荧光共定位的标准操作规程
荧光操作规程
荧光操作规程荧光操作规程一、前言荧光操作涉及到特殊的实验条件和材料，需要保证实验人员的安全和实验结果的准确性。
为了规范荧光操作过程，减少风险并提高实验效果，制定本操作规程。
二、实验环境与设备1. 实验室应使用干净、整洁、明亮的环境，保持适当的温度和湿度。
2. 实验室应根据实验需要配置荧光显微镜、荧光激发光源等设备，并定期维护和校准。
三、实验前准备1. 实验人员应穿戴合适的实验服，同时佩戴防护眼镜和手套。
2. 确保实验材料和试剂齐全，检查荧光染料的保存状态和过期时间。
3. 进行实验前，应对实验设备进行必要的清洁和消毒。
四、荧光染料的制备和使用1. 荧光染料的制备应根据说明书进行，遵循正确的稀释比例和操作步骤。
2. 在制备和使用荧光染料时，应避免与皮肤接触，如发生溅入眼睛或皮肤上应立即用大量水清洗。
五、实验操作步骤1. 对待待测试样本，应使用专用的实验台和工具，避免受到其他物质的干扰。
2. 根据实验要求，在样本上均匀涂抹荧光染料，避免染料在样本上过度积累或分布不均匀。
3. 使用荧光显微镜时，应根据实验需要选择合适的放大倍率和光学滤光片，保持适度的曝光时间。
4. 在实验过程中，应尽量避免荧光染料的暴露时间过长，以免对样本产生损伤。
六、实验后处理1. 实验结束后，将实验台和工具进行清洗和消毒，确保实验环境的整洁和安全。
2. 将荧光染料和其他实验废液正确处理，禁止随意倒入下水道或垃圾桶。
3. 对荧光染料和其他实验废液的存储，应按照相关规定进行分类和标记，确保安全和环保。
七、安全注意事项1. 荧光染料具有一定的毒性和刺激性，操作时应佩戴防护设备，并尽量减少与荧光染料的直接接触。
2. 注意荧光显微镜和荧光激发光源的安全使用，避免直视强光，以免损伤视力。
3. 注意荧光染料的存储条件和使用期限，避免使用过期或不合格的荧光染料。
八、实验记录和数据分析1. 在实验过程中，实验人员应认真记录实验过程和结果，包括荧光染料的使用情况、观察到的荧光信号等。
荧光操作规程范文
荧光操作规程范文一、实验前准备1.1仪器设备准备：确认所需荧光实验所需的所有仪器设备是否齐全，并进行检查和测试。
如荧光显微镜、荧光分析仪等。
1.2试剂准备：确认所需试剂的种类和数量是否符合实验需求，并检查其保存条件和有效期。
如荧光探针、缓冲液等。
1.3试验条件设置：确定实验室的温度、湿度等试验条件，并保持其稳定。
如实验室温度保持在恒定的20-25摄氏度，湿度保持在相对湿度50-70%。
1.4个人防护：在进行荧光实验前，确保穿戴个人防护用品，如实验服、实验手套、护目镜等。
二、荧光实验操作2.1实验台面整理：在实验前，将实验台面清洁整理，确保实验用具的摆放有序，并保持实验区域的良好通风。
2.2实验操作平稳：荧光实验操作要稳定、轻柔，尽量避免荧光试剂和样品的振荡或剧烈搅拌，以免造成荧光信号的异常。
2.3标本制备及样品处理：在荧光实验前，对标本进行适当的处理，如染色、洗涤等。
对于涉及细胞培养的实验，应严格掌握细胞培养技术及相应的实验规范。
2.4合理选用荧光试剂：根据实验要求和细胞状态的特点，选择合适的荧光探针和染料。
并遵照试剂说明书正确使用。
2.5荧光显微镜使用：使用荧光显微镜前，先进行合适的调整和设定，如荧光滤光片、激发波长、荧光信号接受通道等，并确保显微镜的清洁和镜头的清晰。
使用荧光显微镜时，不宜长时间连续观察，以免损伤眼睛。
