(完整版)westernblot原理及操作
westernblot原理及步骤
westernblot原理及步骤Western blot原理及步骤。
Western blot（简称WB）是一种常用的蛋白质分析技术，通过检测特定蛋白在混合物中的存在和量来研究蛋白质的表达和功能。
它是一种通过特异性抗体对蛋白质进行识别和检测的方法，具有高灵敏度和高特异性的特点。
本文将介绍Western blot的原理及步骤，希望能对初学者有所帮助。
一、原理。
Western blot的原理基于蛋白质的电泳分离和免疫检测。
首先，待检样品经过SDS-PAGE凝胶电泳分离，然后将蛋白质转移到聚丙烯酰胺膜（PVDF）或硝酸纤维素膜上。
接下来，膜上的蛋白质与特异性的一抗结合，再与二抗结合，形成特定的免疫复合物。
最后，通过化学发光或染色等方法检测蛋白质的存在和量。
二、步骤。
1. 样品制备。
将待检样品加入SDS-PAGE样品缓冲液，并在100℃水浴中煮沸5分钟，使蛋白质变性。
然后冷却至室温，并离心去除沉淀物。
2. 凝胶电泳。
将样品加载到SDS-PAGE凝胶孔中，进行电泳分离。
根据蛋白质大小选择合适的分离凝胶浓度和电泳条件。
3. 转膜。
将凝胶中分离的蛋白质转移到PVDF或硝酸纤维素膜上，通常使用半干法或湿法转膜。
4. 封闭。
将转膜浸泡在牛血清蛋白（BSA）或非脂奶粉的封闭缓冲液中，阻断非特异性结合位点。
5. 抗体孵育。
将特异性的一抗加入封闭转膜的缓冲液中，孵育一定时间，使一抗与目标蛋白结合。
6. 洗涤。
用洗涤缓冲液洗涤转膜，去除未结合的一抗。
7. 二抗孵育。
将与目标蛋白特异性结合的二抗加入转膜的缓冲液中，孵育一定时间，形成特异性的免疫复合物。
8. 洗涤。
用洗涤缓冲液洗涤转膜，去除未结合的二抗。
9. 检测。
通过化学发光或染色等方法检测蛋白质的存在和量，最终得到Western blot结果。
总结。
Western blot技术是一种重要的蛋白质分析方法，具有高灵敏度和高特异性的优点。
掌握其原理及步骤对于科研工作者来说至关重要，希望本文能够对初学者有所帮助。
westernblot电泳原理及步骤
westernblot电泳原理及步骤一、概述西方印迹（w es te rnb l ot）是一种重要的蛋白质分析技术，广泛应用于分子生物学和生物化学研究中。
它通过将待检蛋白质进行SD S-P AG E电泳分离，再转移到聚合物膜上，利用特异性抗原与抗体结合的原理，检测目标蛋白质的存在与表达水平。
二、原理1.SD S-PA GE电泳分离-准备样品：将待检蛋白质样品加入去离子水、蛋白质缓冲液和还原剂混合，使蛋白质变性和解聚。
-加载样品：将样品加入聚丙烯酰胺凝胶（p ol ya cr yl am id eg e l）孔上。
-电泳分离：将准备好的凝胶置于电泳槽中，通电使蛋白质在凝胶中由负极向正极运动分离。
2.转膜-准备转膜装置：将P V DF或N C膜与吸水性纸张浸泡后，叠放在转膜装置中，并按压缩成一整体。
-预处理转膜：将转膜装置放入转渍缓冲液中浸泡，使其湿润。
-转移：将电泳完的凝胶与转膜装置层叠，加上固定层叠板，施加压力进行转膜。
3.免疫检测-封闭：将转膜后的膜置于封闭液中，阻断非特异性结合位点，减少背景信号。
-孵育：将膜与目标蛋白对应的一抗抗体孵育，使其与目标蛋白特异性结合。
-洗涤：用洗涤缓冲液洗去非特异性结合的抗体。
-二抗检测：将膜与与一抗相应的辣根过氧化物酶标记的二抗孵育，二抗与一抗结合形成复合物。
-显示：加入发色底物，与酶催化反应，生成可视化的蛋白质带谱。
三、操作步骤1.准备样品-将待检蛋白质样品加入适量去离子水、蛋白质缓冲液和还原剂混合。
-完全溶解样品，可加热至95°C处理。
2.SD S-PA GE电泳分离-准备分离凝胶：根据目标蛋白质的分子量选择合适浓度的凝胶。
-加载样品：用自动吸管或微量注射器将样品均匀地加载到聚丙烯酰胺凝胶孔上。
-启动电泳：将准备好的凝胶放入电泳槽中，加入电泳缓冲液，通电进行电泳。
3.转膜-准备转膜装置：按照转膜装置的说明书操作，准备好转膜膜和膜瓶。
-预处理转膜：将PVD F或N C膜与吸水性纸张浸泡，并放入转膜缓冲液中浸泡片刻。
Western-Blot基本原理、过程及注意事项
Western Blot基本原理、过程及注意事项原理是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测。
对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测.主要有三个过程：蛋白质电泳、转膜、检测.样品的准备样品种类主要有培养的细胞、组织(需磨碎）、特殊细胞（切割下来的肿瘤细胞）等。
1、裂解液主要有RIPA和三去污两种,RIPA适用于细胞质中蛋白检测，而三去污适用于总蛋白。
三去污又分为离子型和非离子型。
离子型的裂解能力较强如SDS等，非离子型的包括NP—40、Tritonx-100.2、裂解液的成分，3、样品缓冲液sample buffer备注:1、样品应保持低温，且实验过程应低温操作，此举为了抑制酶的活性。
裂解完后样品液会显得粘稠是长结构DNA所致，故需要匀浆，打断DNA。
一般不用超声,因为容易引起蛋白不可逆的变性。
