重组SRH蛋白冻干保护剂的研究

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重组肌红蛋白的原核表达_纯化及其冻干质控品的制备_任艳娜

・研究报告・生物技术通报BIOTECHNOLOGY BULLETIN2014年第8期急性心肌梗死（Acute myocardiac infraction，AMI）是严重危害人类健康的常见疾病之一。

近年来，在我国该病的发病率呈明显升高的趋势。

肌红蛋白（Myoglobin，Myo）是AMI 发生时最早升高的心肌损伤标志物之一，在发病2 h 内血清中Myo 的含量开始增加，6-9 h 达到峰值。

1975年，Kagen 等［1］首次提出血清Myo 的测定可用于急性心肌梗塞的诊断，收稿日期： 2013-12-18作者简介：任艳娜，女，硕士研究生，研究方向：兽医药理学与毒理学；E -mail ：yanna052267213@ 通讯作者：唐时幸，男，博士，研究方向：生物医学；E -mail ：tang.shixing@重组肌红蛋白的原核表达、纯化及其冻干质控品的制备任艳娜才蕾武建伟钱伟张荣华王继华唐时幸（广州万孚生物技术股份有限公司，广州 510663）摘要：旨在为市场提供一种廉价、稳定、特异性强、灵敏度高的肌红蛋白质控品；将密码子优化后的肌红蛋白序列通过两步法进行化学合成，并连接到pET -28a 表达载体上，转入大肠杆菌BL21（DE3），用0.5 mmol/L IPTG 37℃诱导表达；目的蛋白经Ni Sepharose 6 Fast Flow（FF）亲和层析进行纯化后，对其特异性进行检测，并研究蛋白稀释液的配方和优化冻干工艺，最后对冻干质控品的稳定性进行检测；结果显示目的蛋白分子量大小为20 kD 左右，具有较强的特异性。

蛋白冻干后具有很好的形态，37℃可以稳定保存10 d ；25℃、4℃可以稳定保存4个月以上。

该蛋白的冻干制品成本低、稳定性好、特异性强、灵敏度高，可用于定性定量肌红蛋白检测试剂盒的质控品。

关键词：重组肌红蛋白原核表达纯化冻干质控品The Expression and Purification of Recombinant Myoglobin andPreparation of Its Quality Control SamplesRen Yanna Cai Lei Wu Jianwei Qian Wei Zhang Ronghua Wang Jihua Tang Shixing（Guangzhou Wondfo Biotech Co.，Ltd ，Guangzhou 510663）Abstract: We intended to provide a cheap, stable, highly specific and sensitive lyophilized protein as quality control for diagnositic kits. The myoglobin gene code was optimized and two -step methods were used in this study for the synthesis of myoglobin gene. The DNA fragment of myoglobin was inserted into pET -28a vector forming a recombination plasmid, then, transformed into BL21（DE3）bacteria. Protein expression was induced by 0.5 mmol/L IPTG and purified by Ni Sepharose 6 Fast Flow（FF）. After confirming its specificity, we studied the stability of the lyophilized protein at different storage temperatures（37℃, 25℃, 4℃）. Results showed that the target protein is approximately 20 kD with high specificity, good morphology and stability after freeze -drying under the optimized conditions and protein diluting solution. The lyophilized myoglobin protein with low cost, good stability, high specificity and sensitivity, canbe used as quality control for both qualitative and quantitative myoglobin testing kits.Key words: Recombinant Myoglobin Prokaryotic expression Purification Lyophilized Quality control samples检测病人的Myo 水平可以快速确诊并及时治疗，从而降低病死率［2］。

蛋白类药物冷冻干燥技术的研究进展

蛋白类药物冷冻干燥技术的研究进展
于亚云;段姚尧;崔颖
【期刊名称】《武警医学院学报》
【年(卷),期】2010()1
【摘要】酶、蛋白和肽类药物作为固态存在时具有更好的稳定性。

