径脱氢后,经呼吸链传递氢或电子,最终由氧化态的无机物NO3-,SO42-等或有机物受氢,并完成氧化磷酸化产ATP功能;16、发酵：在无氧条件下,底物脱氢后所产生的还原力H未经呼吸链而直接交中间产物接受；以实现底物水平磷酸化产能的一类生物氧化反应;17、LPS：脂多糖LPS：是位于革兰氏阴性细菌细胞壁最外层的一层较厚的类脂多糖类物质,由类脂A、核心多糖和O-特异侧链三部分组成;18、PHB：聚β-羟丁酸;是一种存在于某些细菌细胞质内的一类颗粒状物质,具有贮存能源、碳源和降低细胞内渗透压的物质;19、一步生长曲线：一步生长曲线是指能定量描述烈性噬菌体生长规律的实验曲线;一步生长曲线可分为三个时期：①潜伏期;②裂解期;③稳定期20、菌落形成单位cfu：用平板菌落计数法对活菌进行计数时的一个计数单位,对充分分散、稀释度合适的单细胞微生物来讲,1 cfu即表示样品中有一个活细胞,但对成团或呈链状、丝状生长的微生物来说,则cfu并非一个活细胞;21、生长因子：通常指那些微生物生长所必需而且需要量很小,但微生物自身不能合成的或合成量不足以满足机体生长需要的有机化合物;根据生长因子的化学结构与它们在机体内的生理功能不同,可以将生长因子分为维生素、氨基酸和嘌呤及嘧啶碱基三大类;22、正常菌群：在正常人体与外界相通的部位,长期寄居的不同种类和不同数量的微生物;一般对人体无害,与机体相互制约＼相互依存,与机体保持动态平衡的关系;23、条件致病菌：人体的正常微生物菌群一旦进入非正常聚居部位,或生态结构发生改变而引起人类疾病的微生物;主要包括1由于机体的防卫功能减弱2由于正常菌群寄居部位的改变３不合理使用抗生素等;24、消毒：采用一种较温和的理化因素,仅杀死物体表面或内部一部分有害的病原菌,而以被消毒的对象基本无害的措施;25、巴氏消毒法:用于啤酒、牛奶等不耐热的食品德低温消毒法;主要是消除不耐热的无芽孢的病原体;有低温维持法63℃３０min和高温瞬时法７２℃１５s．五、简答题1、科赫定律的内容及其在科学研究中的指导意义;内容：①在患病的动物体内总能发现特定微生物,而健康的动物体内则没有；②在动物体外可以纯培养此微生物；③将该培养物接种到易感动物体内会引起同样的疾病；④从试验动物及实验室培养物中重新分离得到的微生物应该是同种微生物;意义：鉴定一种微生物；确定一种新微生物种类;2、试述细菌细胞壁的结构与功能;细胞壁细胞壁的主要功能有：①固定细胞外形和提高机械强度；②为细胞的生长、分裂和鞭毛运动所必需;③阻拦酶蛋白和某些抗生素等大分子物质.④赋予细菌具有特定的抗原性、致病性以及对抗生素和噬菌体的敏感性;革兰氏阳性细菌细胞壁含90%肽聚糖和10%磷壁酸;革兰氏阳性菌肽聚糖厚,层数多,呈网格状分子交织成的网套覆盖在整个细胞上;肽聚糖分子是由肽与聚糖两部分组成,其中的肽有四肽尾和肽桥两种,聚糖则由N-乙酰葡糖胺和N-乙酰胞壁酸相互间隔连接而成,呈长链骨架状;磷壁酸是结合在革兰氏阳性细菌细胞壁上的一种酸性多糖,主要成分为甘油磷酸或核糖醇磷酸;磷壁酸可分为壁磷壁酸和膜磷壁酸;革兰氏阴性细菌的细胞壁由肽聚糖和外膜;其肽聚糖薄仅由1~2层,呈网状分子,只形成较为疏稀、机械强度较差的肽聚糖网套没有特殊的肽桥;外膜位于革兰氏阴性细菌细胞壁外层,由脂多糖、磷脂和脂蛋白等若干种蛋白质组成的膜;3、有关鞭毛运动的机制曾有过“旋转论”和“挥鞭论”的争议;1974年,美国学者和曾通过“逆向思维”方式创造性地设计了一个巧妙的“拴菌”试验,即设法把单毛菌鞭毛的游离端用相应抗体牢固地“拴”在载玻片上,然后在光镜下观察该细胞的行为,结果发现,该菌只能在载玻片上不断打转而未作伸缩“挥动”;从该试验所提供的事实,你认为细菌是以何种方式运动的该试验的“逆向思