2、用2X样品缓冲液与样品1:1混匀.4度保存。
3、样品混合液加样前需要100℃或沸水浴加热3-5分钟并迅速插入冰中，以充分变性蛋白。
配胶：胶的主要成分为丙烯酰胺和N，N’-亚甲双丙烯酰胺，应以温热（以利于溶解双丙稀酰胺)的去离子水配制含有29%(w/v)丙稀酰胺和1%（w/v)N,N'—亚甲双丙烯酰胺储存液丙稀酰胺29g,N,N—亚甲叉双丙稀酰胺1g，加H2O至100ml。
)储于棕色瓶,4℃避光保存。
4、分离胶的配方：以20ml的8﹪分离胶为例：5、浓缩胶配方：6ml为例备注：1、制胶是避免产生气泡，空气会影响胶的聚合,在蛋白质表观分子量分析时影响大.2、因为有SDS，每次混匀时不应剧烈以免产生过多气泡。
3、蛋白容易与SDS脱离而失去负电荷,因此胶中加入SDS为了给蛋白持续的负电荷。
4、垫条清洗干净，与制胶板压紧,避免漏胶。
5、制胶时，加水应缓慢不要破坏胶面,其作用：可以平衡胶面，赶气泡等。
胶固定后用滤纸吸除干净，有水跑胶时条带会歪。
6、先插梳子再灌浓缩胶。
westernblot原理及步骤
免疫印迹（Western Blot）是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测。
对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。
Western Blot技术：一、原理与Southern或Northern杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。
经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。
以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。
该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。
二、分类western显色的方法主要有以下几种：i. 放射自显影ii. 底物化学发光ECLiii. 底物荧光ECFiv. 底物DAB呈色现常用的有底物化学发光ECL和底物DAB呈色，体同水平和实验条件的是用第一种方法，目前发表文章通常是用底物化学发光ECL。
只要买现成的试剂盒就行，操作也比较简单，原理如下（二抗用HRP 标记）：反应底物为过氧化物+鲁米诺，如遇到HRP，即发光，可使胶片曝光，就可洗出条带。
三、主要试剂1、丙烯酰胺和N，N’-亚甲双丙烯酰胺，应以温热(以利于溶解双丙稀酰胺)的去离子水配制含有29%(w/v)丙稀酰胺和1%(w/v)N，N’-亚甲双丙烯酰胺储存液丙稀酰胺29g，N，N-亚甲叉双丙稀酰胺1g，加H2O至100ml。
)储于棕色瓶，4℃避光保存。
严格核实PH 不得超过7.0，因可以发生脱氨基反应是光催化或碱催化的。
使用期不得超过两个月，隔几个月须重新配制。
如有沉淀，可以过滤。
2、十二烷基硫酸钠SDS溶液:10%(w/v)0.1gSDS，1mlH2O去离子水配制，室温保存。
WesternBlot原理和操作方法（详细）
二：需要的溶液：
裂解液 Laemmli样品缓冲液
三：操作步骤：
1)培养细胞蛋白质样品的制备：
1：胰酶酶解后裂解：
细胞培养至80%左右密度时，以含0.05%胰蛋白酶消化，细胞经预冷的PBS漂洗3次，离心收集在离心管中，加入450μl裂解液反复吹打。
2：皿上直接裂解：
细胞培养至80%左右密度时，细胞经预冷的PBS漂洗3次，加入450μl裂解液，细胞刮刀收集，用移液器转移至离心管中，反复吹打。
3：尽量去除核酸，多糖，脂类等干扰分子。
4：防止蛋白质在样品处理过程中的人为的修饰，制备过程应在低温下进行，以避免细胞破碎释放出的各种酶类的修饰（建议加入合适的蛋白酶抑制剂）
westernblot原理及步骤
一、western blot 的定义：即蛋白免疫印迹( Western Blot) 是将电泳分离后的细胞或组织总蛋白质从凝胶转移到固相支持物NC膜或PVDF 膜上，然后用特异性抗体检测某特定抗原的一种蛋白质检测技术，现已广泛应用于基因在蛋白水平的表达研究、抗体活性检测和疾病早期诊断等多个方面。
二、western blot 的原理先制备蛋白质样品，再利用SDS-PAGE原理，分离不同的蛋白质，再将分离的蛋白质进行转膜，以便固定在新膜上进行抗原-抗体结合。
用固定在膜上的蛋白质作为抗原与对应的非标记抗体（一抗）结合。
由于此过程中，可能有未结合到抗原的抗体遗留，故需要清洗，以便保存特异性结合的抗原-抗体结合物。
抗原抗体结合物暴露出一个Fc片段，相应的二抗可以结合到这个片段上，形成抗原-一抗-二抗结合物，再用相应的过氧化物酶或碱性磷酸酯酶标记到二抗上，由于加入的标记物相对质量分子很大，可以用离心作用将其沉淀下来，如果抗原与抗体结合，便可以一起沉淀下来，最后通过显色反应或放射自显影法便可检测凝胶中的蛋白成分了。
三、Westernblot法操作步骤是：Westernblot第一步将被分析的蛋白样品做SDS—PAGE凝胶电泳，使样品中的蛋白质按分子量大小在凝胶中分成条带。
Westernblot法第二步把凝胶中的蛋白转移到膜上(所谓印迹)，其中用得最多的材料是硝酸纤维素膜(NC膜)和PVDF膜。