冷冻干燥是生物活性物质浓缩和干燥的温和手段，酶学家将其作为常规技术已有40余年。

与其他干燥方法（如热风烘干、微波干燥等）相比，药品冷冻干燥法有极大的优越性：由于在低温、真空状态下完成整个干燥过程，因而保持了蛋白药物的生物活性，尤其对于热敏和易氧化的物料；冻结时被干燥药品可形成“骨架”结构，干燥后能保持原形，体积几乎不变；
【总页数】4页(P78-80)
【关键词】蛋白;冷冻干燥;稳定性
【作者】于亚云;段姚尧;崔颖
【作者单位】国药控股天津有限公司;武警医学院
【正文语种】中文
【中图分类】R917
【相关文献】
1.蛋白质药品冷冻干燥技术研究进展 [J], 陈光明
2.蛋白质药品的真空冷冻干燥技术及研究进展 [J], 张敬如;黄复生;王昆
3.长效蛋白多肽类药物技术研究进展 [J], 李守巧;丁明玲
4.蛋白多肽类药物脂质体中国专利技术研究进展 [J], 雷耀龙;张珮明;陈矛
5.蛋白及多肽类药物长效化制剂学技术研究进展 [J], 丁源;陈新;涂家生;孙春萌因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

一种冻干保护剂、PCR扩增试剂及其冻干方法和应用[发明专利]

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202010947689.4(22)申请日 2020.09.10(71)申请人上海创宏生物科技有限公司地址 201600 上海市松江区洞泾镇振业路161号九幢四层401室申请人上海农林职业技术学院(72)发明人马晶晶　张江　韩相敏　徐添悦　吴碧清　赖志　高俊锋　蒋洁　徐莉　代书玲　(74)专利代理机构北京艾皮专利代理有限公司11777代理人马小辉(51)Int.Cl.C12Q 1/686(2018.01)(54)发明名称一种冻干保护剂、PCR扩增试剂及其冻干方法和应用(57)摘要本发明适用于生物技术诊断检测领域，提供了一种冻干保护剂、PCR扩增试剂及其冻干方法和应用，该PCR扩增试剂包括扩增反应体系和冻干保护剂；其中，冻干保护剂包括如下组分：甘油、海藻糖、蔗糖、吐温‑80、右旋糖酐‑40、甘氨酸、组氨酸、谷氨酸钠、抑菌剂、叔丁醇。

本发明提供的冻干保护剂，可与荧光PCR需要用到的组分制备在一起，也可搭配任意PCR检测所需引物和探针，并进行冻干以制得PCR扩增试剂；该PCR扩增试剂不仅能够实现常温运输及保存，且在使用时只需用ddH 2O溶解，然后加入样本核酸即可，具有操作方便的优点。

权利要求书1页说明书7页附图4页CN 112048545 A 2020.12.08C N 112048545A1.一种冻干保护剂，其特征在于，包括如下浓度的组分：甘油3~7wt%、海藻糖80~120mg/mL、蔗糖80~120mg/mL、吐温-80 0.3~0.7wt%、右旋糖酐-40 3~7mmol/L、甘氨酸5~15mg/mL、组氨酸5~15mg/mL、谷氨酸钠0.5~1.5wt%、抑菌剂0.1~0.5wt%、叔丁醇0.5~1.5wt%。

2.根据权利要求1所述的一种冻干保护剂，其特征在于，所述冻干保护剂包括如下浓度的组分：甘油4~6wt%、海藻糖90~110mg/mL、蔗糖90~110mg/mL、吐温-80 0.4~0.6wt%、右旋糖酐-40 4~6mmol/L、甘氨酸8~12mg/mL、组氨酸8~12mg/mL、谷氨酸钠0.8~1.2wt%、抑菌剂0.1~0.3wt%、叔丁醇0.8~1.2wt%。

