冷冻干燥的保护剂及添加剂
兽用疫苗保护剂和佐剂
兽医生物制品常用的保护剂
1．5%蔗糖（乳糖）脱脂乳保护剂
蔗糖（或乳糖） 5g，加脱脂乳至 100ml，充分溶解后，110~116℃高压灭菌 30~40 min。
2．明胶蔗糖保护剂
明胶 2%~3%（g/m1）、蔗糖5%（g/m1）、硫脲 1%~2%（g/m1）。先 将 12%~18%明胶液、 30%蔗糖液和 6%~12%硫脲液加热溶解， 116℃高压 灭菌30~40min；
1. 营养液： • 可修复因冻干而受损的细胞，使冻干制品含有一定量水分；
• 可促进高分子物质形成骨架，使冻干制品呈多孔的海绵状，
增加溶解度 2. 赋形剂： • 防止低分子物质的碳化和氧化，保护活性物质不受加热影响 • 使冻干制品形成多孔性、疏松的海绵状物，增加溶解度 3. 抗氧化剂： • 抑制冻干制品中的酶作用，增加生物活性物质在冻干后贮存
7．脂质分子类佐剂：脂多糖、Vit A和Vit E等脂溶性维生素
8．其他：霍乱毒素（CT）、百日咳毒素（PT）和破伤风类 毒素（TT）等；脂磷壁酸（LTA）；维生素B12等。
氢氧化铝胶 (铝胶）
合成方法:
（1）用铝粉加烧碱合成法
2Al(OH)3+12H2O+3H2SO4→Al2(SO4)3· 18H2O
兽用疫苗冻干保护剂 和佐剂
冻干保护剂（稳定剂）
保护剂：又称稳定剂（stabilizer） ，是指一类能防止生 物活性物质在冷冻真空干燥时受到破坏的物质。（指对疫 苗生产、血清制备等） 保护剂用途（不同用途加不同保护剂, 主要针对活的微生 物或细胞） ① 菌种或毒种保存：常用甘油作保护剂 ② 细胞株保存：常用二甲基亚砜(DMSO) DMSO:二甲基亚砜，一种细胞的保护剂 ③ 疫苗冷冻真空干燥制备时：加脱脂乳（或二甲基亚 砜）和蔗糖等（不同国家有不同配方） ④ 干扰素类生物活性物质的保存：加葡聚糖
冷冻干燥过程中保护剂对脂质体粒径影响的实验研究
冷冻干燥过程中保护剂对脂质体粒径影响的
实验研究
冷冻干燥是一种常用的制备脂质体的方法，但该过程中脂质体容易发生聚集和脱水等问题。
为了解决这些问题，可以向冻干液中添加保护剂。
在实验中，可以选择不同的保护剂，并对脂质体的粒径进行测定。
常用的保护剂包括蔗糖、甘露醇和羟丙基-β-环糊精等。
实验步骤如下：
1. 制备脂质体悬浮液：根据所需的脂质体组成，将所需的磷脂和胆固醇等溶解在有机溶剂中，并用旋转蒸发仪将有机溶剂蒸发干净，制得脂质体固体膜。
随后，向固体膜中加入含磷酸盐缓冲液，使其形成悬浮液。
2. 冷冻：将脂质体悬浮液分装到合适的容器中，然后将容器放入液氮中进行冷冻。
冷冻速度要尽可能快，以避免脂质体的聚集。
3. 冻干：将冷冻后的样品置于真空条件下，使用冻干机进行冻干。
通过升温并施加负压，将样品中的水分从冰晶直接转化为气态，使样品变得干燥。
4. 粒径测定：使用粒径分析仪，如动态光散射仪（DLS）或激光衍射仪等，测定冷冻干燥后脂
质体的粒径。
可以比较不同保护剂条件下的粒径差异。
通过以上实验，可以得到不同保护剂对脂质体粒径的影响。
保护剂可提供一定的保护作用，减少脂质体的聚集和脱水现象，从而得到较为均匀的粒径分布。
不同保护剂的选择可以根据所需的应用和研究目的进行优化。
兽用疫苗保护剂和佐剂讲解
一些常用的冷冻干燥保护剂
分类
保护剂
复合物 糖类 盐类 醇类 酸类 聚合物
脱脂乳、明胶、蛋白质、蛋白胨、糊精、血清、甲基纤维素等 蔗糖、乳糖、麦芽糖、葡萄糖、果糖等 乳酸钙、谷氨酸钠、氯化钠、氯化钾、醋酸铵、硫代硫酸钠等 山梨醇、甘油、甘露醇、肌醇、木糖醇等 柠檬酸、酒石酸、氨基酸等 葡聚糖、聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮 (PVP) 等
助于抗原性物质在胞内被加工，被 MHC 分子特异性的结合、保护、运输并递 呈给效应细胞。
②抗原寻的（ antigen targeting ）
指抗原传递给免疫系统中适当效应细胞的效率。包括 吸引巨噬细胞到达组织部位、活化吞噬细胞、促进抗原 与细胞受体的结合等有重要作用。