维”逆在哪里“拴菌”试验指把单毛菌鞭毛的游离端用相应抗体牢固地”拴”在载玻片上,然后在光镜下观察该细菌的运动,结果发现,该菌只能在载玻片上不断打转而未作伸缩挥动,证明了细菌的运动是因为鞭毛旋转的结果,而不是鞭毛“挥动”的结果;其创新思维在于“逆向思维“,通过固定鞭毛的游离端,使细菌细胞变成了指示鞭毛运动的指示物,进而在光镜下就可观察鞭毛的作用机制;4、如何初步判断并进一步验证某一细菌是否长有鞭毛初步判断可采用半固体琼脂穿刺培养法和悬滴法水封片法,进一步验证可采用暗视野显微镜法和鞭毛染色法;1半固体培养基穿刺接种法：将欲检查的细菌穿刺接种至牛肉膏蛋白胨半固体直立柱培养基中培养,若细菌有运动能力,就会沿着穿刺线向四周扩散生长,使穿刺线变粗且周缘不整齐;无运动能力的细菌仅能沿穿刺线生长,穿刺线显得纤细浓密和整齐;2悬滴法：将菌液滴加在洁净的盖玻片中央,在其四周涂上凡士林,然后将它覆盖在凹玻片上,使菌液对准凹槽中央,直接观察;此法快速、简便;3暗视野显微镜法：装暗视野聚光器,调节光源,将1小滴香柏油滴于聚光器头颈顶端平面上,再将样品的水封片置于镜台上,使玻片的下表面与透镜上的香柏油接触,然后观察;4鞭毛染色法：染色前用媒染剂处理,让其沉积在鞭毛上,使鞭毛直径加粗,然后再进行染色;常用染色方法有银染色法、Leifson氏染色法、Bailey氏染色法等;5、试述划线分离的操作方法;1取9ml无菌平板一套在火焰旁按无菌操作法倒人15-20ml营养琼脂,让其冷凝成平板;2左手拿上述平板,右手拿接种环在火焰上灭菌后沾取原始分离物在平板上平行划线三条;3将接种环在火焰上灭菌,左手平板转动大约70度,用灭菌接种环通过第一次划线的地方作二次划线,以此类推,重复操作多次;7、某微生物发酵厂的发酵液出现疑似噬菌体感染的异常情况,试设计简便快速实验证实之;在牛肉膏蛋白胨琼脂培养基平板上涂布接种大肠杆菌,同时接种疑似噬菌体感染的发酵液提前进行适当稀释,培养后若出现噬菌斑,即证明该发酵液受到噬菌体感染;8、何谓病毒以噬菌体为例,试述病毒的增殖周期;病毒是超显微的,没有细胞结构的,具有以下特点：①无细胞结构,专性活细胞内寄生；②没有酶或酶系统极不完全,不能进行代谢活动；③个体极小,能通过细菌滤器；④对抗生素不敏感,对干扰素敏感;它们在活细胞外具有一般化学大分子特征,一旦进入宿主细胞又具有生命特征;病毒增殖周期五个阶段1、吸附吸附是病毒感染宿主细胞的前提,具有高度的专一性;在通常情况下,敏感细胞表面具有特异性表面接受部位,可与相应的病毒结合;2、侵入 病毒侵入的方式 取决于宿主细胞的性质,尤其是它的表面结构;一般来说有三种情况：①整个病毒粒子进入宿主细胞；②核衣壳进入宿主细胞；③只有核酸进入宿主细胞;3、生物生物合成 包括核酸的复制和蛋白质的合成;首先,噬菌体以其核酸中的遗传信息向宿主细胞发出指令并提供“蓝图”,使宿主细胞的代谢系统按次序地逐一转向合成噬菌体的组分和“部件”,合成所需“原料”可通过宿主细胞原有核酸等的降解、代谢库内的贮存物或从环境中取得;烈性噬菌体体的增殖方式按核酸类型的不同主要分成三类：即①按早期、次早期和晚期基因的顺序来进行转录、转译和复制的双链DNA 噬菌体的增殖方式；②按“滚环”模型复制单链DNA 的增殖方式；③按“花朵”模式复制A 蛋白成熟蛋白、衣壳蛋白和复制酶蛋白的增殖方式;4、装配 病毒核酸的复制与病毒蛋白质的合成是分开进行的,由分别合成好的核酸与蛋白质组成完整的新的病毒粒子的过程;5、释放 成熟的病毒粒子从被感染细胞内转移到外界的过程称为病毒释放;病毒的释放是多样的,有的通过破裂,出芽作用或通过细胞之间的接触而扩散;9、培养基中各营养要素的含量间一般遵循何种规律其中的原因是什么由于微生物细胞内各种成分间的比例是稳定的,因此,设计微生物培养基时,考虑微生物细胞组成元素的比例有重要的意义;培养基中各营养物质之间的浓度配比直接影响微生物的生长繁殖和或代谢产物的形成和积累,其中碳氮比C ／N 的影响较大;在大多数化能异养微生物的培养基中,除水分外,碳源的含量最高,其次是氮源、大量元素和生长因子,它们之间大体上存在着10倍序列的递减趋势,即：10、试述革兰氏染色的步骤及机理;革兰氏染色的步骤： 结晶紫初染、碘液媒染、 95 ％乙醇脱色、红色染料复染 4 步； 革兰氏染色的机制： 革兰氏染色结果的差异主要基于细菌细胞壁的构造和化学组分不同;通过初染和媒染,在细菌细胞膜或原生质体上染上了不溶于水的结晶紫与碘的大分子复要素：含量： H 2O ＞ ～10-1 C 源+能源 ＞ ～10-2 N 源 ＞ ～10-3 K 、Mg ＞ ～10-5 P 、S ＞ ～10-4 生长因子 ～10-6合物;G + 细菌由于细胞壁较厚、肽聚糖含量较高和交联紧密,故用乙醇洗脱时,肽聚糖层网孔会因脱水而明显收缩,再加上的 G + 细菌细胞壁基本上不含类脂,故乙醇处理不能在壁上溶出缝隙,因此,结晶紫与碘复合物仍牢牢阻留在其细胞壁内,使其呈现蓝紫色;G - 细菌因其细胞壁薄、肽聚糖含量低和交联松散,故遇乙醇后,肽聚糖层网孔不易收缩,加上它的类脂含量高,所以当乙醇将类脂溶解后,在细胞壁上就会出现较大的缝,这样结晶紫与碘的复合物就极易被溶出细胞壁;因此,通过乙醇脱色,细胞又呈现无色;这时,再经番红等红色染料复染,就使 G - 细菌获得了新的颜色——红色,而 G + 细菌则仍呈蓝紫色实为紫中带红;11、什么是溶源菌它有何特点如何检出溶源菌在染色体组上整合有温和噬菌体并能进行正常生长繁殖的宿主称为溶源菌;特点：能“收养”温和噬菌体并能与其长期共存,通常不呈现对宿主细胞有害的影响；常以较低频率10-3－10-5进行自发裂解能使位于宿主基因组上的整合态前噬菌体从染色体上解离出来,使前噬菌体由整合态转变为细胞内的营养态脱离宿主核基因组而处于积极复制、合成和装配的状态；溶源菌对同种或关系密切与的噬菌体具有免疫性免遭其再侵染指特性；溶源菌也会失去前噬菌体而复愈为正常菌株;检测某一菌株是否属于溶源菌,可利用溶源菌所携带的前噬菌体的低频裂解性,与其相对应敏感菌株以适当比例混合,然后与琼脂培养基混合后倒平板,经培养后形成特殊菌落中央有溶源菌的小菌落,四周有透明圈围着;14、什么是细菌的生长曲线生长曲线对微生物发酵生产有何指导意义B卷细菌接种到适当的液体培养基后,以时间为横坐标,以菌数为纵坐标,根据不同培养时间时细菌数量的变化,可以作出一条反映细菌在整个培养期间菌数变化规律的曲线,这种曲线称为生长曲线称为生长曲线;一条典型的生长曲线至少可以分为迟缓期、对数期、稳定期和衰亡期等四个生长时期;迟缓期：细菌的数量维持恒定;在工业发酵和科研中迟缓期会增加生产周期而产生不利的影响,因此应该采取一定的措施：①通过遗传学方法迟缓期缩短；②利用对数生长期的细胞作为“种子”；③接种前后培养基组成不要相差太大；④适当扩大接种量等方式缩短迟缓期;对数生长期：细菌数量呈对数增加,细菌生长是平衡生长;对数生长期细菌的代谢活性、酶活性高而稳定,大小比较一致,生活力强,因而它广泛地在生产上用作“种子”和在科研上作为理想的实验材料;稳定生长期：由于营养物质消耗,代谢产物积累和pH等环境变化,逐步。
给学生微生物遗传育种学复习思考题1
给学⽣微⽣物遗传育种学复习思考题1《微⽣物遗传育种》复习思考题01 绪论1、⼯业微⽣物菌种应具有哪些基本特征？⾮致病性；适合⼤规模培养⼯艺要求；利于规模化产品加⼯⼯艺；具有相对稳定的遗传性能和⽣产性状；形成具有商业价值的产品或具有商业应⽤价值。