蛋白转移的方法多采用电转移，也有用吸印法转移的(原理与Southern blotting类似)电转移又有半干法和湿法之分，本实验采用后者。
bio-rad专家还提到Westernblot法最后一步是用特异性的抗体检测，看印迹膜上是否存在相应抗原。
免疫检测的方法可以是直接或间接的，现在一般都是采用间接免疫配标的方法。
在用特异性的第一抗体染色后，再用酶标的第二抗体(辣根过氧化物酶(HRP)或碱性磷酸酶(AP)标记的抗第一抗体的抗体)染色，再加酶的底物显色，通过膜上显现出的颜色或经化学发光在x光底片上出现的曙光条带来显示抗原的存在。
westernblot原理及步骤
westernblot原理及步骤一、配胶原理：30% acrylamide mix：产生凝胶的基本物质1.5M Tris(ph 8.8) ：使分离胶PH为8.8（与甘氨酸的pka接近，从而使不同分子量的蛋白产生不同的电泳速度，从而使不同分子量的蛋白分开）1.0MTris(ph 6.8)：使浓缩胶PH为6.8（可以通过甘氨酸和氯离子的作用产生压缩，从而使蛋白条带压细）10% SDS阴离子去污剂：断裂分子内和分子间氢键，破坏蛋白质二三级结构，消除蛋白质在迁移过程中结构的影响。
与蛋白质形成SDS-蛋白质复合物，由于SDS带有大量负电荷，蛋白质本身的电荷被掩盖，从而消除蛋白质迁移过程中自身电荷的差异造成的影响。
同时能够助溶，蛋白质变为亲水，容易在水相中迁移。
每克多肽可以与1.4g 去污剂结合，当分子量在15kd-200kd之间时，蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系，logMW（分子量）=K-bx（迁移率）AP：提供acr丙烯酰胺和bis亚甲丙烯酰胺聚合的氧自由基，是acr 和bis聚合的引发剂TEMED：催化AP释放氧自由基，是反应的催化剂1、清洗干净1.5mm或1mm玻璃板，检漏（有豁口和字的朝上）2、倒掉水，配10ml 10%的分离胶（1.5mm板需要7ml，1mm 板需要4.5ml）10%方案如下：H2O 4.0ml30% acrylamide mix 3.3ml1.5M Tris(ph 8.8)2.5ml10% SDS 0.1ml10% ammonium persulfate 0.1mlTEMED 0.004ml3、混合后上下摇晃，注意不要放在手中配（否则温度太高凝固的快），静置15s后用1ml枪二档吸一档打（在一角加即可，不用来回加，否则容易出气泡。
不过出气泡了也没事，加水压一下就浮上来了）4、加进玻璃板中，随后均匀来回加水到满5、等待20分钟6、倒掉水，将架子倒置过来让水排干，用纸巾擦拭斜角（一定要擦干净所有的水！否则两层胶之间出现水层就废了），同时配浓缩胶4ml H2O 2.7ml30% acrylamide mix 0.67ml1.0M Tris(ph 6.8) 0.5ml10% SDS 0.04ml10% ammonium persulfate 0.04ml TEMED 0.004ml7、加满分离胶后插入1.5mm或1mm的梳子，注意不要有气泡，等待20min二、测定蛋白浓度原理：A液是质量浓度为0.1g/mL氢氧化钠溶液（20ul protein assayS+1ml protein assay A），B液是质量浓度为0.01g/mL硫酸铜溶液。
westernblot原理及步骤
Western Blot的原理及步骤免疫印迹（Western Blot）是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测。
对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。
Western Blot是检测单一细胞蛋白表达量最好的方法；若要对表达蛋白进行细胞定位，confocal应是首选的方法，若要进行蛋白相互作用的关系，应考虑免疫共沉淀技术。
1.收集蛋白样品（Protein sample preparation）可以使用适当的裂解液裂解贴壁细胞、悬浮细胞或组织样品。
加入RIPA缓冲液（每克组织3 ml RIPA），PMSF（每克组织30μl，10mg/ml PMSF），利用Polytron进一步匀浆（15,000转/分）维持4℃。
加入PMSF（每克组织30μl，10 mg/ml PMSF），冰上孵育30分钟。
移入离心管4℃约20,000 g（约15,000转）15分钟。
上清液为细胞裂解液可分装-20℃保存。
收集完蛋白样品后，为确保每个蛋白样品的上样量一致，需要测定每个蛋白样品的蛋白浓度。
根据所使用的裂解液的不同，需要采用适当的蛋白浓度测定方法。
进行Bradford比色法测定蛋白质浓度。
【具体方法】2.电泳（Electrophoresis）（1）SDS-PAGE凝胶配制SDS-PAGE凝胶可以参考一些文献资料进行配制，【配制方法根据分离的目的蛋白的分子量大小选择凝胶浓度】（2）样品处理在收集的蛋白样品中加入适量浓缩的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。
例如2X或5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。