③免疫调节（immune modulation ） 是指任何可以修饰的免疫效应细
２、保护剂浓度：严格按照配方执行。 ３、保护剂配制方法：糖类不能用121℃高压灭菌处理。 ４、保护剂酸碱度（PH 值）：主要对M的影响。
三、常用的冻干保护剂（稳定剂） 明确不同种类微生物需要添加不同保护剂
（一）细菌的保护剂 ① 需氧或兼氧厌氧菌：５％蔗糖脱脂乳或５％蔗糖、 1.5％明胶； ② 厌氧性细菌：含1.5％谷氨酸钠的１％乳糖或10％脱 脂乳或7.5％葡糖血清。 注：脱脂乳：20％脱脂奶粉溶于水配制而成。
疫苗冻干保护剂组成
1. 营养液： ? 可修复因冻干而受损的细胞，使冻干制品含有一定量水分； ? 可促进高分子物质形成骨架，使冻干制品呈多孔的海绵状， 增加溶解度 2. 赋形剂： ? 防止低分子物质的碳化和氧化，保护活性物质不受加热影响 ? 使冻干制品形成多孔性、疏松的海绵状物，增加溶解度 3. 抗氧化剂： ? 抑制冻干制品中的酶作用，增加生物活性物质在冻干后贮存 期间的稳定性，如维生素C、维生素E和硫代硫酸钠等。
冻干保护剂的筛选
冻干保护剂的筛选
一、材料、仪器：
2ml装的蛋白原液、1000iu/ml青链霉素、伊利高蛋白脱脂高钙奶粉、蔗糖、高压蒸汽灭菌锅、真空冷冻干燥机
脱脂奶粉配料表：
配料：脱脂牛奶、食品添加剂：大豆磷脂
维生素：维生素A醋酸酯、胆钙化醇、维生素E醋酸酯、抗坏血酸。
二、方法：
表1 冻干剂配方
1、在超净工作台中用三角烧瓶中按表1配方配好保护剂，混匀，包好，放入高压蒸汽灭菌锅中，115℃高压灭菌30分钟；
2、高压后取出，加抗原，即与1000 iu/ml青链霉素按1：1比例混合；
3、分装：摇匀后，与蛋白原液按1：1的比例按分装于高压过的玻璃瓶中；
4、预冻：将分装好的玻璃瓶放于-70℃冰箱预冻2h；
5、冻干：预冻完成后，将瓶盖拔开一些，将青霉素瓶转移到预冷过的冷冻干燥机内进行冻干；
6、冻干进行中，注意观察样品冻干的状态和结构，如形成乳白色疏松多孔的海绵状物质即可取出，放于-20℃保存备用；
7、观察各瓶的形态、外观，进行效价的测定。
8、活性测定，包括CEF成纤维细胞的培养，接种VSV病毒，以及结果的判定。
鸡传染性法氏囊病病毒X-28弱毒株的致病性试验。
冷冻干燥工艺
冷冻干燥工艺本工艺适用于细菌、酵母等菌体的冷冻干燥。
冻干后物品为固态、干燥、结块，保存应低温避湿。
1．工艺流程图保护剂配制→菌体与保护剂混合→分装入柜→冷冻干燥→出柜→保存2．操作过程及要点：2.1保护剂配制：按照保护剂配方（见附录），根据菌体重量计算和称取试剂，加入适量的水搅拌溶解（水的体积以能溶解保护剂为准）。
2.2菌体与保护剂混合：保护剂溶液完全溶解后，加入菌体，搅拌混匀。
2.3 分装入柜：用量杯量取一定体积（通常为1L）的菌液到托盘上，轻微晃动托盘，使物料均匀分布在托盘上。
将托盘置于隔板上，放置温度探头，每层放一个探头，探头需接触到菌液。
2.4冷冻干燥：2.4.1物料冷却：物料降温后，温度在-40℃～-50℃间冷却3-4小时后开始抽真空。
2.4.2升华：分三阶段第一阶段，快速升温阶段，物料温度由-50℃降至-30℃，升温速度控制在10℃～5℃/小时（通过间隙开循环泵来实现）。
第二阶段，温度维持阶段，物料温度维持在-30℃～-25℃间（通过间隙开循环泵来实现），维持时间为10小时，第三阶段，快速升温阶段，物料温度由-25℃升至20℃，升温速度控制在5℃/小时（开自动加热）。
2.5出柜：收集冻干菌体，取样，并贴上标签。
2.6保存：菌体置于-20℃冰箱保存，填写物品保存记录。
3．生产过程的质量控制●配制保护剂的水体积不能太多，以能溶解保护剂为宜。
●保护剂必须完全溶解后方可加入菌体混匀。
●每个托盘的装液量不要大于1L。
●物料冷却时间控制在3-4小时，时间不宜过长。
●升华过程的温度维持阶段，间断开循环泵，频率控制在每小时两次以上。
●出柜物品必须贴上标签。
4．物料、中间产品、成品的质量标准。
保护剂和菌体混匀后取样；出柜物品取样。