2.6荧光信号记录：在记录荧光信号时，要控制好参数的选择和调整，确保荧光信号的质量和准确性。
如荧光强度、发射波长、采样间隔等。
三、荧光废弃物处理3.1合理保存：对于未使用完的荧光试剂或荧光标记的样品，应按照规定保存条件进行保存，避免其变质或损坏。
3.2分类处理：对于废弃的荧光试剂瓶、荧光标记的材料和废液，应按照化学废品处理的规范进行分类和处理。
3.3安全处理：在处理荧光废弃物时，应穿戴好个人防护装备，并采取适当的措施进行处理，如密封包装、集中存放等，以防止对环境和人体造成污染和伤害。
免疫荧光双标安全操作及保养规程
免疫荧光双标安全操作及保养规程一、前言为了确保实验室工作人员在进行免疫荧光双标实验时能够安全操作，保证实验的准确性和稳定性，同时保养实验设备，延长其使用寿命，制定本规程。
二、安全操作规程1. 实验室基本规定•实验室进出要签到，并且着规定实验服；•实验室内禁止吸烟、喝饮料、食物；•实验结束后，把实验用过的工具和危废物及时处理；•发生意外事故要及时向实验室负责人报告。
2. 个人行为规约•实验操作前，必须认真阅读实验操作步骤和注意事项，并通过实验室负责人审核后方可进行操作；•需要操作有毒、易爆等物质时必须经过特殊的操作程序方可进入实验室；•操作前必须洗手，操作时必须戴手套、口罩、护目镜等防护用品，并尽量避免手触摸面部，如要触摸面部，要先摘掉手套并更换新的手套后再进行操作；•手套应经常更换，在操作前、中、后都应进行更换，特别是在换液、换试剂时；•操作过程中，若涉及到某些物品会产生呛、臭、刺激等气味，必须开启实验室排气设备，保证实验室空气流通；•操作过程中禁止打闹、嬉笑和聊天，尤其是进行危险操作的时候；•若发生意外情况，比如跌倒、化学品泼洒，要及时向负责人报告，按照操作规程处理。
3. 免疫荧光双标实验安全操作规程•保持试验台洁净：实验前应清洗试验台，勿插板、电器、插头、试剂瓶等，以免磕碰而油墨不得之处。
•实验室文明礼仪：实验之前，必须穿上实验服并戴上手套、口罩、护目镜等防护用品，如有发热、头晕等不适症状，不宜进行操作•安全使用荧光显微镜：使用荧光显微镜时，要注意镜片表面不得有灰尘、指纹、油污、水珠等物品附着，以免影响观察效果和仪器寿命。
•实验前充分计划：在进行实验时，应充分计划实验步骤，以保证实验的准确性和可靠性，避免误用试剂。
•妥善处理实验废弃物：实验过程中应注意对废实验酒精、废液体和其他废弃物进行妥善处理，以免影响环境。
三、仪器设备保养规程1. 常规保养•仪器设备要摆放平整，防止水波荡漾而影响实验结果；•仪器设备每天使用后要及时清理，防止污染和损伤；•荧光显微镜镜头应进行定期清洗，清洁剂要使用专用清洁剂，注意不得伤及镜片；•仪器设备的外观应经常擦洗，以保持美观、整洁；•维护仪器设备的正常工作环境，保持恒温、恒湿、恒压等设备常态；•仓储设备用后，应安置在固定位置，以免移动设备时泼洒药物等。
荧光分析操作规程(3篇)
第1篇一、目的为确保荧光分析实验的准确性和重复性，特制定本操作规程。
二、适用范围本规程适用于荧光分光光度计、荧光定量PCR仪等荧光分析设备的操作。
三、职责1. 使用人员：负责本规程的实施，熟悉设备操作流程，确保实验顺利进行。
2. 设备维护人员：负责设备的日常维护保养工作，确保设备处于良好状态。
四、操作步骤1. 开机准备（1）开启计算机，进入操作系统。
（2）开启荧光分析设备，如荧光分光光度计、荧光定量PCR仪等。
（3）预热设备，根据设备要求进行预热，一般为15-20分钟。