冻干保护剂在疫苗生产中的应用研究

冻干保护剂在疫苗生产中的应用研究冻干保护剂可影响生物制品的质量、效价和稳定性，改变生物制品的生产工艺，提高产品干燥能力并增大产品批次间的稳定性。

耐热冻干保护剂有免疫活性但无药理活性，可在冻干和保存时维持疫苗的稳定性，初次干燥时在适宜的温度下疫苗不倒塌，企业低成本即可获取。

一、分类（一）按相对分子量分按相对分子量分可分为低分子化合物和高分子化合物。

1.低分子化合物低分子化合物可提高微生物存活率，形成均一悬液，起到水分缓解作用。

如：酸性物质：谷氨酸、天冬氨酸、乳酸；中性物质：葡萄糖、乳糖、蔗糖、海藻糖、山梨醇；碱性物质：精氨酸、组氨酸。

2.高分子化合物高分子化合物对微生物有保护作用，可促进其升华形成耐热骨架阻断热传导和热辐射。

如：白蛋白、明胶、蛋白胨、脱脂奶粉。

水解明胶水解明胶可去掉杂质蛋白、无抗原性、无过敏反应、无热源，并且分子量小、均质、易溶于水，可过滤除菌，共熔点为-12℃。

对微生物的保护作用高出普通明胶10％以上。

脱脂奶粉可促进升华、加热灭菌，易取得均质产品，并扩大细胞相互间的距离。

(二)按功能和性质分1.耐热冻干保护剂耐热冻干保护剂在冻结和干燥过程中，可防止活性组分变性，如海藻糖、蔗糖、聚维酮（PVP）等。

2.填充剂可防止有效组分随水蒸气一起升华逸散，如：甘露醇、明胶等。

3.抗氧化剂产品的自身氧化可消耗冻干样品内部和环境中的氧；放入电子或氢离子，可阻断冻干样品中氧化链式反应，抑制氧化酶活性，防止样品在冷冻干燥及储藏过程中氧化变质。

如硫代硫酸钠、维生素E、维生素C等。

4.酸碱调整剂在冷冻干燥、储藏过程中，将生物制品PH值调整到活性物质最稳定区域。

常用的有：磷酸二氢钾、磷酸氢钠。

（三）按物质的种类分1.糖/多元醇类单糖（葡萄糖、半乳糖）：糖与生物制品活性组分的分子形成氢键而代替了原有水的位置，起保护作用；低聚糖（蔗糖、海藻糖）：低聚糖能起到低温保护功能和脱水保护作用；海藻糖则具有相对较高的玻璃化转变温度。