使用5X的SDS-PAGE 蛋白上样缓冲液可以减小上样体积，在相同体积的上样孔内可以上样更多的蛋白样品。
5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液可以参考相关文献资料配制，100℃或沸水浴加热3-5分钟，以充分变性蛋白。
（3）上样与电泳冷却到室温后，把蛋白样品直接上样到SDS-PAGE胶加样孔内即可。
westernblot原理及步骤
westernblot原理及步骤Western blot基本原理：在电场的作用下将电泳分离的多肽从SDS-PAGE凝胶转移至一种固相支持体, 然后用这种多肽的特异抗体来检测。
Western blot 应用：目的蛋白的表达特性分析；目的蛋白与其他蛋白的互作；目的蛋白的组织定位；目的蛋白的表达量分析；蛋白样品的制备：1水溶液提取法：稀盐和缓冲系统的水溶液对蛋白质稳定性好、溶解度大,是提取蛋白质最常用的的溶剂，操作相对麻烦，重复性一般；2有机溶剂提取法；3离心管柱提取法：超快速,易用,高产及重复性强；4通过层析或电洗脱法制备目的蛋白。
Western blot注意事顶和常见问题：1我的细胞提取液有的有沉淀，有的很清亮，为什么呢？答：有沉淀可能因为你的蛋白没有变性完全，可以适当提高SDS浓度,同时将样品煮沸时间延长；也不排除你的抗原浓度过高，这时再加入适量上样缓冲液即可。
2我做的蛋白质分子量很小(10 KD ),请问怎么做WB ?答：可以选择0.2 pm的膜，同时缩短转移时间。
也可以将两张膜叠在一起，再转移。
3最后显色时用DAB好还是ECM好？答：DAB有毒，但是比较灵敏，是HRP最敏感的底物;ECM结果容易控制，但被催化时灵敏度差一点，但如果达到阀值，就特别灵敏，可以检测pg级蛋白，具体可以根据你实验的情况。
4要验证某个细胞上有无该蛋白的存在■需要做免疫组化和western blot试验吗？做这两个试验时的一抗和二抗可以共用吗？答：①免疫组化可以用来进行定位，但是不能精确定量,而且有时会有假阳性，不易与背景区分；Westernblot可以特异性检测某个蛋白质分子,进行定量,但是不能定位。
②两种实验的一抗有时候不能通用，公司的产品说明一般都会说明可以进行什么实验，在免疫组化时，是否适合石蜡切片或者冰冻切片。
5细胞水平要做western blot r多少细胞提的蛋白够做western blot ?答：一般5x106就足够了。
westernblot原理及步骤
westernblot原理及步骤免疫印迹（Western Blot）是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测。
对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。
Western Blot是检测单一细胞蛋白表达量最好的方法；若要对表达蛋白进行细胞定位，confocal应是首选的方法，若要进行蛋白相互作用的关系，应考虑免疫共沉淀技术。
一、Western Blot的原理Western Blot与Southern或Northern杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。
经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。
以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。
该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。
二、操作步骤（一）蛋白质样品获得：1.所需试剂：(1)蛋白酶抑制剂mix：hjjhh储存浓度5ml mix中的加入量终浓度*PMSF（溶于乙醇）100mM 25ul 50uM*Trypsin Inhibitor 1mg/ml 250ul 50ug/ml*EGTA（pH8.0）0.5M 80ul 8mM*EDTA（pH8.0）0.5M 10ul 1mMAprotinin 1mg/ml 25ul 5ug/mlPepstatin（溶于乙醇）0.2mg/ml 50ul 10ug/mlLeupeptin 5mg/ml 100ul 0.1mg/mlBenzamidine 100mM 250ul 5mMNaF 5M 250ul 250mMNaVO4（FW183.8）0.2M 25ul 1mM注意：*代表必须加的试剂(2)细胞裂解缓冲液(培养细胞用)：1% NP40, 25 mM Hepes。
westernblot原理及过程
westernblot原理及过程
1、Western Blot的原理是：蛋白质是带电的，在聚丙烯酰胺凝胶中通过SDS-PAGE分离蛋白质后，蛋白质被固定在凝胶中。
当凝胶被转移到支持物（例如NC膜或PVDF膜）上时，蛋白质在膜上保留其电荷。
通过针对特定氨基酸序列的特异性抗体作为探针检测蛋白质的位置。
这种技术的作用是对细胞或组织提取的蛋白混合物中的某一特异蛋白进行鉴别和半定量分析。
2、Western Blot的过程大致分为以下几步：
蛋白提取：从细胞或组织中提取总蛋白质混合物。
蛋白定量：确定凝胶中蛋白质的浓度。
