冷冻干燥的保护剂及添加剂

• 低温效应
生物制品中活性组分在降温与复温过程的一定温度范围内会发 生变性。如对卵清蛋白(ovalbumin)的研究发现，在-10℃~-40℃ 之间，其活性显著降低，而继续降温到在-192℃，活性几乎没 有变化。
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2. 储藏过程
• 蛋白质凝聚：是冻干生物制品活性组分在贮藏过程中发生变 性的主要因素之一。导致蛋白质凝集可能是物理（非共价） 相互作用，也可能是蛋白质发生化学凝集（共价）。 • 脱酰胺作用：也是蛋白质发生变性的主要途径之一。天冬酰 胺（Asn）和谷氨酰胺（Gln）是蛋白质中易于发生脱酰胺作 用的两种氨基酸。 • 非酶褐变：也称作Maillard反应。它使得还原性糖（如葡萄糖） 与蛋白质中的赖氨酸（lysine）和精氨酸（arginine）形成碳水 络合物。 • 氧化反应：蛋白质中蛋氨酸Met，胱氨酸Cys，组氨酸His，色 氨酸Trp和酪氨酸Tyr残基的侧链是发生氧化反应的可能位置。 • 水解作用: 虽然冻干的蛋白质中含有极少量的水分，但在贮藏 过程中仍然会发生水解作用。
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5.1 冻干过程和储藏过程的变性机理 1. 冷冻和干燥过程
在生物制品的冷冻干燥过程中，主要有三种效应会导致生物制 品中活性组分的变性：低温效应、冻结效应和脱水效应。
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• 如前所述，生物制品的冷冻干燥过程是一个多步骤过 程，会产生低温、冻结和脱水等多种效应；即使成功 完成冷冻干燥过程后，在长期保存过程中也很难保证 冻干生物制品活性组分的稳定性。为了防止生物制品 在冷冻干燥和贮藏过程中活性组分的变性，研究者们 研究和探索了大量有效的保护添加剂。
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• 脱水效应
（1）水溶液中蛋白质经过充分水合作用后，在蛋白质分子表面附 着一单层水，这就是所说的水合层(hydration shell)。一般来讲， 参与完全水合作用的水含量为0.3-0.35g（水）/g（蛋白质）。 而在冻干蛋白质产品中水的含量一般不超过10%，因此，必定 有一部分结合水在干燥过程中被除去。 （2）结合水的去除很可能破坏蛋白质的天然结构，最终导致蛋白 质变性。这是因为富含结合水的蛋白质在脱水过程中暴露在乏 水环境中，将质子转化为带电羧酸基团，破坏了蛋白质中电荷 平衡，电荷密度的降低可能促进蛋白质分子之间的疏水作用， 从而使蛋白质发生聚集 。
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5.2 冷冻干燥保护添加剂的分类
按分子量分类
• 低分子量化合物：又可以分为酸性物质、中性物质和碱性物质。 酸性物质主要为谷氨酸、天冬氨酸、苹果氨酸、乳酸等；中性 物质主要为葡萄糖、肌醇、乳糖、蔗糖、棉籽糖、海藻糖、山 梨醇D、L-苏氨酸、肌醇、木糖醇等；碱性物质主要为精氨酸 和组氨酸等。 • 高分子化合物：主要如白蛋白、明胶、蛋白胨、可溶性淀粉、 糊精、肉汁、果胶、阿拉伯胶、羟甲基纤维素、藻类等以及天 然混合物如脱脂牛奶、血清等。 • 一般认为，低分子化合物在冻干过程中直接发挥作用；而高分 子化合物则是促进低分子化合物的保护作用。因此，制备保护 剂配方时，一般多将低、高分子化合物配合使用。
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第五章 冷冻干燥的保护剂和添加剂
冻干过程和储藏过程的变性机理 冷冻干燥ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ护添加剂的分类 糖/多元醇类保护剂 聚合物类保护剂 表面活性剂类、氨基酸类的保护剂
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• 在食品、药品以及生物体的冷冻干燥和贮藏过程中，很多因素 （例如，化学成分、冻结速率、冻结和脱水应力、玻璃化转变 温度、干燥固体中剩余水分、贮藏环境的温度和湿度等）都会 影响其中活性组分的稳定性甚至会导致失活。 • 大量的实验研究表明，除了一些食品、人血浆、牛奶等少数物 料可以直接冷冻干燥外；大多数的药品和生物制品，都需要添 加合适的冷冻干燥保护剂和添加剂，配制成混合液后，才能进 行有效的冷冻干燥和贮藏。
（2）在生物制品溶液在冻结过程中也会产生大量的冰-水界面。 其中活性组分分子，如蛋白质，可能会被吸附到界面上，从而可 能破坏蛋白质的天然褶皱结构，最终导致蛋白质变性。 （3）在有些生物制品溶液的冻结过程中，溶液的pH值也会发生 变化。如在添加有pH值为7的磷酸盐缓冲液（NaH2PO4和 Na2HPO4的摩尔比为0.72）的蛋白质溶液冻结过程中，由于 NaH2PO4的溶解度远远大于Na2HPO4，当溶液达到三相共晶点时， 它们之间的摩尔比为57，最终导致了pH值的很大改变。蛋白质 发生物理聚集和化学变性。
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• 冻结效应（包括离子浓度的增加、冰晶的形成与生长、pH值变化 以及相分离等 ）
（1）在生物制品的冻结过程中，不断结晶会导致溶液的浓度快速 升高。小分子糖在最大冻结浓缩基质中的计算浓度高达80%。当 溶液浓度发生变化时，离子浓度增加，促进了化学反应。