2. 参数设置（1）根据实验需求，设置波长范围、激发波长、发射波长等参数。
（2）根据实验需求，选择合适的光度测定方式，如荧光强度测定、荧光寿命测定等。
（3）设置数据采集时间、重复次数等参数。
3. 样品准备（1）根据实验需求，配制样品溶液。
（2）根据实验要求，调整样品浓度和体积。
（3）将样品溶液转移到样品池中，确保样品池干净、无气泡。
4. 样品测试（1）打开设备，进入测试界面。
（2）根据实验需求，设置测试参数。
（3）将样品池放入设备中，启动测试程序。
（4）观察测试结果，记录数据。
5. 数据处理与分析（1）将测试数据导入分析软件。
（2）根据实验需求，对数据进行处理和分析。
（3）绘制图表，展示实验结果。
6. 关机操作（1）关闭测试程序。
（2）取出样品池，清洗干净。
（3）关闭荧光分析设备。
（4）关闭计算机。
五、注意事项1. 操作人员应熟悉荧光分析设备的操作流程，确保实验顺利进行。
2. 在进行荧光分析实验前，应了解样品的性质和实验目的，选择合适的实验参数。
3. 严格遵循实验操作规程，确保实验结果的准确性和重复性。
4. 操作过程中，注意设备安全，防止发生意外事故。
5. 定期对荧光分析设备进行维护保养，确保设备处于良好状态。
六、设备维护1. 定期清洁设备，保持设备干净。
2. 定期检查设备性能，确保设备正常运行。
3. 根据设备要求，定期更换配件和消耗品。
免疫荧光共定位数据处理
免疫荧光共定位数据处理免疫荧光共定位数据处理是一种重要的实验技术，用于研究细胞内蛋白质的相互作用及定位。
本文将介绍该技术的基本原理和常用方法，以及在研究中的一些应用案例。
免疫荧光共定位是一种通过标记不同蛋白质的荧光探针，通过荧光显微镜观察它们在细胞中的共定位情况。
这种方法基于免疫反应的原理，通过特异性的抗体与目标蛋白质结合，再使用荧光标记的二抗标记抗原-抗体复合物来可视化目标蛋白质的位置。
通过观察不同标记的蛋白质在细胞中的共定位情况，可以揭示它们之间的相互关系和功能。
常用的免疫荧光共定位方法包括单色免疫染色和双色免疫染色。
单色免疫染色是指使用一种荧光标记的二抗来可视化目标蛋白质的位置，而双色免疫染色则是同时使用两种不同颜色的荧光标记的二抗来可视化两个目标蛋白质的位置。
通过比较不同染色的结果，可以确定两个蛋白质是否共定位。
在研究中，免疫荧光共定位数据处理是不可或缺的一步。
首先，需要对荧光显微镜图像进行处理和分析，以提取有关蛋白质定位的信息。
常用的处理方法包括图像增强、背景消除、图像分割和定量分析等。
通过这些处理，可以获得蛋白质的定位信息和定量数据，以进一步研究其功能和相互作用。
免疫荧光共定位数据处理在细胞生物学、分子生物学和疾病研究中具有广泛的应用。
例如，研究者可以利用该技术来研究细胞器的分布和动态变化，揭示蛋白质在细胞内的定位和运输机制。
此外，免疫荧光共定位还可以用于研究蛋白质的相互作用网络和信号通路，以及研究疾病的发生机制和治疗靶点。
免疫荧光共定位数据处理是一项重要的实验技术，可用于研究细胞内蛋白质的相互作用和定位。
通过对荧光显微镜图像的处理和分析，可以获得有关蛋白质定位的信息和定量数据，为进一步研究提供基础。
该技术在生命科学研究中具有广泛的应用前景，将为我们深入了解细胞内蛋白质的功能和相互关系提供重要的工具和方法。
GSK和proteasome免疫荧光共定位详细步骤