SDS-PAGE电泳：通过SDS-PAGE分离蛋白质混合物。
电转印：将分离的蛋白质从凝胶转移到支持物（例如NC膜或PVDF 膜）上。
封闭：用含有去污剂和牛血清白蛋白的溶液处理膜，以封闭膜上的任何未结合位点。
抗原-抗体免疫反应：使用特异性抗体检测目标蛋白质的位置。
蛋白检测：使用化学发光剂检测膜上的目标蛋白质。
Western Blot 原理和操作方法(全)
Western Blot 原理和操作方法（全）工作原理蛋白质的电泳分离是重要的生物化学分离纯化技术之一,电泳是指带电粒子在电场作用下,向着与其电荷相反的电极移动的现象.根据所采用的支持物不同,有琼脂糖凝胶电泳,淀粉凝胶电泳,聚丙烯酰胺凝胶电泳等.其中,聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)由于无电渗作用,样品用量少(1-100μg),分辨率高,可检出10-9-10-12mol的样品,凝胶机械强度大,重复性好以及可以通过调节单体浓度或单体与交联剂的比例而得到孔径不同的凝胶等优点而受到广泛的应用.SDS-PAGE是最常用的定性分析蛋白质的电泳方式,特别是用于蛋白质纯度检测和测定蛋白质分子量.PAGE能有效的分离蛋白质,主要依据其分子量和电荷的差异,而SDS-PAGE(SDS变性不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳)的分离原理则仅根据蛋白质的分子量的差异,因为SDS-PAGE的样品处理液是在要跑电泳的样品中假如含有SDS和巯基乙醇(2-ME)或二巯基赤藓醇(DTT),其可以断开半胱氨酸残基之间的二硫键,破坏蛋白质的四级结构,SDS是一种阴离子表面活性剂即去污剂,它可以断开分子内和分子间的氢键,破坏蛋白质分子的二级及三级结构,并与蛋白质的疏水部分相结合,破坏其折叠结构,电泳样品假如样品缓冲液后,要在沸水中煮3-5分钟使SDS 与蛋白质充分结合形成SDS-蛋白质复合物,SDS-蛋白质复合物在强还原剂巯基乙醇存在时,蛋白质分子内的二硫键被打开而不被氧化,蛋白质也完全变性和解聚,并形成榛状结构,稳定的存在于均一的溶液中,SDS与蛋白质结合后使SDS-蛋白质复合物上带有大量的负电荷,平均每两个氨基酸残基结合一个SDS分子,这时各种蛋白质分子本身的电荷完全被SDS掩盖,远远超过其原来所带的电荷,从而使蛋白质原来所带的电荷可以忽略不计,消除了不同分子之间原有的电荷差别,其电泳迁移率主要取决于亚基分子质量的大小,这样分离出的谱带也为蛋白质的亚基.样品处理液中通常加入溴酚蓝染料, 溴酚蓝指示剂是一个较小的分子,可以自由通过凝胶孔径,所以它显示着电泳的前沿位置,当指示剂到达凝胶底部时,即可停止电泳.另外样品处理液中也可加入适量的甘油或蔗糖以增大溶液密度,使加样时样品溶液可以沉入样品加样槽底部.重要参数①聚丙烯酰胺凝胶(PAG)制备原则:由于孔径的大小取决于单体和双体丙烯酰胺在凝胶中的总浓度(T)以及双体占总浓度的百分含量即交联度(C)决定的,因而制胶之前必须首先知道这两个参数.一般可以由下述公式计算:T%=(a+b)/m*100%; 和C%=a/(a+b)*100%其中: a=双体(bis)的重量;b=单体(arc)的重量;m=溶液的体积(ml)②当分析一个未知样品时,常常先用7.5%的标准凝胶制成4-10的梯度凝胶进行试验,以便选择理想的胶浓度.如果蛋白质的分子量已知,可参考下表选择所需凝胶浓度:蛋白质分子量范围(Da) 适宜的凝胶浓度(%)<10420-301×104-4×10415-204×104-1×10510-151×105-5×1055-10>5×1052-5蛋白分子量 (kDa)凝胶浓度 (%)4-40 20 12-45 15 10-70 12.5 15-100 10 25-2008③分离胶（5ml 体积）:5%的积层胶的配置：蛋白质的样品制备：蛋白质的样品制备是Western Blotting 的第一步，样品制备是关键步骤，要求尽可能的获得所有蛋白质，应注意以下问题：1：在合适的盐浓度下，应保持蛋白质的最大溶解性和可重复性。
生化实验九 Western_blot的原理、操作
实验九 Western blot的原理、操作及注意事项原理：通过电泳区分不同的组分，并转移至固相支持物，通过特异性试剂（抗体）作为探针，对靶物质进行检测，蛋白质的Western印迹技术结合了凝胶电泳的高分辨率和固相免疫测定的特异敏感等多种特点，可检测到低至1～5ng（最低可到10－100pg）中等大小的靶蛋白。
一、抗原的选择和制备A：样品的制备1 组织：组织的处理方法：组织洗涤后加入3倍体积预冷的PBS，0℃研磨，加入5×STOP buffer，180W，6mins，0℃超声波破碎，5000rpm，5mins 离心，取上清。
加入β-ME(9.5ml加入0.5ml)，溴酚蓝（9.5ml加入0.5ml）煮沸10min，分装后于-20℃保存，用时取出，直接溶解上样。
2 细胞：细胞的处理方法：离心收集细胞或者直接往细胞培养瓶内加入5×STOP buffer，收集，180W，6mins，0℃超声波破碎，5000rpm，5mins 离心，取上清。
加入β-ME(9.5ml加入0.5ml)，溴酚蓝（9.5ml加入0.5ml）煮沸10min，分装后于-20℃保存，用时取出，直接溶解上样。