5．卫生●使用前清洗隔板；●每批冻干完后，用水泡洗托盘（若下批次冻干物品与上批冻干物品相同，可不用清洗），冲洗隔层板，清洗温度探头。
●每次使用完搅拌机后应立即清洗。
6．冻干失败物品处理：若冻干失败的物品数量多（10盘以上），应重新进行冷冻干燥。
冷冻干燥的保护剂和添加剂解读
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5.1 冻干过程和储藏过程的变性机理 1. 冷冻和干燥过程
在生物制品的冷冻干燥过程中，主要有三种效应会导致生物制 品中活性组分的变性：低温效应、冻结效应和脱水效应。
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第五章 冷冻干燥的保护剂和添加剂
冻干过程和储藏过程的变性机理 冷冻干燥保护添加剂的分类 糖/多元醇类保护剂 聚合物类保护剂 表面活性剂类、氨基酸类的保护剂
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• 如前所述，生物制品的冷冻干燥过程是一个多步骤过 程，会产生低温、冻结和脱水等多种效应；即使成功 完成冷冻干燥过程后，在长期保存过程中也很难保证 冻干生物制品活性组分的稳定性。为了防止生物制品 在冷冻干燥和贮藏过程中活性组分的变性，研究者们 研究和探索了大量有效的保护添加剂。
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• 冻结效应（包括离子浓度的增加、冰晶的形成与生长、pH值变化 以及相分离等 ）
（1）在生物制品的冻结过程中，不断结晶会导致溶液的浓度快速 升高。小分子糖在最大冻结浓缩基质中的计算浓度高达80%。当 溶液浓度发生变化时，离子浓度增加，促进了化学反应。
冷冻干燥的保护剂和添加剂
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5.1 冻干过程和储藏过程的变性机理 1. 冷冻和干燥过程
在生物制品的冷冻干燥过程中，主要有三种效应会导致生物制 品中活性组分的变性：低温效应、冻结效应和脱水效应。
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• 在食品、药品以及生物体的冷冻干燥和贮藏过程中，很多因素 （例如，化学成分、冻结速率、冻结和脱水应力、玻璃化转变 温度、干燥固体中剩余水分、贮藏环境的温度和湿度等）都会 影响其中活性组分的稳定性甚至会导致失活。 • 大量的实验研究表明，除了一些食品、人血浆、牛奶等少数物 除了一些食品、人血浆、 除了一些食品 料可以直接冷冻干燥外；大多数的药品和生物制品，都需要添 料可以直接冷冻干燥外；大多数的药品和生物制品， 加合适的冷冻干燥保护剂和添加剂， 加合适的冷冻干燥保护剂和添加剂，配制成混合液后，才能进 行有效的冷冻干燥和贮藏。
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2. 储藏过程
• 蛋白质凝聚：是冻干生物制品活性组分在贮藏过程中发生变 蛋白质凝聚： 性的主要因素之一。导致蛋白质凝集可能是物理（非共价） 相互作用，也可能是蛋白质发生化学凝集（共价）。 • 脱酰胺作用：也是蛋白质发生变性的主要途径之一。天冬酰 脱酰胺作用： 胺（Asn）和谷氨酰胺（Gln）是蛋白质中易于发生脱酰胺作 用的两种氨基酸。 • 非酶褐变：也称作Maillard反应。它使得还原性糖（如葡萄糖） 非酶褐变： 与蛋白质中的赖氨酸（lysine）和精氨酸（arginine）形成碳水 络合物。 • 氧化反应：蛋白质中蛋氨酸Met，胱氨酸Cys，组氨酸His，色 氧化反应： 氨酸Trp和酪氨酸Tyr残基的侧链是发生氧化反应的可能位置。 • 水解作用 虽然冻干的蛋白质中含有极少量的水分，但在贮藏 水解作用: 过程中仍然会发生水解作用。
兽用疫苗保护剂和佐剂讲解
②抗原寻的（antigen targeting）
指抗原传递给免疫系统中适当效应细胞的效率。包括 吸引巨噬细胞到达组织部位、活化吞噬细胞、促进抗原 与细胞受体的结合等有重要作用。