1.盖玻片用砂轮切割为1/4大小，洗衣液浸泡清洗后，放入酸缸中浸泡过夜，冲洗干净后烘干备用；2.24孔板中滴少量培养液，浸在100%酒精中的爬片，在酒精灯上灼烧后放入孔中（注意此时需要晾比较长的时间，以免细胞被烫伤），24孔板接种细胞，浓度以60~80个/μl为标准，量为300μl/孔；3.细胞一般培养两天后处理，选择较好的孔进行标记；4.PBS漂洗2次，2×5min（300μl/孔）；5.100%甲醇-20℃预冷，-20℃固定细胞 8min（300μl/孔）；6.0.2%Triton-PBS，漂洗3×5min（300μl/孔），摇床上摇动；7. 0.5%Triton-PBS，破膜8min （300μl/孔），摇床上摇动；）封8. 0.2%Triton-PBS，漂洗3×5min（300μl/孔），5%BSA（含有0.02%NaN3闭1h（300μl/孔），加一抗（100μl/孔）（GSK-3与proteasome都为1：500），室温下摇2h，4℃孵育两天；9. 4℃拿出之后，常温摇30min，37℃孵育1h，以为一抗能够很好的结合，且回收一抗；10. 0.2%Triton-PBS，漂洗3×10min（300μl/孔）；11.二抗（1：80，避光用5%BSA配制，100μl/孔）37℃孵育1h；12. 0.2%Triton-PBS，避光漂洗3×10min（300μl/孔）；13.Hoechst（1μg/ml）复染15min（100μl/孔），0.2%Triton-PBS，避光漂洗3×10min（300μl/孔）；14.50%磷酸-甘油封片；15.激光共聚焦显微技术观察；16.避光4℃保存爬片，以备再次照相。
荧光共定位定量
荧光共定位定量荧光共定位定量是一种常用的光学技术，用于在细胞或组织中同时检测和定量多个分子的位置和丰度。
该技术结合了荧光共聚焦显微镜和荧光定量检测技术，可以提供详细的空间和数量信息，对生物学研究具有重要意义。
荧光共定位定量的基本原理是利用多个荧光探针标记待测分子，通过荧光共聚焦显微镜观察和记录它们在细胞或组织中的分布情况。
由于每个荧光探针都有特定的光学性质，可以通过荧光定量检测技术测量其荧光强度。
通过比较不同荧光探针的荧光强度，可以确定待测分子在细胞或组织中的相对丰度。
荧光共定位定量技术主要有两个步骤：定位和定量。
首先，要通过荧光探针标记待测分子，并使用荧光共聚焦显微镜在细胞或组织中观察和记录其位置。
这需要选择适当的荧光探针和显微镜条件，以确保荧光探针的特异性和灵敏度。
其次，要使用荧光定量检测技术测量每个荧光探针的荧光强度，并将其转化为待测分子的相对丰度。
这通常涉及到荧光校正、计算荧光强度比例和标准曲线等步骤。
荧光共定位定量技术在生物学研究中有广泛的应用。
它可以用于研究细胞和组织中多个分子的相互作用和调控机制。
例如，研究细胞内的信号传导通路时，可以同时检测多个关键分子的位置和丰度，了解它们在信号传导中的互作关系。
此外，荧光共定位定量技术还可以用于研究细胞和组织中多个基因的表达模式和变化趋势。
通过观察和计量多个靶基因的荧光强度，可以揭示基因调控网络的复杂性。
尽管荧光共定位定量技术在生物学研究中具有很大的潜力，但也存在一些限制和挑战。
首先，荧光探针的选择和标记方法需要谨慎考虑，以确保其特异性和灵敏度。
其次，荧光共聚焦显微镜的分辨率和采集速度对于准确定位和定量也是至关重要的。
此外，荧光定量检测技术的标定和校正也需要严格控制，以减小误差和提高可靠性。
总之，荧光共定位定量是一种重要的光学技术，用于在细胞和组织中同时检测和定量多个分子的位置和丰度。