3 分泌蛋白的提取（特例）：直接收集分泌液，加入β-ME、溴酚蓝制样。
二、SDS-聚丙烯酸胺凝胶电泳（SDS－PAGE）A：实际操作1.做胶前的准备1)检查是否有足够的、干净的 spacer、comb 和架子。
2)检查是否有新鲜的，足量10%APS，没有立刻重配。
3)按将要检测的抗体对应的原始抗原的分子量大小，计算出胶的浓度，并算出分离胶各组分的用量。
2.制胶，电泳1）装好架子。
2)按照下面配方配制分离胶。
(单位：ml，Total： 8ml)在胶上面加入一层蒸馏水，促进胶更好的凝集。
3)4)待胶凝集好后，上样，电泳。
上层胶用60-80V电压，当样品至分离胶时，用100-120V 电压。
一般电泳时间在1.5小时左右。
Western blot 实验原理和实验步骤
3 Western blot 流程图
Western Blot一般流程
1
蛋白样品的制备 SDS聚丙烯酰胺
凝胶电泳
转膜 封闭 一抗杂交 洗膜 二抗杂交 洗膜 底物显色
蛋白样品的制备
2
1、细胞的处理：1、细胞计数，取5*10^4/well，500g离心5min。加入200ul PBS混匀，500g离心5min。去掉废液加入15ul PBS 再加入5ul 5Xloading buffer， 100C煮沸10min，冰上放置5min，稍离心。
第三步：是用自特异性的抗体检测出已经印迹在膜上的所要研究的相应抗原。免疫检测 的方法可以是直接的和间接的。现在多用间接免疫酶标的方法，在用特异性的第一抗体杂 交结合后，再用酶标的第二抗体（碱性磷酸酶（知AP）或辣根过氧化物酶（HRP）标记的 抗第一抗体的抗体）杂交结合，再加酶的底物显色或者通过膜上的颜色或 X 光底片上暴光 的条带来道显示抗原的存在。该技术被广泛应用于蛋白表达水平的检测中。
Western blot 实验原理和实验步骤
为什么要做蛋白质印迹实验？
研究一些体外的蛋白质分子，寻找目的蛋白是否存在样品当中 蛋白质的表达情况，上调或下调表达，在不同的样品中，样品之间的表达差异性。
目录
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Western blot 基本原理
2
蛋白免疫印迹的组成
3
Western blot 一般流程
洗膜 用 TBST摇动洗三次，每次10min。 洗涤是为了洗去一抗与抗原的非特异性结合，洗涤的效果直接影响结 果背景的深浅。
二抗杂交
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1、将PVDF膜放在密闭的自封袋或抗体盒中，加入稀释好的荧光二抗， 孵育 RT 0.5小时。（ 一般采用HRP标记的二抗，稀释比例参照说明书） 注：二抗的稀释比例不能太低，否则容易导致非特异性的结合。
westernblot原理及步骤
1.western blot即蛋白免疫印迹( Western Blot) 是将电泳分离后的细胞或组织总蛋白质从凝胶转移到固相支持物NC膜或PVDF 膜上，然后用特异性抗体检测某特定抗原的一种蛋白质检测技术，现已广泛应用于基因在蛋白水平的表达研究、抗体活性检测和疾病早期诊断等多个方面。
2.原理简单来说就是原理是通过特异性抗体对凝胶电泳处理过的细胞或生物组织样品进行着色。
通过分析着色的位置和着色深度获得特定蛋白质在所分析的细胞或组织中表达情况的信息。
Western Blot与Southern印迹杂交或Northern印迹杂交方法类似,但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳,被检测物是蛋白质,“探针”是抗体,“显色”用标记的二抗.经过PAGE分离的蛋白质样品,转移到固相载体（例如硝酸纤维素膜NC膜）上,固相载体以非共价键形式吸附蛋白质,且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变.以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原,与对应的抗体起免疫反应,再与酶或同位素标记的第二抗体起反应,经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。
该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。
3.分类Western Blot显色的方法主要有以下几种：i.放射自显影ii.底物化学发光ECL iii.底物荧光ECF iv.底物DAB呈色现常用的有底物化学发光ECL和底物DAB呈色,体同水平和实验条件的是用第一种方法,目前发表文章通常是用底物化学发光ECL.只要买现成的试剂盒就行,操作也比较简单,原理如下（二抗用HRP标记）：反应底物为过氧化物+鲁米诺,如遇到HRP,即发光,可使胶片曝光,就可洗出条带.4.其他值得一提的是,western blot 这个名称的由来很有意思.最开始做印迹工作的是一个叫做Southern的科学家,但印迹的对象是DNA 链,他把这种技术称为Southern blot,后来类似的出现了两个过程相似,但是对象不同的印迹方法,一个针对RNA,一个对蛋白质,人们分别把这两种技术的称为Northern和Western,与这两个技术的发明人没有关系了.。