2、简述⼯业微⽣物遗传育种的分类。
天然菌种（native strain）：通过⾃然筛选和分离获得的⼯业菌种；诱变菌种（mutagenized strain）：通过物理、化学等诱变剂在实验室⼈⼯诱变⾃然筛选与分离的菌株所获得产量或/和性状改善的⼯业菌种；重组菌种（recombinant strain）是通过遗传重组技术对菌种进⾏定向遗传改良获得的⼯业菌种；遗传修饰⽣物体（genetic modification organisms, GMOs）：经外源基因导⼊并因此发⽣遗传整合和性状改变的⽣物体。
3、试从微⽣物遗传学的不同⾓度阐述你对微⽣物多样性的认识。
⼀、微⽣物物种的多样性; ⼆、微⽣物遗传的多样性;三、微⽣物代谢的多样性 ;四、微⽣物的⽣态多样性;五、微⽣物利⽤的⼴泛性02 第四章⼯业微⽣物育种诱变剂1、什么是诱变剂？可分为哪⼏种类型？诱变剂：凡能诱发⽣物基因突变，并且突变频率远远超过⾃发突变率的物理因⼦或化学物质.可以分为三类：物理诱变剂；化学诱变剂：⼀类能对DNA起作⽤，改变DNA结构，并引起遗传变异的化学物质；⽣物诱变剂：采⽤某些噬菌体来筛选抗噬菌体突变菌株时，常常发现伴随着出现抗⽣素产量明显提⾼的抗性突变株。
因此，可以认为这些溶源性噬菌体是⼀种⽣物诱变剂。
2、什么是突变？突变的表现型有哪些？基因突变的特点有哪些？突变，从⼴义上讲，除了转化、转导、接合等遗传物质的传递和重组引起⽣物变异以外，任何表型上可遗传的突变都属突变范围，如染⾊体整倍性和⾮整倍性的变化及染⾊体结构上的畸变等都包括在内。
1、形态突变型，是⼀种可见突变，它包括微⽣物菌落形态变化，如菌落形状⼤⼩、颜⾊、表⾯结构等；2、⽣化突变型，；3、条件致死突变型；4、致死突变型；5、抗性突变型；6、营养缺陷型；普遍性；随机性（基因突变可以发⽣在⽣物个体发育的任何时期和⽣物体的任何细胞。
微生物优良菌种的选育
优良菌种应具备的特征
对菌种的要求
1.生产力：能在廉价的培养基上迅速生长，所需的代谢产
物的产量高，其它代谢产物少
2.操作性：培养条件简单，发酵易控制，产品易分离 3.稳定性：抗噬菌体能力强，菌种纯，不易变异退化 4.安全性：是非病源菌，不产有害生物活性物质或毒素
优良菌种应具备的特征
选择生产菌种应注意的因素
二、诱变选育
诱导微生物发生突变进行的菌种选育，包括诱变和 筛选两个步骤。
概念：利用被称为诱变剂的物理因素或化学试剂处
理微生物细胞，提高其基因突变频率，再通过适当
的筛选方法获得所需要的高产优质菌种的育种方法。
原理：在诱变剂的作用下会出现染色体畸变（染色 体或DNA片段发生缺失、易位、重复等）；基因突 变(少数碱基改变)。
表皮葡萄球菌能产生一种内肽酶——葡萄球菌素，溶解
•革兰氏阴性菌不能直接溶壁，只有当乙二胺四乙酸 （EDTA）存在时，某些革兰氏阴性菌的细胞壁才能够被 溶菌酶溶解。
•放线菌的细胞壁结构类似于革兰氏阳性菌也可采用溶菌酶 •真菌细胞壁主要由纤维素、几丁质和葡聚糖等组成
青霉菌多用纤维素酶和-1,3-糖苷酶等溶壁
第四章 微生物优良菌种的选育 4 Breeding of the Industrial Strains
提纲
微生物优良生产菌种的特征 自然突变选育 诱变选育
工业微生物育种复习题解析
工业微生物育种复习题解析第一章绪论1.什么是工业微生物？作为工业微生物应具备哪些特征？答：工业微生物：对自然环境中的微生物经过改造，用于发酵工业生产的微生物。
具备特征：(1)菌种要纯(2)遗传稳定且对诱变剂敏感(3)成长快，易繁殖(4)抗杂菌和噬菌体的能力强(5)生产目的产物的时间短且产量高(6)目的产物易分离提纯2.工业微生物育种的基础是什么？答：工业微生物育种的基础是遗传和变异。