【word】重组SRH蛋白冻干保护剂的研究

重组SRH蛋白冻干保护剂的研究医学研究杂志2011年11月第4O卷第11期?论善?重组SRH蛋白冻干保护剂的研究邹民吉徐涛刘深付文亮徐东刚摘要目的筛选并优化重组SRH蛋白的冻干保护剂,使其能够保持良好的生物学活性.方法选择不同浓度的冻干保护剂,包括甘露醇,右旋糖酐40,蔗糖和甘氨酸等组成不同浓度的单一和复合配方,冷冻干燥后检测冻干样品的溶栓活性和成型的变化,同时,冻干样品经过37℃加速实验后,检测其溶栓活性和成型状况的改变,对比分析各组保护剂的效果.结果不同浓度的甘露醇和右旋糖苷40对SRH蛋白的保护作用良好,没有明显差异,而不同浓度的蔗糖和甘氨酸保护效果较差.复方中以右旋糖苷40,蔗糖和甘胺酸的复合对目的蛋白的保护作用最好;不同浓度的甘露醇,蔗糖和甘氨酸的复合应用无明显的保护作用.结论以右旋糖苷40,蔗糖和甘氨酸组成的复合配方对重组SRH蛋白的冻干过程有明显的保护作用.关键词重组SRH蛋白冻干保护剂生物活性StudyonLyophilizedProtectiveforRecombinantAnti—artherosclerosisPr oteinontheBasisofSAKBackbone.ZouMi,XuTao,LiuShen,FuWenliang,XuDonggang.DepartmentofBioengineering,BeijingInstituteofBasicalMedicalSciences,Beijing100850,China AbstractObjectiveToselectalyophilizedprotectiveforrecombinantanti——artherosclerosisproteinonthebasisofSAKback-?bone.MethodsMannitol,dextran40,sucrose,andglycineintheirdifferentco ncentrationswereselectedtomakeupasinglerecipeor differentcomplexrecipesoftheirconcentrations.Afterlyophilization,thethr ombolyticactivityandplasticitychangeshouldbeexamined, inthemeantime.thelyophilizedsamplewasrapidlythowedat37℃andthechangesofthrombolyticactivityandplasticityalsoshouldbe examined.ResultsTheprotectiveeffectsontheproteinofinterestwerenotsig nificantlydifferentbetweenglyceralanddextran40intheir differentconcentrations.Bothofthempossessedbetterprotectiveeffect,how ever,thatofthesucroseandglycineindifferenteoncentra—tionswerelesseffective.Thecomplexrecipeofdextran4O.sucroseandglyein edisplayedthebestprotectiveeffectontheproteinofinter—estamongthecomplexrecipes,butthecomplexofgyeeral,sucroseandglycin einthedifferentconcentrationshadnoobviousprotectiveeffect.ConclusionThedextran40,sucroseandgycineindifferetconcentratio nspossessasignificantlyprotectiveeffect0I”1thelyopbi- lizedprocessoftherecombinantanti—artherosclerosisproteinonthebasisof SAKbackbone. KeywordsRecombinantanti—artherosclerosisprotein;Lyophilizedprotective;Biologicalactivity重组SRH蛋白是以改构的葡激酶(staphyloki—nase,SAK)为骨架融合了RGD序列和水蛭素的功能片段而组成的具有溶栓,抗凝和抑制血小板聚集的多功能融合蛋白,我们已开展的动物实验研究表明,该重组蛋白不仅降低了SAK的免疫源性,而且拥有良好的治疗动脉粥样硬化作用,为了进一步的新药应用研究,我们选择了不同的冻于保护剂组成制剂配方研究了它们对目的蛋白的保护作用.材料与方法1.材料:SAK骨架的多功能蛋白由本研究室构建表达纯化,20%甘露醇为石家庄四药有限公司生产,蔗糖广东西陇股份有限公司产品,甘氨酸为美国Amereseo公司生产,西林瓶基金项目:国家科技重大专项,重大新药创制课题(2009ZX09103 —623)作者单位:100850北京,军事医学科学院基础医学研究所通讯作者:徐东刚,电子信箱:************.cn为华北制药股份有限公司玻璃厂生产,右旋糖酐4O为六安华源制药有限公司生产,冷冻干燥机由军事医学科学院仪器厂生产.2.方法:(1)溶液配制及配方组成:配制40%蔗糖溶液,0.5mol/L甘氨酸溶液,10%右旋糖酐40溶液,并按下表组成不同的冻干保护剂配方:(2)冷冻干燥:分装结束后,将样品置于冷井中密封,预冻至冷井温度一67℃,物料一63℃,开始启动干燥程序,24h后,取出样品,加盖密封.(3)外观与复溶:各取1支冻干样品,在40W的日光灯下,观察成型状况,然后加入1ml生理盐水,在40W日光灯下观察样品溶解状况及有无不溶物等.