③免疫调节（immune modulation） 是指任何可以修饰的免疫效应细
（二）病毒的保护剂 ① 5%蔗糖 脱脂乳； ② 马立克814活细胞疫苗:保存液氮.稳定剂为10%二 甲基亚砜和50%犊牛血清的199液。 注意: 微生物保护剂缓冲液的组成比例，不同厂家有 不同的配方。
兽医生物制品常用的保护剂
1．5%蔗糖（乳糖）脱脂乳保护剂
蔗糖（或乳糖）5g，加脱脂乳至100ml，充分溶解后，110~116℃高压灭菌 30~40 min。
一些常用的冷冻干燥保护剂
分类
保护剂
复合物 糖类 盐类 醇类 酸类 聚合物
脱脂乳、明胶、蛋白质、蛋白胨、糊精、血清、甲基纤维素等 蔗糖、乳糖、麦芽糖、葡萄糖、果糖等 乳酸钙、谷氨酸钠、氯化钠、氯化钾、醋酸铵、硫代硫酸钠等 山梨醇、甘油、甘露醇、肌醇、木糖醇等 柠檬酸、酒石酸、氨基酸等 葡聚糖、聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)等
• 注意:佐剂和免疫增强剂的关系?
•
有时佐剂也是免疫增强剂.
作用特点：
① 明显增强抗原性微弱的物质诱导机体产生 特异性免疫应答。
② 用最少的抗原和最少的接种次数，产生足 够的免疫应答。
免疫佐剂作用机理
作用方式
① 改变正常免疫机能，吸引大量巨噬细胞以吞噬抗原； ② 改变抗原的构型，使抗原物质降解，并加强其免疫原性； ③ 延长抗原在组织内的贮存时间，使抗原缓慢降解和缓释，
冷冻干燥的保护剂和添加剂
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2. 储藏过程
• 蛋白质凝聚：是冻干生物制品活性组分在贮藏过程中发生变 性的主要因素之一。导致蛋白质凝集可能是物理（非共价） 相互作用，也可能是蛋白质发生化学凝集（共价）。 • 脱酰胺作用：也是蛋白质发生变性的主要途径之一。天冬酰 胺（Asn）和谷氨酰胺（Gln）是蛋白质中易于发生脱酰胺作 用的两种氨基酸。 • 非酶褐变：也称作Maillard反应。它使得还原性糖（如葡萄糖） 与蛋白质中的赖氨酸（lysine）和精氨酸（arginine）形成碳水 络合物。 • 氧化反应：蛋白质中蛋氨酸Met，胱氨酸Cys，组氨酸His，色 氨酸Trp和酪氨酸Tyr残基的侧链是发生氧化反应的可能位臵。 • 水解作用: 虽然冻干的蛋白质中含有极少量的水分，但在贮藏 过程中仍然会发生水解作用。
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• 如前所述，生物制品的冷冻干燥过程是一个多步骤过 程，会产生低温、冻结和脱水等多种效应；即使成功 完成冷冻干燥过程后，在长期保存过程中也很难保证 冻干生物制品活性组分的稳定性。为了防止生物制品 在冷冻干燥和贮藏过程中活性组分的变性，研究者们 研究和探索了大量有效的保护添加剂。
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5.3 糖/多元醇类保护剂 1. 糖和多元醇的定义
冻干保护剂
保护剂一般为葡萄糖、甘露醇。
是为了保证冻干过程的顺利进行和调节渗透压的，增溶剂一般是根据你的具体药物去选择，这些都是在冻干前溶液中添加的，一般加泊洛沙姆之类的，以前做过一冻干粉加的是葡甲胺冻干保护剂有很多，包括蔗糖，乳糖，甘露醇等，一般的用量都在5%，我做过比较，貌似还是甘露醇的保护效果好，当然你也可以几个冻干保护剂连用。
引言由于冻干药品呈多孔状、能长时间稳定贮存、并易重新复水而恢复活性，因此冷冻干燥技术广泛应用于制备固体蛋白质药物、口服速溶药物及药物包埋剂脂质体等药品。
从国家药品监督管理局数据库得知，目前国内已有注射用重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子、注射用重组人干扰素α2b、冻干鼠表皮生长因子、外用冻干重组人表皮生长因子、注射用重组链激酶、注射用重组人白介素-2、注射用重组人生长激素、注射用A群链球菌、注射用重组人干扰素α2b、冻干人凝血因子VⅢ、冻干人纤维蛋白原、间苯三酚口服冻干片等冻干药品获准上市。