3.常用的工业微生物育种技术有哪些？答：常用技术：(1)自然选育【选择育种】(2)诱变育种(3)代谢控制育种(4)杂交育种(5)基因工程育种第二章微生物育种的遗传基础1.基因突变的类型有哪些？答：有碱基突变，染色体畸变2.叙述紫外线诱变的原理？答：原理：紫外线对微生物诱变作用，主要引起DNA的分子结构发生改变（同链DNA的相邻嘧啶间形成共价结合的胸腺嘧啶二聚体），从而引起菌体遗传性变异。
3.基因修复的种类有哪些？答：种类：(1)光复活修复(2)切除修复(3)重组修复(4)SOS修复4.真核微生物基因重组的方式有哪些？答：方式：(1)有性杂交(2)准性生殖(3)原生质体融合第三章出发菌株的分离与筛选1.什么是富集培养？答：富集培养：指在目的微生物含量较少时，根据微生物的生理特点，设计一种选择性培养基，创造有利的生长条件，使目的微生物在最适的环境下迅速地生长繁殖，数量增加，由原来自然条件下的劣势种变成人工环境中的优势种，以利于分离到所需要的菌株。
2.哪些分离方法能达到“菌落纯”？哪些分离方法能达到“细胞纯（菌株纯）”？答：菌落纯：稀释分离法、划线法、组织法细胞纯：单细胞或单孢子的分离法3.分离好氧微生物常用的方法有哪些？答：(1)稀释涂布法(2)划线分离法(3)平皿生化反应分离法4.平皿生化反应分离法有哪些？分别用来筛选哪些菌？各自原理如何？答：(1)透明圈法原理：在平板培养基中加入溶解性较差的底物，使培养基混浊，能分解底物的微生物便会在菌落周围产生透明圈，圈的大小可以放映该菌株利用底物的能力。
原生质体融合技术简介
2 原生质体的制备
获得有活力、去壁较为完全的原生质体是原生质 体融合育种技术的先决条件。 在细菌和放线菌中，制备原生质体主要采用溶菌 酶；制备葡萄球菌的原生质体，则需用溶葡萄球 菌素处理；制备酵母菌的原生质体时， 一般可用 蜗牛酶；制备丝状真菌的原生质体时，可用蜗牛 酶，在丝状真菌的原生质体制备中很少单独使用 一种酶，而是采用两种或三种酶混合处理。 另外，影响原生质体制备的因素有许多，主要是 菌体的性质 ，酶的性质以及反应环境
(1)直接法 原生质体融合后直接分离到MM或SM上，即可 (1)直接法 原生质体融合后直接分离到MM或SM上，即可 直接检出融合细胞。其优点是只需一步就可得到重组体， 而大多数重组体是稳定的，缺点是难以检出那些表型延 迟而基因已重组的融合体。 (2)间接法 把融合产物分离到CM上，使原生质体再生， (2)间接法 把融合产物分离到CM上，使原生质体再生， 融合和非融合的原生质体都能生长，再分离到SM上。其 融合和非融合的原生质体都能生长，再分离到SM上。其 优点是能促使细胞更好地再生，表型延迟重组体容易检 出。缺点是需要两步才能检出重组体，需要相当大的人 力和物力，而且得到的重组体不大稳定。 直接法和间接法都要用营养缺陷性标记，所得重组体不 一定能提高目的产物的产量。 (3)钝化选择法 (3)钝化选择法 钝化选择法是指灭活原生质体和具活性原 生质体融合，把亲株中的一方（野生型）原生质体在 50° 热处理2 50°C热处理2-3小时，使融合前原生质体代谢途径中的 某些酶钝化不能再生，再与另一方（双缺陷性）原生质 体融合，并分离到mm上，灭活除用加热方法外，还可以 体融合，并分离到mm上，灭活除用加热方法外，还可以 用紫外或药物处理。
3 原生质体的再生