(4)溶栓活性测定:称取125mg琼脂糖(Biorad电泳级),加入23ml生理盐水,煮沸溶解,60℃水浴平衡,加凝血酶141xl(1OOU/m1),纤溶酶原280~1(0.5mg/m1),要边加边摇匀,加2.2m1人纤维蛋白原(6mg/m1),不停地摇匀,混浊后马上倒平板(直径8cm),4℃冰箱水平放置至少30min,充分凝固后待用.将标准品进行对倍稀释,使参考品浓度依次为: 250,12562.5,31.25,15.63AU/ml.将重组葡激酶根据标示量稀释至5p4/ml的浓度.在形成的纤维蛋白平板内打孑L(直25.论善?表1不同保护剂的成分组成径2mm),每扎点样61xl,每个样品和标准品复孔点样,25湿盒水平放16h.将点样平板存黑色背景下纵横两次量舣溶圈直径,以各个稀释度的活性的对数(X)为横坐标,以溶阁直径的平均数(4次量取的数值)的对数为纵坐标(Y),采川生物统计软件分析结果.利用统训’学软件中的回归分析方法作标准曲线,并求得Y=a+bx_f1的a和b及线性剐归系数,值,据样品的溶网直径可求得样品的活性(5)37~C加速实验:各取1支冻f样品置于37~C温箱中,两周后取,检测外观和复溶情}兄,并测定溶栓活性.结果冷冻干燥结束后,各取1支冻干样晶,在40W的日光灯下检测冻干样品的成型状况,并开盖取出样品,观察冻干品的结构形态,另取1支,以生理盐水溶解,测定各自的溶栓活性,结果见表2.将冻干样品各取1支,置于37℃恒温箱中静置14天,然后取m,观察样品的形状,并测定溶栓活性,结果见表3.以L结果显示,不同浓度的甘露醇和右旋糖苷40对目的蛋白的保护作用没有明显的差异,均具有较好的保护效果,而不同浓度的蔗糖和甘氨酸对蛋白的保护效果明显低于甘露醇和右旋糖苷40,当采用不同浓度的保护剂进行复合应用时,右旋糖苷40,蔗糖和甘胺.26.酸的复合应用对目的蛋白的保护作用最好,不同浓度的甘露醇,蔗糖和甘氨酸的复合应用则没有明显的改善对蛋白的保护作用.冻干样品的成型状况为2%的甘露醇和右旋糖苷40较为粗糙,3%的右旋糖苷40和2%,3%的蔗糖出现样品的萎缩甚至崩解.冻干样品的溶解性则是除3%的甘氨酸有少许不溶物外,其他样品均有良好的复溶性.37℃加速实验结果显示,各制剂配方的蛋白溶栓活性较37℃处理前没有明的变化,4%的蔗糖样品的形状较37℃处理前m现明显的萎缩,呈结晶状,但其活性没有明显的降低,其他样品均没有明显的变化,详见表3.表2冻干样品的溶栓活性和成型变化讨论目前,常用的蛋白冻干保护剂包括糖类及多元醇,聚合物,无水溶剂,表面活性剂,氨基酸以及某些盐和胺.保护剂对蛋白的保护机制主要有两种似说,一是水分子替代假说,即结合水通过氢键与蛋白质分子联接而维持其活性,在冷冻干燥过程中失去水分子后,保护剂的羟基能替代蛋白质表面水的羟基,使蛋白质表面形成一层假定的水化膜,使氢医学研究杂志2011年11月第40卷第l1期?论善? 表3冻干样品37℃加速实验结果键的联接位置不直接暴露在周围环境中,保持了蛋白分子的高级结构,保护蛋白分子的正常活性;二是玻璃态假说,是指在含保护剂溶液的干燥过程中,当浓度足够大且保护剂的结晶不会发生时,保护剂一水混合物就会玻璃化,形成一种在结构上与玻璃状的冰相似的糖类玻璃体,使蛋白分子的链运动受阻,阻止其伸展和沉淀,维持蛋白质分子三维结构的稳定,从而起到保护作用,许多研究结果均可以用这两个假说进行解释.本次实验的结果同样也可以用这两个假说进行解释,但是,当选用2%和3%蔗糖时,37℃处理后,样品严重萎缩甚至崩解成晶体状,在这种状态下,并没有降低蛋白的活性,说明SRH蛋白分子的高级结构没有发生变化,这种分子间的相互作用机制尚需进一步探讨.所选用的各个单一配方的不同浓度对SRH蛋白均有良好的保护作用,保护效果没有明显的差异,除右旋糖酐40,蔗糖和甘氨酸复合配方外,其他复合配方间也无明显的差异,而右旋糖酐40,蔗糖和甘氨酸的复合配方对SRH蛋白分子具有更好的保护作用,这种复方对SRH蛋白的保护机制需要进一步的实验加以解释.参考文献1WangM,WangY,WangJ,ZouM,etalConstructionandcharacteriza- tionofanovalstaphylokinasevariantwiththrombin—inhibitoryactivity [J].Biotechnollett,2009,31(12):1923—19272朱敖兰,杨洁生物制品冻干保护剂及其保护机理的研究[J].喀什师范学院.2007,28(6):46—503孙东波,胡一桥.蛋白质冷冻干燥制品中的保护剂及其保护机理[J].药学进展,2003,27(4):201—2054符桢华,张凯,曹昱.菠萝蛋白酶冻干保护剂研究[J].食品工业科技,2010,(03):268—2705石晶,李锐,马玉杰,等.冻干重组碱性成纤维细胞生长因子无人血清白蛋白保护剂的研究[J].中国生化药物杂志,2003,24(5):244—2456冯强,米力,余晓玲,等.抗人肝癌单抗片断抗体HAbl8(ab)2的冻干工艺研究[J].生物技术通讯,2002,13(5):356—3577李德志,郭大东,高宏丽,等.冻干重组人白细胞介素一2结晶形状的分析[J].齐鲁药事,2004,23(4):47—488刘国良,罗家炳,闫哲,等.精制人自细胞干扰素冻干赋形剂初探[J].中国输血杂志,1995,8(1):14—159方志正,何建中.应用正交实验研究麻疹疫苗保护剂和冻干条件[J].中国生物制品学杂志,1997,10(2):101—104(收稿:2011—03—04)(修回:2011—03—16)新型CpG佐剂——BW006协同乙型肝炎病毒表面抗原活化小鼠B,T淋巴细胞的作用何鹏张现臣胡忠玉方鑫邱少辉梁争论摘要目的探讨新型CpG佐剂BW006协同乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)对小鼠B,T淋巴细胞活化的影响.方法基金项目:国家科技重大专项艾滋病和病毒性肝炎等重大传染病防治基金资助项目(2009ZX10004—802)作者单位:100050北京,中国食品药品检定研究院病毒二室通讯作者:梁争论,电子信箱:***************27?。