截止2000年2月，美国FDA已批准的生物技术药共计76个。
冷冻干燥技术最早于1813年由英国人Wollaston发明。
1909年Shsckell试验用该方法对抗毒素、菌种、狂犬病毒及其它生物制品进行冻干保存，取得了较好效果。
在第二次世界大战中，对血液制品的大量需求大大刺激了冷冻干燥技术的发展，从此该技术进入了工业应用阶段。
此后，制冷和真空设备的飞速发展为快速发展冷冻干燥技术提供了强有力的物质条件。
进入上个世纪的***十年代，科学技术的迅猛发展和人民群众对健康保障的需求为药品冷冻干燥技术的飞速发展提供了强大的动力，在药品冻干损伤和保护机理、药品冻干工艺、药品冷冻干燥机等方面取得了巨大的成绩。
但药品冷冻干燥技术是一门边缘学科，需要生物学、药学、制冷、真空和控制等知识的交叉和综合，因此仍存在亟待解决的问题。
2 药品冷冻干燥原理及特点药品冷冻干燥是指把药品溶液在低温下冻结，然后在真空条件下升华干燥，除去冰晶，待升华结束后再进行解吸干燥，除去部分结合水的干燥方法。
蛋白药物冻干保护剂分类
1欣谕冻干前言欣谕冷冻干燥广泛用于制备治疗性蛋白质制剂，蛋白冻干制剂可以提供更好的保质期，方便药物的储藏和运输，然而，蛋白在冻干过程中存在许多应力，包括低温应力、冻结应力(枝状冰晶的形成、离子强度的增加、pH值的改变、相分离等)、干燥应力(失去蛋白质表面水分子)等，这些应力常常直接或间接导致蛋白质类药物失去天然构象从而变性或失活。
所以即使采用了冷冻干燥这种温和的干燥方式，还需要加入合适的冻干保护剂以很好的保护蛋白稳定性。
冷冻干燥保护剂对于蛋白质的保护原理已经被研究讨论了几十年，形成了一些被普遍接受的共识。
如在冻结阶段，最主要的假说为“优先化作用”;在干燥阶段最主要的有2种假说，即“玻璃化”和“水置换”。
冷冻干燥保护剂的分类方式很多，有文献中提出了一个公式化模型，按照功能把冷冻干燥保护剂分类，包括5类: ①pH缓冲剂，如Tris、组氨酸、枸橼酸等;②配体，可以优化蛋白质的热力学稳定性;③稳定剂，一般是双糖，如蔗糖、海藻糖等，可通过抑制蛋白质的展开和提供玻璃基质起保护作用;④非离子表面活性剂，可减少蛋白质的聚集;⑤填充剂，如甘露醇、甘氨酸、羟乙基淀粉、血清白蛋白等，可提高产品的物理成型性。
这里我们简要介绍其中几种。
2缓冲盐首先，蛋白质稳定性受环境pH的影响，缓冲液选择在蛋白质制剂的开发过程中是最关键的，并且必须在配制阶段建立。
在选择缓冲液pH时，建议pH不要太接近蛋白质的pI(等电点)以避免聚集。
磷酸盐是蛋白质配方中最常见的缓冲剂之一，特别是含水蛋白质药物，有效pH 值范围为5.8-8.0，并且具有生物相容性。
然而，正如“冷冻过程中的pH变化”所讨论的那样，磷酸盐缓冲液，特别是磷酸氢二钠，在冷冻过程中会发生显着的pH变化，因此不推荐用于pH敏感蛋白质。
相反，磷酸钾，组氨酸，三羟甲基氨基甲烷(Tris)和柠檬酸盐缓冲液在冷冻期间显示出最小的pH变化。
此外，低缓冲液浓度可有助于降低pH变化。
组氨酸是一种氨基酸，有效pH范围为5.5-7.4，它与生物pH相容，并且经常用于冷冻干燥的蛋白质。
冻干保藏技术
School of veterinary medicine， YZ university
Yangzhou University
5、预冻
• 菌株一般在-20℃条件下预冻24h • 病毒在-70℃预冻24h
Yangzhou University
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10、复苏方法：
• 先用70%酒精棉花擦拭冻菌管尤其是中部； • 将冻菌管顶部在酒精灯外焰灼烧；
• 用砂轮在中部划开。
• 用培养液溶解菌块，无菌吸管吹匀，无菌操作玻尔环沾取
Yangzhou University
6、冷冻干燥