酶解去壁后得到的原生质体应具有再生能力，即能 重建细胞壁，恢复细胞完整形态并能生长、分裂， 这是原生质体融合育种的必要条件。仅有细胞质膜 的原生质体对渗透压很敏感、很容易破裂，致使原 生质外流而使细胞死亡。所以，再生培养基必须与 原生质体内的渗透压相等。这就要在再生培养基中 加入具有一定渗透压的基质，即渗透压稳定剂 原生质体的再生是一个非常复杂的过程．一些学者 研究认为，若原生质体的细胞壁剥去得不太彻底， 则有助于细胞壁的再生，残留的细胞壁尤如结晶时 的“晶种”一样。大量实验也证明，破壁太彻底往 晶种” 往会引起原牛质体再生率的大大率较高 由于原生质体没有细胞壁的障碍，而且在原生质体融 合时加入融合促进剂PEG，所以微生物原生质体间的杂 合时加入融合促进剂PEG，所以微生物原生质体间的杂 交频率都明显高于常规杂交方法。 2 受接合型或致育性的限制较小 由于两亲株中任何一株都可能起受体或供体的作用， 因此有利不同种属间微生物的杂交。另外，出于原生质 体融合是和致育性没有关系的细胞杂交，所以其受接合 型或致育性的限制就比较小。 3 重组体种类较多 由于原生质体融合后，两个亲株的整套基因组之间发 生相互接触．有机会发生多次交换，可以产生各种各样 的基因组合而得到多种类型的重组体
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影响原生质体形成的因素很多 , 不同的微生物
有其较为适当的形成条件 。 在菌龄的选择上 , 多采 用对数生长期或生长中后期的菌 , 这是因为 , 菌体的
不同生理状态直接影响到细胞壁的结构 , 对数生长 期细菌的细胞壁中肽聚糖含量最低 , 细胞壁对酶的
作用最敏感 , 但是对数生长早期的菌相对较为脆弱 , 受酶的过度作用会影响原生质体的再生率 。研究表
融合子 。 结果在所得的融合子中 85 %以上 只产生 去甲基产物 , 从而提高了目的产物的相对产量 。
4 .3 获得新代谢产物的菌株 贺敏霞等[ 21] 通过诺卡氏菌原生质体融 合重组
研究发现 , 有 4 株融合子产生亲本没有的甾体转化
中间体 , 3 株融合子产生亲本没有的抗生物质 , 还得 到 1 株甾体转化活力明显高于亲本的融合子 。林荣 团等[ 22] 的研究更容易说明这个问题 。他们 以天然
Key words :pr oto plast ;pro toplast fusion ;g ene tic and breeding
原生质体融合(prot oplast fusio n)是细 胞融合 (cell fusio n)的一个组成部分 。 由于对植物细胞和 微生物细胞进行细胞融合时 , 必须除去细胞壁 , 而剩
无抗菌活性的链霉菌(S treptom yces liv idans)1326 与链霉菌 1254 营养缺陷型突变株进行种间原生质
源降低发酵液的温度 。 因此 , 将酿酒酵母 396(能利 用甘蔗糖蜜生产酒精)和假丝酵母 C6(45 ℃生长良 好)为亲本 , 进行原生质体融合筛选得到在 40 ℃培 养 条 件 下 原 料 利 用 率 为 94 .3 %、乙 醇 产 量 为 59 .7 g/ L的属间融合株 。 4 .5 改良菌种的遗传特性
由于在自然条件下 , 原生质体发生融合的频率 非常低 , 所以在实际育种过程中要采用一定的方法 进行人为地促融合 。当前常用的方法主要有 :化学 法 、物理法和生物法等 。 这几种方法各有其自身的 特点(表 1)。
3 原生质体融合子的筛选
获得了融合体之后 , 下一步的工作就是原生质 体融合子的筛选 。在融合体中除了重组体外 , 还有 异核体或部分结合子 、杂合二倍体或杂合系 , 这些都
在抗生素的研究中 , 原生质体融合技术可用于 提高抗生素的产量 。 但是 , 种间融合获得的融合子
菌株往往会产生一些不希望有的组分 。 为了解决这 一问题 , 张瑾阳等[ 20] 在进行去甲基金霉素产生菌与 金霉素产生菌原生质体融合以选育产去甲基金霉素
的菌株时 , 对金霉素产生菌的原生质体进行热灭活 , 减少了既产生金霉素和四环素又产生去甲基产物的