蛋白冻干保护剂

5.7 冷冻干燥配方需要注意的问题
• 由于生物物料中活性组分各不相同，因而一般均须针对物料单独配方。为了确保生物制品冷冻干燥后最大程度地获得活性恢复率，必须充分考虑各种保护剂和添加剂与生物制品活性组分之间的最大相容性。
School of Medical Instrument and Food Engineering
University of Shanghai for Science and Technology
2.缓冲剂的选择
• 有许多缓冲剂能够用于生物制品的冷冻干燥配方中，但是，并非每一种缓冲剂都能够用于任何溶液，例如，对pH敏感的蛋白质溶液，就应当避免使用磷酸钠缓冲剂，这是由于在冻结过程中，Na2HPO4易于优先结晶，使得溶液的pH值降低，最终引起蛋白质变性。 • 另外，正确选择缓冲剂的浓度也是很重要的。例如， β-牛乳糖水溶液（2μg/ml）冷冻干燥过程中，因为甘露醇结晶而不能起到保护作用。当添加浓度为10mM的磷酸盐缓冲液（pH7.4）后，部分抑制了甘露醇的结晶，并且酶的活性达到95%；而将磷酸盐缓冲液（pH7.4）的浓度提高到200mM就能够完全抑制甘露醇结晶。
波长cm-1 ------天然蛋白质溶液 —含有添加剂的蛋白质溶液干扰素-γ分别在冷冻干燥固体状态和复水后的频谱图 School of Medical Instrument and Food Engineering
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• 由于添加剂之间的物理作用是相互的，因此保持各添加剂之间的相对合适含量是很重要的。如果某种添加剂同时能起到几种功能，如有的糖既能起到低温保护剂的功能，又能起到冻干保护剂的功能，那么它应当是首选的添加剂。 • 另外，应当尽量避免大量使用缓冲剂或盐类，因为它们有可能在冻结过程中改变pH值，也有可能降低配方的玻璃化转变温度。

一种冻干保护剂及其在冻干型甲型肝炎减毒活疫苗中的应用[发明专利]

专利名称：一种冻干保护剂及其在冻干型甲型肝炎减毒活疫苗中的应用
专利类型：发明专利
发明人：王海漩,胡云章,胡凝珠
申请号：CN201610117311.5
申请日：20160302
公开号：CN105749289A
公开日：
20160713
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明公开一种冻干保护剂及其在冻干型甲型肝炎减毒活疫苗中的应用，由下列组分组成：海藻糖2～10 g/100ml、N?正辛基?D?葡萄糖胺2.93～5.87μg/100ml、N?乙酰基?D?葡萄糖胺2.21～4.42μg/100ml、溶剂为水。

应用时是按甲型肝炎减毒活疫苗病毒液与冻干保护剂的体积比为1∶0.7～1.2，在甲型肝炎减毒活疫苗病毒液中加入冻干保护剂。

本发明冻干保护剂所生产的冻干后疫苗的滴度不变；热稳定性显著提高；冻干疫苗具有良好的安全性和免疫原性，本发明配方成分明确，配方简单，制备方法简单易行，易于实施，疫苗制备工艺步骤可操作性强，利于产品的标准化大规模生产。

申请人：中国医学科学院医学生物学研究所
地址：650106 云南省昆明市茭菱路935号
国籍：CN
代理机构：昆明正原专利商标代理有限公司
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重组SRH蛋白冻干保护剂的研究