• 采用冷冻干燥机进行冷冻干燥。 • 将冷冻后的样品冻菌管置于冷冻干燥机的干燥箱内， 开始冷冻干燥，时间一般为8-20小时。 • 终止干燥时间应根据下列情况判断： a 冻菌管内冻干物呈酥块状或松散片状 b 真空度接近空载时的最高值 c 样品温度与管外温度接近 • 冷冻干燥完毕后，取出样品冻菌管置于干燥器内，备 用。
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2、保护剂的选择和准备 • 保护剂种类要根据微生物类别选择。菌种/毒种冻存选 用蔗糖脱脂奶。 • 蔗糖是一种耐热冻干保护剂，在冻结和干燥过程中， 可防止活性组分变性； • 脱脂奶粉可促进升华。
菌液在培养基平板上三区划线，或直接取部分菌液滴在新
冷冻干燥的保护剂和添加剂
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பைடு நூலகம்
• 在冷冻干燥配方中，除了活性组分和溶剂以外，还要使用多 种添加剂。这些添加剂，有的被称为保护剂,有的被称为添加剂， 而又有的被称为赋形剂（excipient），至今没有统一的叫法。赋形 剂一词来源于药剂学，原来是指构成药物或抗原的无活性物 质辅料 (如阿拉伯胶、糖浆、淀粉)，特别是指在药物混合物 中有大量液体情况下，为使混合物有较高的粘性，以便制备 丸剂或片剂而加入的物质。而后来，赋形剂的名称被扩大了。根
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2. 储藏过程
• 蛋白质凝聚：是冻干生物制品活性组分在贮藏过程中发生变 性的主要因素之一。导致蛋白质凝集可能是物理（非共价） 相互作用，也可能是蛋白质发生化学凝集（共价）。 • 脱酰胺作用：也是蛋白质发生变性的主要途径之一。天冬酰 胺（Asn）和谷氨酰胺（Gln）是蛋白质中易于发生脱酰胺作 用的两种氨基酸。 • 非酶褐变：也称作Maillard反应。它使得还原性糖（如葡萄糖） 与蛋白质中的赖氨酸（lysine）和精氨酸（arginine）形成碳水 络合物。 • 氧化反应：蛋白质中蛋氨酸Met，胱氨酸Cys，组氨酸His，色 氨酸Trp和酪氨酸Tyr残基的侧链是发生氧化反应的可能位置。 • 水解作用: 虽然冻干的蛋白质中含有极少量的水分，但在贮藏 过程中仍然会发生水解作用。
04 冷冻干燥保护剂
冻干保护剂一、冻干损伤机理：蛋白质冷冻干燥全过程分为预冻、第一阶段升华干燥和第二阶段再干燥。
预冻过程中水结冰时体积增大，致使活性物质活性部位中一些由弱分子力键连接的键遭到破坏，从而使活性损失；另外，水结冰后引起溶质浓度上升以及由于各种溶质在不同温度条件下溶解度变化不一致而引起pH值的变化，导致活性物质所处的环境发生变化而造成失活或变性。
二、冻干保护作用机理：第一，“水替代假说”：认为由于蛋白质分子中存在大量氢键，结合水通过氢键与蛋白质分子联结。
当蛋白质在冷冻干燥过程中失去水分后，蛋白的主相变温度会升高，发生变性。
但某些糖类属于亲水性物质，形成氢键能力较强，能替代蛋白表面的水的羟基，与蛋白质中的极性基团形成氢键，使得蛋白的主相变温度变化不大，低于操作温度，从而避免了生物活性物质由于发生相变所造成的机械损伤。
能够直接测量到冻干的蛋白质与保护剂蔗糖间的氢键。
第二，“玻璃态假说”：认为在含糖溶液的干燥过程中，糖-水混合物会玻璃化，兼有固体和流体的行为，粘度极高，不容易形成结晶；且分子扩散系数很低，因而具有粘性的保护剂包围在蛋白质分子的周围，形成一种在结构上与玻璃状的冰相似的碳水化合物玻璃体，使大分子物质的链锻运动受阻，阻止蛋白质的伸展和沉淀，维持蛋白质分子三维结构的稳定，从而起到保护作用。
研究表明，单糖、双糖、多羟基化合物以及结构蛋白质、酶都能显示玻璃行为，只是玻璃化转变温度不同而已。
由于某些糖的玻璃化温度较高，在较高的保存温度下，仍能在蛋白质分子附近形成玻璃态。
（大于玻璃化温度就不形成玻璃态了）一般说来，如工作温度低于保护剂的玻璃化温度，高于被保护的活性物质的主相变温度，那么该活性物质就能有效地保持活性。
但在目前，这两种假说还不能完全解释现有的实验现象。
三、冻干保护剂的选择：冻干保护剂需要具备四个特性：玻璃化转变温度高、吸水性差、结晶率低和不含还原基。