酵母于 40 ℃时产酒明显下降 , 为此必须消耗大量能
在工业微生物育种上 , 人们根据不同需求通过 原生质体融合技术培育出了高产 、优质 、抗逆性强等
的微生物菌种 。 4 .1 选育优良的菌种
原生质体融合广泛应用到酿酒酵母的改良 。 彭 帮柱等以酿酒酵母 1605 和苹果酒酵母 E2 为亲本 ,
另外 , 添加 0 .02 mo l/ L 镁离子或 0 .6m ol/ L 的钾粒 子 , 有利于原生质体的稳定 , 提高原生质体的产 量[ 1 0] 。
1 原生质体制备及其影响因素
2 原生质体融合的促融方法
微生物细胞一般是有细胞壁的 , 因此原生质体
融合的第一步就是制备原生质体 。 当前去除细胞壁 的方法主要有机械法 、非酶法和酶法 。 采用前两种
贵州农业科学 2007 , 35(3):139～ 141 G uizho u A g ricultural Science s
[ 文章编号] 1001-3601(2007)03-0159-0139-03
原生质体融合技术及其在微生物遗传育种上的应用
丁 朋晓1 , 2 , 杨季芳2 ＊ , 谢 和1
方法制备的原生质体效果差 , 活性低 , 仅适用于某些 特定菌株 , 因此 , 并未得到推广 。 在实际工作中 , 最
有效和最常用的是酶法 。 该法时间短 , 效果好 。 到 目前为止 , 适合于原生质体制备的各种酶类已经得 到开发和应用[ 6] 。在酶法中使用的酶主要为蜗牛酶 或溶菌酶 , 至于具体使用哪一种酶要根据所研究的 微生物的种类而定 。
通过原生质体融合技术使两个菌株的遗传物质
得到重组 , 从而获得兼具两个亲本优良性状的新菌 株 。如苏云金 杆菌以色列变种(Baci I lus thuri ngiensi s subsp .i sraelensi s)产生的杀虫毒素主要杀死 双翅目昆虫 , 而苏云金杆菌库斯塔基变种(B aci l lus thuringiensi s subsp .k urstaki H D-I)产生的毒素蛋 白主要杀鳞翅目昆虫 。 将这两个菌株的原生质体进
物理法
用物理的手段(如电场 、激光、超声波 、磁声等)使亲本 的原生质 体发生 融合 。 最常用的主要有 :电处理融合法 、激光诱导融合法以及在电融合 技术上改进的方法如磁-电融合法 、超声-电融合法及电-机械融合法等 。
优点 :电融合条件可控 , 融合率高 , 无毒 。 缺点 ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ设备条件 要求高 , 费用 较贵 。
育种工作中可根据实验目的和 微生物不同加 以选 择。
的新物质 。 4 .4 优化菌发酵特性
许多种微生物能在 45 ～ 65 ℃生存 , 有的甚至更 高 。有种耐热菌可在 98 ℃温泉 中生长繁殖 。 关于
4 原生质体融合技术在微生物菌种选育中 的应用[ 4 , 5 , 12]
微生物耐热性的机理研究还不是很清楚 , 但其耐热 性却有很重要的应用价值 。 如在酒精酿造中 , 酿酒
生物法
紫外灭活的病毒膜片能使细胞间产生凝聚和融合 。
病毒制备困难 , 操作复杂 , 实验重复性差 , 融合率 很低 。 适用 于动物细 胞融合 。
会在再生平板上形成菌落 。为了从融合后的细胞群 中选育目的杂种细胞 , 必须采用合适的筛选方法[ 11]
默基因(Si lent gene), 若能使这些基因得到表达 , 这 类微生物就有可能合成更多的次级代谢产物 。 近年