ＡｂｔａｔＯｂｅｔｅＴｅｅｔａｌｏｈｌｅｒｔｃｉｅｆｒｒｃｍｂｎｎｎｉ—ａｔｅｏｃｅｏｉｐｏｅｎｏｈａｉｏＡＫｂｃ－ｓｒｃｊｃｉｏｓｌｃｙｐｉｚｄｐｏｅｔｏｅｏｉａｔａｔ— ｒｈｒｓｌｒｓｓｒｔｉｎｔｅｂｓｆＳａｋ・ｖｉｖｓ
保护剂，括甘露醇、旋糖酐４、包右０蔗糖和甘氨酸等组成不同浓度的单一和复合配方，冻干燥后检测冻干样品的溶栓活性和成冷
型的变化，时，干样品经过３ ℃ 加速实验后，测其溶栓活性和成型状况的改变，比分析各组保护剂的效果。结果不同同冻７检对
ｄｆｅｅｔｃｍｐｅｅｉｓｏｈｉｏｃｎｒｔｏ．Ａｆｅｙｐｌｚｔｏｉｒｎｏｌｘｒｃｐｅｆｔｅｒｃｎｅｔａｉｎｓｔｒｌｏｈｉｉａｉｎ，ｔｈｏｂｌｔｃａｔｖｔｎｄｐａｔｃｔｈａｅｓｏｌｘｍｉｅｈｅｔｒｍｏｙｉｃｉｉａｌｓｉｉｃｎｇｈｕｄｂｅｅａｎｄ，ｙｙｉｈｅｎｉｎｔｅｍａｔｍｅ．ｔｅｌｏｈｉｚｄｓｍｐｅｗａａｄｌｈｏｄａｈｙｐｌｅａｌｓｒｐｉｙｔｗｅｔ３７℃ ａｈｈｎｇｆｔｒｍｂｏｙｉｃｉｉｙａｄｐａｔｃｔｌｏｓｏｄｂｉｎｄｔｅｃａｅｓｏｈｏｌｔｃａｔｖｔｎｌｓｉｉｙａｓｈｕｌｅ

冻干保护剂及其保护机理的研究进展

冻干保护剂及其保护机理的研究进展生命科学学院动物科学专业2008084533（学号）严忠平（姓名）指导教师郑新添【摘要】进入上个世纪的八九十年代，科学技术的迅猛发展和人民群众对健康保障的需求为药品冷冻干燥技术的飞速发展提供了强大的动力，在药品冻干损伤和保护机理、药品冻干工艺、药品冷冻干燥机等方面取得了巨大的成绩。

但药品冷冻干燥技术是一门边缘学科，需要生物学、药学、制冷、真空和控制等知识的交叉和综合，因此仍存在亟待解决的问题。

冷冻干燥是目前保持微生物、动物组织、细胞及蛋白质等活性物质生物活性的一个有效的、普遍的方法．制品经完全冻结，并在一定的真空条件下使冰晶升华，从而达到低温脱水的目的，此过程即称为冷冻干燥，简称冻干，是冷冻和干燥的结合，其中冷冻与干燥引起的蛋白质变性的机理各不相同．【关键词】冻干保护剂保护机理药品生物自进入上个世纪的八九十年代，科学技术的迅猛发展和人民群众对健康保障的需求为药品冷冻干燥技术的飞速发展提供了强大的动力，在药品冻干损伤和保护机理、药品冻干工艺、药品冷冻干燥机等方面取得了巨大的成绩。

但药品冷冻干燥技术是一门边缘学科，需要生物学、药学、制冷、真空和控制等知识的交叉和综合，因此仍存在亟待解决的问题。

冷冻干燥是目前保持微生物、动物组织、细胞及蛋白质等活性物质生物活性的一个有效的、普遍的方法．制品经完全冻结，并在一定的真空条件下使冰晶升华，从而达到低温脱水的目的，此过程即称为冷冻干燥，简称冻干，是冷冻和干燥的结合，其中冷冻与干燥引起的蛋白质变性的机理各不相同．冷冻干燥技术最早于1813年由英国人华莱斯顿(Wollaston)发明．自Heckly和Hammer(1911年)首次对微生物进行干燥保存以来，经过多年来的完善与发展，国内外学者们发现冷冻干燥技术具有与其他干燥方法无可比拟的优点E23，菌种在低温下干燥，各种成分、酶的活性丧失少；可以保持菌种的形态、色泽；复水性好，能很快地吸水还原成干燥前的鲜活状态；脱水彻底，保存期长，储存运输、销售方便．但是，在真空冷冻干燥过程中，冷冻和干燥不可避免地会造成部分微生物细胞的损伤、死亡，及某些蛋白分子的钝化．为了提高冷冻干燥微生物、蛋白质等生物制品的存活率与生物活性，人们进行了大量的研究，其中包括冷干过程中蛋白质的空间结构的变化，以及各种保护剂对这些变化的影响[1]．1 冷冻干燥保护剂冻干是复杂的相变过程,冻干制品在整个过程存在的各种应力,包括低温应力、冻结应力、干燥应力等,常常是直接或间接导致制品中蛋白质变性的因素 ,所以在冻干过程中需使用保护剂。