常用的保护剂有如下几类物质：1.糖类/多元醇：蔗糖、海藻糖、甘露醇、乳糖、葡萄糖、麦芽糖等；其中，葡萄糖、乳糖具有还原性，而蔗糖、海藻糖、葡聚糖没有还原性。
冻干保护剂
我做的纳米粒，因为冻干后不易溶解，故想加入保护剂而增加溶解性。
查文献一般为乳糖、葡萄糖。
请问保护剂的怎么加入到纳米粒中，直接加入到纳米粒混悬液？加入保护剂，是在冻干之前加入的，在冻干过程中起保护作业的。
后加的可能没效果保护剂一般为葡萄糖、甘露醇。
是为了保证冻干过程的顺利进行和调节渗透压的，增溶剂一般是根据你的具体药物去选择，这些都是在冻干前溶液中添加的，一般加泊洛沙姆之类的，我以前做过一冻干粉加的是葡甲胺冻干保护剂有很多，包括蔗糖，乳糖，甘露醇等，一般的用量都在5%，我做过比较，貌似还是甘露醇的保护效果好，当然你也可以几个冻干保护剂连用。
我现在也在做纳米粒子，冻干之后也不好溶解，想请教一下冻干之前有没有把纳米粒子混悬液中的表面活性剂除掉，再分散不好会不会跟表面活性剂没除去有关。
谢谢！溶解不好就加乳糖或者蔗糖引言由于冻干药品呈多孔状、能长时间稳定贮存、并易重新复水而恢复活性，因此冷冻干燥技术广泛应用于制备固体蛋白质药物、口服速溶药物及药物包埋剂脂质体等药品。
从国家药品监督管理局数据库得知，目前国内已有注射用重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子、注射用重组人干扰素α2b、冻干鼠表皮生长因子、外用冻干重组人表皮生长因子、注射用重组链激酶、注射用重组人白介素-2、注射用重组人生长激素、注射用A群链球菌、注射用重组人干扰素α2b、冻干人凝血因子VⅢ、冻干人纤维蛋白原、间苯三酚口服冻干片等冻干药品获准上市。
截止2000年2月，美国FDA已批准的生物技术药共计76个。
冷冻干燥技术最早于1813年由英国人Wollaston发明。
1909年Shsckell试验用该方法对抗毒素、菌种、狂犬病毒及其它生物制品进行冻干保存，取得了较好效果。
在第二次世界大战中，对血液制品的大量需求大大刺激了冷冻干燥技术的发展，从此该技术进入了工业应用阶段。
此后，制冷和真空设备的飞速发展为快速发展冷冻干燥技术提供了强有力的物质条件。
进入上个世纪的***十年代，科学技术的迅猛发展和人民群众对健康保障的需求为药品冷冻干燥技术的飞速发展提供了强大的动力，在药品冻干损伤和保护机理、药品冻干工艺、药品冷冻干燥机等方面取得了巨大的成绩。
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• 脱水效应
（1）水溶液中蛋白质经过充分水合作用后，在蛋白质分子表面附 着一单层水，这就是所说的水合层(hydration shell)。一般来讲， 参与完全水合作用的水含量为0.3-0.35g（水）/g（蛋白质）。 而在冻干蛋白质产品中水的含量一般不超过10%，因此，必定 有一部分结合水在干燥过程中被除去。 （2）结合水的去除很可能破坏蛋白质的天然结构，最终导致蛋白 质变性。这是因为富含结合水的蛋白质在脱水过程中暴露在乏 水环境中，将质子转化为带电羧酸基团，破坏了蛋白质中电荷 平衡，电荷密度的降低可能促进蛋白质分子之间的疏水作用， 从而使蛋白质发生聚集 。
• 低温效应
生物制品中活性组分在降温与复温过程的一定温度范围内会发 生变性。如对卵清蛋白(ovalbumin)的研究发现，在-10℃~-40℃ 之间，其活性显著降低，而继续降温到在-192℃，活性几乎没 有变化。
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• 在食品、药品以及生物体的冷冻干燥和贮藏过程中，很多因素 （例如，化学成分、冻结速率、冻结和脱水应力、玻璃化转变 温度、干燥固体中剩余水分、贮藏环境的温度和湿度等）都会 影响其中活性组分的稳定性甚至会导致失活。 • 大量的实验研究表明，除了一些食品、人血浆、牛奶等少数物 料可以直接冷冻干燥外；大多数的药品和生物制品，都需要添 加合适的冷冻干燥保护剂和添加剂，配制成混合液后，才能进 行有效的冷冻干燥和贮藏。
