分子生物学分析

2.6分子生物学分析

目前较常采用的微生物学分析方法有两种，一种是使用传统的微生物培养技术（culture）将微生物富集、分离，然后通过一般的生物化学性状或表现型来分析的间接途径。然而使用传统的微生物培养技术存在许多困难，尤其是环境中大多数微生物生长缓慢，例如本论文研究中针对的anammox菌的培养富集时间均在2年以上，同时对培养条件要求极为苛刻，客观上阻碍了采用这种方法对其的研究。第二种途径依靠聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）技术及应用进化和功能基因探针直接从环境样品中检测和分析目标微生物，不需富集培养。分子生物技术有简洁、快速、精确等特点，广泛应用于微生物生态学研究中。尤其是目标微生物主要功能基因的DNA序列数据库和PCR技术结合在一起，使许多分子生态学手段可以直接应用于环境样品的研究中，，推动了环境中微生物生态学研究。本论文研究中采用了第二种途径中的定量PCR技术手段。下面将根据实验中的具体操作进行叙述。

2.6.1DAN提取

本文研究中主要采用的是试剂盒提取方法。DAN提取盒使用美国MP公司的土壤DNA提取试剂盒（FastDNA SPIN Kit for Soil，MP Biomedicals, Santa Ana, USA）。提取方法依据说明书进行微小变动，即向污泥中先加入Sodium Phosphate Buffer（磷酸钠缓冲液），再将其移至Lysing Matrix E管中，具体操作方法如下：（1）向 1.5ml取回污泥离心（10000rpm×10分钟）的湿污泥加入978 μl Sodium Phosphate Buffer（磷酸钠缓冲液），然后将其移到Lysing Matrix E管中（尽可能将其全部加入），然后加入122 μl MT Buffer（MT缓冲液）。

注：因为FastPrep®仪器的剧烈运动，在Lysing Matrix E管内会形成巨大的压力，样品和基质的总体积不能超过管体积的7/8；留一些空间也会提高混匀效果。

（2）在FastPrep®中处理上述离心管，速度6.0，40秒。

（3）Lysing Matrix E管离心14000g×15分钟。

（4）将上清液转移到一个新的2ml离心管（自备）中，加入250μl PPS，并用手上下颠倒10次进行混合。

（5）离心14000g×10分钟，至形成白色状沉淀物，将上清液转移到一个新的10ml离心管（自备），并加入1ml Binding Matrix Suspension（在用之前重悬Binding Matrix Suspension，一定要摇匀到瓶底看不见沉淀为止，加5个摇一次以

防止放置时间而沉淀）。

（6）用手上下颠倒2分钟，使DNA附着到基质上，把离心管放到架子上静置3分钟。

（7）小心去除500μl上清，避免扰动沉淀的Binding Matrix，重悬剩余的上清；转移大约600μl的混合液到一个SPINTM Filter中，离心14000g×2分钟；将SPIN TM Filter下面catch tube中的液体倒掉；重复上述过程（重悬→移液→Filter→离心→弃catch tube中的液体）直到剩余混合液全部转移离心完（8）加入500μl SEWS-M到SPINTM Filter中，利用移液枪的挤压重悬。

（9）离心14000g×2分钟，将下面catch tube中的液体轻轻地倒掉，重复以上操作一遍。

（10）减掉SPINTM Filter盖子，不加任何东西离心14000g×2分钟，去除基质中的SEWS-M。

（11）将SPINTM Filter放到一个新的Catch Tube中，在室温下风干SPINTM Filter 15分钟。

（12）加入80uL DES，用手轻弹侧壁至液体与粉末充分混合，使滤膜上的沉淀物重悬，从而使DNA有效洗提；55℃加热5min，离心14000g×2分钟，使DNA转移到Catch Tube中。可重复此步，已达到最大量的提取DNA的目的。

（13）使用DNA测定仪（NANO DROP 1000）测定样品中DNA的浓度（ng/uL）和纯度（A260/A280和A260/A230）。

2.6.2PCR扩增

（1）PCR简介

PCR是一种体外酶促扩增特异DNA片段的技术，又称无细胞的分子克隆法。它利用针对目的基因所设计的一对特异寡核苷酸引物，以目的基因为模板进行DNA体外合成反应。由于PCR循环可进行一定次数（通常为25-35个循环），所以在短时间内即可扩增获得大量目的基因。PCR作为一种用于放大扩增特定DNA片段的分子生物学技术，具有特异性强、灵敏度高和简便快速的特点，在环境微生物学领域得到了广泛的应用。

PCR反应由变性、退火、延伸三个基本反应步骤组成：①模板DNA变性：模板DNA经加热至94℃左右后，模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA 会发生解离，成为单链，这样就可以与引物结合；②模板DNA与引物的退火（复性）：在变性过程中模板DNA经加热变性成单链后，将温度降至相应的退火温度左右，引物就会与模板DNA单链的互补序列进行配对和结合；③引物的延伸：在TaqDNA聚合酶的作用下DNA模板-引物结合物以dNTP为反应原料，模板为

靶序列，按照碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链。重复循环变性-退火-延伸三过程就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。

（2）PCR扩增

仪器：9700型PCR扩增仪(ABI，USA)

本论文主要研究不同来源种泥对富集厌氧氨氧化菌富集的影响。在对种泥做初步筛选时，对于Anammox菌16S rRNA基因的扩增采取巢式PCR的方式，第一步扩增引物为pla46f-630r，第二步为Anammox菌特异引物Amx368f –Amx820r，预计获得片段长度为483bp左右的扩增片段[1]。Anammox菌[2]和全细菌PCR扩增的引物和反应条件如表2.所示，反应体系如表2.所示。

Anammox菌第二步扩增产物长度和全细菌扩增产物长度分别为483 bp和1465 bp，扩增结束后所有PCR 产物均通过1 %的琼脂糖凝胶电泳检测扩增效果。

表Anammox菌和全细菌PCR扩增的引物和反应条件