一种重组抗冻蛋白及包含其的抗冻液[发明专利]

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201810698824.9(22)申请日 2018.06.29(71)申请人深圳市康宁医院（深圳市精神卫生研究所深圳市精神卫生中心）地址 518020 广东省深圳市罗湖区翠竹街道1080号(72)发明人贾晓健　卢建平　柯晓殷　马倩　贺贞　叶彩虹　钟良君　刘铁榜　(74)专利代理机构北京轻创知识产权代理有限公司 11212代理人杨立　王灏增(51)Int.Cl.C07K 14/46(2006.01)C12N 5/00(2006.01)C12N 1/20(2006.01)C12N 1/18(2006.01)C12R 1/19(2006.01)C12R 1/865(2006.01) (54)发明名称一种重组抗冻蛋白及包含其的抗冻液(57)摘要一种重组抗冻蛋白及包含其的抗冻液，所述重组抗冻蛋白包括至少两个抗冻蛋白单元，相邻的两个所述抗冻蛋白单元之间通过连接序列相连接，所述抗冻蛋白单元如序列1所示，所述连接序列如序列2所示。

本发明的重组抗冻蛋白添加入传统的细菌、真菌以及哺乳动物细胞(含生殖细胞)抗冻液中能显著提高冻存细胞的复苏成活率。

权利要求书1页说明书12页序列表8页附图3页CN 108892717 A 2018.11.27C N 108892717A1.一种重组抗冻蛋白，其特征在于，所述重组抗冻蛋白包括至少两个抗冻蛋白单元，相邻的两个所述抗冻蛋白单元之间通过连接序列相连接，所述抗冻蛋白单元如序列1所示，所述连接序列如序列2所示。

2.根据权利要求1所述一种重组抗冻蛋白，其特征在于，所述重组抗冻蛋白包括四个抗冻蛋白单元，其氨基酸序列如序列3所示。

3.根据权利要求2所述一种重组抗冻蛋白，其特征在于，用于编码所述重组抗冻蛋白的核苷酸序列如序列4所示。

4.根据权利要求1所述一种重组抗冻蛋白，其特征在于，所述重组抗冻蛋白包括六个抗冻蛋白单元，其氨基酸序列如序列5所示。

蛋白冻干保护剂

School of Medical Instrument and Food Engineering
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University of Shanghai for Science and Technology
• 生物制品中活性组分如蛋白质也属于聚合物，具有较高的玻璃化转变温度。因此，提高蛋白质与赋形剂之间的质量比率也可以明显提高生物制品冷冻干燥配方的玻璃化转变温度；并且，提高蛋白质的浓度还可以抑制赋形剂的结晶。当然，蛋白质的浓度也不能提高得太多，否则会因为没有足够的保护剂而使得蛋白质发生变性。 • 某些盐类也可用作生物制品在冷冻干燥过程中的保护剂。然而这可能会降低溶液的玻璃化转变温度。所以在生物制品配方中应当尽量少地使用盐。
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5.8 冷冻干燥配方举例
• 一般来讲，蛋白质配方中固体成分含量在2%-10%之间。当固体含量低于2%时，不能形成结实的冻干产品；而固体含量高于10%时，又不能很好地进行冷冻干燥，即使冷冻干燥完成，也会给复水带来困难。
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2）水替代假说
由于蛋白质分子中存在大量的氢键，结合水通过氢键与蛋白质分子联结。当蛋白质在冷冻干燥过程中失去水分后，保护剂的羟基能够替代蛋白质表面上水的羟基，使蛋白质表面形成一层“水合层”，这样就可以保护氢键的联结位置不直接暴露在周围环境中，从而保持了蛋白质天然结构和功能的完整性。