westernblot原理及步骤
westernblot原理及步骤蛋白免疫印迹即Werstern blot，是将印迹技术与抗原-抗体反应的特异性相结合的检测技术，用于分离和检测生物标本中的某一特定蛋白。
其基本原理实混合蛋白质样本通过凝胶电泳分离后，通过特殊虹吸或电场装置印迹至固相介质（NC膜或PVDF 膜）上，将针对待测蛋白的特异性抗体作用于滤膜上，利用抗体上偶联的酶降解底物在滤膜上生成有色沉淀物或化学发光产物，从而显示出待测蛋白的存在及量。
Western blot原理通过电泳区分不同的组分，并转移至固相支持物，通过特异性试剂（抗体）作为探针，对靶物质进行检测，蛋白质的Western印迹技术结合了凝胶电泳的高分辨率和固相免疫测定的特异敏感等多种特点，可检测到低至1～5ng（最低可到10－100pg）中等大小的靶蛋白。
Western blot实验步骤一、样本制备1、样本的来源：细胞培养上清；细胞（胞浆蛋白、胞膜蛋白、胞核蛋白）；组织匀浆2、不同样本有不同的提取方式：蛋白完全裂解液、RIPA、胞核/胞浆3、蛋白的提取：裂解前加入蛋白酶抑制剂、磷酸酶抑制剂使其终浓度为1mM4、蛋白定量：BCA检测法(灵敏度高，操作简单，常用)、Bradford 检测法、Lowry 检测法、UV测量、电泳检测5、样本上样前的处理：蛋白提取液和SDS上样缓冲液（Loading buffer）以一定的比例上样6、蛋白变性：95-100℃变性5分钟（为了能使抗体接触到抗原表位，必须将蛋白的三维结构打开，因此需要将蛋白变性，核蛋白要增加裂解液体积和超声破碎次数，煮样时间延长至10-15min）二、上样与电泳原理：裂解后的蛋白质样本经过高速离心去除不溶物后，再经SDS上样缓冲液95-100℃变性5分钟，使带有强负电荷的SDS与带有弱电荷的蛋白质结合，大量的SDS可掩盖蛋白质本身的电荷量，只显示SDS的负电荷，在pH8.6~pH8.8的Tris-甘氨酸不连续SDS-PAGE（聚丙烯酰胺凝胶）系统中，蛋白质的电泳与自身电荷量无关，只和其分子大小有关，从而将蛋白质按分子量大小顺序分离。
westernblot原理及步骤
westernblot原理及步骤Western Blot法采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。
经过PAGE（聚丙烯酰胺凝胶电泳）分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。
以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。
该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。
一、原理与Southern或Northern杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。
经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。
以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。
该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。
1、甲醇活化PVDF膜10min原理：PVDF膜是疏水性的，膜孔径有大有小，随着膜孔径的不断减小，膜对低分子量的蛋白结合就越牢固。
大于20000的蛋白选用0.45um的膜，小于20000的蛋白选用0.2um的膜。
PVDF膜在使用时需预处理，用甲醇处理的目的是活化膜上的正电基团，使其更容易与带负电的蛋白结合。
2、制备1xtransferbuffer（冰上保存）10xtransferbuffer：tris 30.3g+Glycine144g+ddH20到1L11xtransferbuffer：100ml10xtransferbuffer（一般都放在冷室里）+100ml甲醇（一般都在通风橱）+800mlddH203、关闭电源，取出胶，切去不用的区域，并在左上角做标记（目的是标记第一个条带的上方。
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Joule Heating
Q=W=PT=UIT=
非纯电阻电路:Q<W
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
resistance Heat
inconsistent field strength and transfer lose its buffering capacity
cause the gel to melt/ stick to the membrane/条带出现波浪状
4. Determination of protein concentration
变性
➢解聚/氧化还原 ➢暴露抗原表位（表位可能位于3D构象的内部）
