药物筛选方法

药物筛选的方法

分子水平筛选

Microbead FCM联合筛选

原理：FCM（流式细胞术）（flow cytometry）是一种可以对细胞或亚细胞结构进行快速测量的新型分析技术和分选技术，它可以根据穿过毛细管的细胞荧光强度或类型分离细胞。由于不同的分子与标记有不同荧光素的受体或抗体结合，利用和细胞大小相似的Microbead作为固相载体取代细胞通过FCM，不同荧光标记的Microbead就被分离出来，于是靶分子或目标分子就很容易的被分离、纯化。

应用：Lanza等利用这项技术测定了患有脊髓发育不良综合症和急性骨髓源白血病病人体内的各种细胞因子受体CR表达量的变化。

蛋白质-蛋白质；蛋白质-RNA相互作用。

免疫共沉淀（co-immunoprecipitation）

原理：它是利用抗原和抗体的特异性结合以及细菌的Protein A或G特异性地结合到抗体（免疫球蛋白）的Fc片段的现象开发出来的方法。其基本原理是，在细胞裂解液中加入抗兴趣蛋白的抗体，孵育后再加入与抗体特异结合的结合于Agarose珠上的Protein A或G，若细胞中有与兴趣蛋白结合的目的蛋白，就可以形成这样一种复合物：“目的蛋白—兴趣蛋白—抗兴趣蛋白抗体—Protein A或G”，经变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，复合物又被分开。然后经免疫印迹或质谱检测目的蛋白。这种方法得到的目的蛋白是在细胞内与兴趣蛋白天然结合的，符合体内实际情况，得到的结果可信度高。

应用：免疫共沉淀一般用于低丰度蛋白的富集和浓缩，为SDS-PAGE（聚丙烯酰胺凝胶电泳）和MS质谱分析鉴定准备样品，常用于测定两种目标蛋白质是否在体内结合；也可用于确定一种特定蛋白质的新的作用搭档。主要用于检测大分子和大分子相互作用。

放射免疫性检测（RIA）（与EIA，FIA相比灵敏度更高，但由于放射性元素，RIA的使用受到了限制）原理：

（1）竞争结合分析：Ag（非标记抗原）+ Ab（特异性抗体） - AgAb

*Ag（标记抗原）+ Ab（特异性抗体）- *AgAb

（2）IRMA（免疫放射分析）

应用：

（1）肿瘤相关抗原的测定：AFP，CEA，CA199，CA125，CA153，CA724，CYFRA211，PSA等

（2）激素的测定：下丘脑-垂体-甲状腺轴激素等

（3）非激素蛋白质的测定，酶，药物及维生素，免疫分子等的测定。（见文献）

闪烁接近检测（SPA）

原理：闪烁接近检测于1995 年在美国和日本被提请专利。由于当固定在固相载体或96 孔圆片上的受体被放射性标记的材料筛选时，需要过滤等额外步骤以定量分析放射性。为简化此步骤，研究人员发明了闪烁接近检测（SPA，Scintillation Proximity Assay）法。在这个方法中，高产量的荧光分子被附到带有受体的固体上，通过放射性配体引起成键反应。同时，仍存留于溶液中的未成键的放射性配体被水分子抑制，而与荧光受体成键的配体的放射线被其周围的荧光分子吸收。因此，活性分子仅以荧光量分析而没有任何额外步骤就被简单的筛选出来。

该方法在细胞表面受体药物筛选中应用较为普遍。在高通量筛选测定细胞表面受体亲合结合作用时，放射配体标记滤过分析技术由于需要进行分离，现已被亲合闪烁分析所取代。亲合闪烁分析技术通过亲合结合，将放射性配基结合到具有受体的闪烁球上，从而产生光子，减少了放射配体标记分析中的游离配基与结合配基的分离过程，使得放射配基分析可完全以自动化的方式进行，适于进行高通量筛选。产生低能量放射粒子的同位素可被用来进行放射性标记，而这种低能量放射粒子在短距离内可被重吸收，以确保只有结合到受体表面的配基才被检测到。

SPA技术被广泛的应用到激酶、核酸处理酶分析以及受体配体的相互作用分析中。

紫外吸收光谱法（UV absorption）

原理：很多气体可以很好地吸收紫外光和可见光，尤其是有机化合物往往在此区域内拥有多个吸收峰而形成吸收带；可以通过测定其最强吸收波长处光强的变化，判断反应物的减少量或产物的增加量。不适合在此波长范围内都有吸收的化合物检测。（280~340nm）