Abstract :T he technique of pro to plast fusio n with advantages of transmitting a la rge quantity o f g enetic info rmatio n,
having little influence f rom blo od relationship , selecting pare nt str ains on pur po se fo r breeding the ideal fusio n str ains a nd operating easily , has the w ide applica tion pro spect in microbial genetic and breeding .T he pape r summarize s the prepa ratio n o f proto plast and its influencing facto rs , the accelerating method o f pro to plast fusion , the selectio n o f fusants and the application of pro toplast fusion in micro bial str ains breeding , etc .
DIN G Pengx iao1 , 2 , YA N G Jifang2 ＊ , X IE H e1
(1 .College of Lif e Science , Guizhou Universit y , Guiyang , Guizhou 550025;2 .Colloge of Biological and Environment Science , Wanli Universit y , Ningbo, Zhe j iang 315100 , China)
远 , 甚至毫无关系的生物体细胞融合在一起 , 为远缘 杂交架起了桥梁 , 是改造细胞遗传物质的有力手段 ,
它不仅在于打破了有性杂交重组基因创造新种的界 限 , 更重要的是扩大了遗传物质的重组范围 。 科技 工作者[ 1 ～ 5] 经过大量的努力 , 利用原生质体融合技 术在微生物育种上取得了大量的成绩 。 事实证明 ,
通过原生质体融合 , 得到融合子 8 #菌株 , 具有产香 能力和发酵能力均强于双亲的优点[ 13] 。黎 永学等 以双歧杆菌和酿酒酵母为亲本进行融合 , 得到的融
合子具有双亲的生物学特性 , 为双歧杆菌生物学功 能的开发提供了新思路 、新途径[ 14] 。 王宪等[ 15] 利用
原生质体融合技术获得具有双亲杀虫谱的新菌株 。 诸如此类的报道国内外均有[ 15 ～ 18] 。 4 .2 提高菌株的代谢产物
[ 收稿日期] 2006-12-22 ;2007-02-14 修回
[ 作者简介] 丁朋晓(1980 - ), 女 , 在读硕士, 研究方向 :环境微生物学 。 ＊通讯作者 :杨季芳 , 男 , 研究员 , E-mai l :jf kw lq @163 .com
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明 , 使用微生物产生的酶复合物或商品酶的混合液 比单独使用一种酶的效果好[ 7] 。 陈海昌等[ 8] 证明 ,
在一定范围内 , 酶作用的时间 、浓度都与原生质体的 形成率 成正 相关 , 而 与再生 率成 负相 关 。 林 红雨 等[ 9] 采用酶解 10mi n 后补加 ED T A , 改变酶解环境 中的离子强度和渗透压 , 可以提高原生质体形成率 。
余的部分称为原生质体(prot oplast), 所以植物和微 生物细胞的细胞融合实际上就是原生质体融合 。 原