5. Preparation of samples for loading into gels ➢ Loading buffer ➢ Volume ➢ Amount: 30-50ug 过犹不及，内参粘连，荧光灼烧式淬灭
Electrophoresis
➢ 显微电泳 ➢ 自由界面电泳 ➢ 区带电泳
1.支持物的物理性状： （1）纸电泳 （2）粉末电泳 （3）凝胶电泳 （4）缘线电泳 2．支持物的装置形式： （1）平板式电泳 （2）垂直板电泳 （3）柱状（管状）电泳： 3．pH的连续性： （1）连续pH电泳 （2）非连续pH电泳
B.Electrophoresis
交联剂
催化剂 助凝剂
使每个蛋白的起跑线相同，提高解析度
Acry Pore size 高浓度胶 小分子量 低浓度胶 大分子量
液封 ：沿玻板流下，避免产生气泡；动作轻慢 0.5-1h凝胶
Clean thoroughly
缓冲液的离子强度 Check the pH; it should be around 8.3
➢ 阳性对照 ➢ Marker
✓ enable the determination of the protein size ✓ monitor the progress of an electrophoretic run
➢ 内参 未染色(pre mixed) 预染Marker(pre-stained): 单色预染、多色预染
Electrophoresis
➢ 电荷 ➢ 分子量
SDS
➢ 阴离子去污剂
➢ 蛋白质：SDS---1:1.4 ➢ 破坏蛋白质的二级和三级结构
Β-巯基乙醇/DTT ➢ 强还原剂
➢ 破坏蛋白质的四级结构
带负电荷的蛋白质-SDS复合物
蛋白质-SDS胶束
Part2: Operating steps
A. Sample preparation B. Electrophoresis C. . Transfer of proteins and staining D.Detection
➢ Western blotting identifies with specific antibodies proteins that have been separated from one another according to their size by gel electrophoresis.
纯化好的蛋白混合物，与染料共价偶联
选择宽范围，条带分布均匀的Marker
内参：确保等量上样
C. Transfer of proteins and staining
C. Transfer of proteins and staining
Two basic electrical equations ➢ Ohm’s law： V = I x R (The resistance is inherent in the system) ➢ Power equation: P = I x V = I2 x R = V2/R
Glycerol ：increase the density of the sample to be loaded Bromophenol blue: a small anionic dye molecule During protein sample treatment the sample should be mixed by vortexing before and after the heating step for best resolution
Transfer buffer 有效地从胶上洗脱蛋白，将蛋白结合到膜上
Tris: 保持导电性、缓冲体系的PH
促进SDS从蛋白上洗脱
methanol 促进蛋白结合到膜上
SDS
降低蛋白从胶中洗脱
High qualityotherwise High conductivity
Poor transfer
Part3: Troubleshooting
A.High background
B.No/Weak signal
Part1: Experiment Principle
➢ The immobilization of proteins onto a membrane, and the subsequent detection by proteinspecific binding and detection reagents
A. Sample preparation
Denaturing detergent/离子型 ：SDS, deoxycholate Less denaturing detergent/非离子型 : Triton x-100, NP-40
短期4℃保存，长期-20℃保存
2. Protease and phosphatase inhibitors As soon as lysis occurs, proteolysis, dephosphorylation and denaturation begin.
Western Blot
catalogue
Part1: Experiment Principle Part2: Operating steps
A. Sample preparation B. Electrophoresis C. Transfer of proteins and staining D.Detection