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
（2）在生物制品溶液在冻结过程中也会产生大量的冰-水界面。 其中活性组分分子，如蛋白质，可能会被吸附到界面上，从而可 能破坏蛋白质的天然褶皱结构，最终导致蛋白质变性。 （3）在有些生物制品溶液的冻结过程中，溶液的pH值也会发生 变化。如在添加有pH值为7的磷酸盐缓冲液（NaH2PO4和 Na2HPO4的摩尔比为0.72）的蛋白质溶液冻结过程中，由于 NaH2PO4的溶解度远远大于Na2HPO4，当溶液达到三相共晶点时， 它们之间的摩尔比为57，最终导致了pH值的很大改变。蛋白质 发生物理聚集和化学变性。
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2. 储藏过程
• 蛋白质凝聚：是冻干生物制品活性组分在贮藏过程中发生变 性的主要因素之一。导致蛋白质凝集可能是物理（非共价） 相互作用，也可能是蛋白质发生化学凝集（共价）。 • 脱酰胺作用：也是蛋白质发生变性的主要途径之一。天冬酰 胺（Asn）和谷氨酰胺（Gln）是蛋白质中易于发生脱酰胺作 用的两种氨基酸。 • 非酶褐变：也称作Maillard反应。它使得还原性糖（如葡萄糖） 与蛋白质中的赖氨酸（lysine）和精氨酸（arginine）形成碳水 络合物。 • 氧化反应：蛋白质中蛋氨酸Met，胱氨酸Cys，组氨酸His，色 氨酸Trp和酪氨酸Tyr残基的侧链是发生氧化反应的可能位置。 • 水解作用: 虽然冻干的蛋白质中含有极少量的水分，但在贮藏 过程中仍然会发生水解作用。
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5.2 冷冻干燥保护添加剂的分类
按分子量分类
• 低分子量化合物：又可以分为酸性物质、中性物质和碱性物质。 酸性物质主要为谷氨酸、天冬氨酸、苹果氨酸、乳酸等；中性 物质主要为葡萄糖、肌醇、乳糖、蔗糖、棉籽糖、海藻糖、山 梨醇D、L-苏氨酸、肌醇、木糖醇等；碱性物质主要为精氨酸 和组氨酸等。 • 高分子化合物：主要如白蛋白、明胶、蛋白胨、可溶性淀粉、 糊精、肉汁、果胶、阿拉伯胶、羟甲基纤维素、藻类等以及天 然混合物如脱脂牛奶、血清等。 • 一般认为，低分子化合物在冻干过程中直接发挥作用；而高分 子化合物则是促进低分子化合物的保护作用。因此，制备保护 剂配方时，一般多将低、高分子化合物配合使用。
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第五章 冷冻干燥的保护剂和添加剂
冻干过程和储藏过程的变性机理 冷冻干燥保护添加剂的分类 糖/多元醇类保护剂 聚合物类保护剂 表面活性剂类、氨基酸类的保护剂
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• 冻结效应（包括离子浓度的增加、冰晶的形成与生长、pH值变化 以及相分离等 ）
（1）在生物制品的冻结过程中，不断结晶会导致溶液的浓度快速 升高。小分子糖在最大冻结浓缩基质中的计算浓度高达80%。当 溶液浓度发生变化时，离子浓度增加，促进了化学反应。
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5.1 冻干过程和储藏过程的变性机理 1. 冷冻和干燥过程
在生物制品的冷冻干燥过程中，主要有三种效应会导致生物制 品中活性组分的变性：低温效应、冻结效应和脱水效应。
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• 如前所述，生物制品的冷冻干燥过程是一个多步骤过 程，会产生低温、冻结和脱水等多种效应；即使成功 完成冷冻干燥过程后，在长期保存过程中也很难保证 冻干生物制品活性组分的稳定性。为了防止生物制品 在冷冻干燥和贮藏过程中活性组分的变性，研究者们 研究和探索了大量有效的保护添加剂。