荧光检测技术（FA）

原理：荧光材料在一定条件下每个分子能释放数千个光子，使理论上的单一分子水平检测成为可能。这种特性以及可采用多种荧光模式，使得荧光检测技术（Fluorescence Assay）成为高通量筛选必不可少的方法。然而，这个方法也有局限。荧光化合物不能像放射性同位素那样取代活性抗原的元素，它们必须连在抗原的某些连接位点上，而且这种修饰不能影响抗原的活性。荧光技术在非细胞相筛选分析中广为应用。

荧光发射波长比吸收的入射波长要长些（能量损失-E=hν=h c / λ）

荧光共振能量转移（FRET）

原理：荧光共振能量转移（Fluorescence Resonance Energy Transfer）是一种用来确定与不同荧光团结合的二个分子间距离的技术。当供体激发态能量满足光学和空间上的要求时，其能量就能有效地通过偶极子相互作用转移给受体。能量转移效率随供体和受体之间距离成相反变化，故分子间小的空间变化（几个埃）能显著影响能量的有效转移率。R0（50%能量转移效率时D 的距离）与供体的发射域和受体的吸收域的重叠同时受体的量子产量还与溶剂有关。如果两个荧光分子相互距离小于R0，当供体的吸收光被发射的时候，理论上受体的荧光将会增强。如果其距离大于R0，当同样的光被发射时，将会检测到供体的荧光

增强。所以，如果将荧光分子连接到如蛋白酶那样可作激酶的小分子酶上，很容易检测酶的活性。

应用：Rodems等用FRET实验平台高通量的筛选了酪氨酸和丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶和磷酸酶的作用底物。可用于酶活测定。

时间相关荧光技术（TRF）

原理：荧光分析的灵敏度常受来源于试剂和容器等背景信号的限制，为了降低荧光背景，人们发明了与时间相关的荧光技术（TRF，Time resolved Fluorescence）。普通荧光分子的激发态存在周期通常仅有几微秒，但是镧系元素的可达几毫秒。利用脉冲激发光源和门控检测器（或相调节技术）可在样品荧光信号采集之前让背景荧光信号消失。

应用：TRF可与FRET联用，Kennedy等利用TRF-FRET技术测定了与早老性痴呆症密切相关的蛋白活性。

时间分辨荧光（TRFIA，Time resolved fluoroisnmunoassasy）有非常少的稀土金属（Eu,Tb,Sm,Dy）的荧光寿命比较长，可达1-2ms,能够满足测量要求，因此而产生了时间分辨荧光分析法，即使用长效荧光标记物，在关闭激发光后再测定荧光强度的分析方法。平时常用的稀土金属主要是Eu和Tb，Eu荧光寿命1ms，在水中不稳定，但加入增强剂后可以克服；Tb荧光寿命1.6ms，水中稳定，但其荧光波长短、散射严重、能量大，易使组分分解，因此从测量方法学上看Tb很好，但不适合用于生物分析，故Eu最为常用。

荧光偏振检测（FPA）

原理：荧光偏振检测（FPA，Fluorescence Polarized Assay）可测定一个由平面偏振光线激发的分子所发射出水平和垂直平面的光线，这两部分光线强度之差除以强度总和即为偏振值P。当溶液的温度和粘度都固定时，P值主要取决于荧光子的分子体积。由于荧光偏振光强度与荧光物质受激发时分子转动速度成反比，所以小分子物质在激发状态旋转速度快，P 值较小；大分子物质在激发状态中旋转速度较慢，P值较大。

FP measurements provide information on molecular orientation and mobility and processes that modulate them, including receptor-ligand interactions, proteolysis, protein-DNA interactions, membrane fluidity and muscle contraction.

Alpha Screen (激发波长大于发射波长，与一般的相反)

原理：在Alpha Screen系统中主要含有两种核心物质，一为Donor bead，另一为Acceptor Bead，当Donor Bead所带有的A分子与Acceptor Bead所带有的B分子产生交互作用时，可以680nm雷射光去激发Donor Bead表面所带有的光敏感物质使其催化周遭的氧分子形成活化态，此活化态的氧分子可与邻近的Acceptor Bead产生化学冷光化反应，并进一步借由能量转换激发Acceptor Bead所带有的荧光物质产生520~620nm的荧光讯号。

Gs偶联的GPCR被激活后，可激活细胞内的cAMP 释放，并引起下游的信号转导。AlphaScreen技术用于cAMP检测采用了竞争性实验（Competition Assay）。

反应体系内供体珠包被了亲和素，用于偶联上生物素化的cAMP；受体珠表面为anti-cAMP 抗体；通过生物素化的cAMP可将供体珠和受体珠拉近，单体氧分子得以传递至受体珠，发生化学反应，产生光信号。将细胞裂解液加入反应体系内，胞内含有的游离cAMP 同生物素化的cAMP竞争性结合抗体，体系产生的光信号降低。