它在生物学研究中具有广泛的应用前景，可以揭示生命现象的复杂性和多样性。
免疫荧光共定位
免疫荧光共定位免疫荧光共定位是利用抗原抗体的特异性结合免疫荧光共定位是利用抗原抗体的特异性结合，进行定位研究。
用特异性抗体包被的单克隆抗体与可溶性标记物结合，使它在细胞表面呈固相抗体，并将此抗体沉淀于固相载体上。
经洗涤后，将固相载体上的抗体与特异性抗原进行反应。
若抗原为荧光物质，其发射出的荧光被抗体捕获，标记物与抗原特异性结合后，通过捕获抗体后而固定下来。
经放射自显影后，在荧光显微镜下观察，能对抗原或抗体的位置作出判断。
所以，称此法为免疫荧光共定位。
免疫荧光技术用于抗原抗体的定位，主要包括免疫沉淀技术和免疫印迹技术两种。
免疫沉淀技术是用已知的抗原抗体复合物与荧光抗体或固相抗体反应，形成固相抗原或固相抗体，洗涤除去未结合的游离抗体或非特异性结合的结合物。
然后加入一定量的荧光素或某些能吸收光的染料，以固定或保护未结合的抗体和染料，在电子显微镜下观察标记的抗原抗体。
最常用的荧光染料有鲁米诺、辣根过氧化物酶和邻苯二甲酸二硝酯。
免疫印迹技术是先将可溶性的荧光抗体或固相抗体与细菌细胞共同培养，形成细胞内外均匀分布的抗原抗体复合物。
然后用特异性抗体包被细菌细胞，与细胞共同培养，在细菌细胞壁上出现固相抗体。
当细菌细胞被裂解后，游离抗体或未结合的抗体便暴露出来，并且可与固相抗体进行反应。
这样便可检测到游离抗体或未结合的抗体。
如果将抗原或抗体复合物与固相抗体一起加入酶标记的某些底物，则与底物结合的酶的活性受到抑制。
然后再用底物显色，经电子显微镜观察后，即可观察到固相抗原的显色情况。
如果同时将固相抗体和酶标记的抗原进行反应，也可产生相应的颜色。
在免疫学研究中，有时还需要使抗原抗体结合后再作免疫沉淀技术；或使抗原抗体偶联形成复合物再作免疫沉淀技术。
但无论采取哪种技术，均应考虑三点：一是必须选择合适的固相载体。
二是抗原和抗体都要纯化。
三是与固相载体结合的抗原抗体量要适当，要在一定限度内才能达到检测目的。
总之，免疫印迹技术不仅可用于抗原抗体的定位，而且也可用于抗原抗体的免疫检测。
荧光分析仪安全操作规程
荧光分析仪安全操作规程荧光分析仪是一种用于分析生物分子、化学物质等的通用分析仪器。
由于其使用过程中涉及到较高的辐射、化学药品等安全问题，因此需要制定严格的安全操作规程。
以下是荧光分析仪的安全操作规程，供参考。
1.设备安全操作规程（1）严格按照操作规程进行操作，了解和熟悉设备的结构、性能和使用方法。
（2）在启动设备前，检查设备是否处于正常状态，如有异常情况应及时处理。
（3）设备操作过程中，不得随意拆卸设备的部件或更改设备的加工状态。
（4）操作人员应戴好防护眼镜，并系好头发，避免长袖衣物触碰到设备操作部位。
（5）严禁在设备运作时将手伸入设备内部。
如需要操作设备内部部件，应先停机。
（6）离开设备时，应及时关闭设备开关，切断设备与电源的联系。
（7）在设备出现异常情况时，应立即停止使用设备，并通知维修人员维修处理。
2.荧光物质操作安全规程（1）避免将荧光物质接触皮肤和呼吸道，特别是光敏感荧光物质。
（2）要求操作人员戴手套，在操作过程中必须戴上口罩和护目镜。
（3）操作荧光物质时，要密切佩戴防护衣物，避免直接荧光物质所产生的光线直接照射人体。
（4）操作荧光物质时，必须使用标准的试管和标准的测试方法。
遵循操作规程并遵守安全性原则。
（5）当操作涉及到化学物质或毒性荧光物质时，必须佩戴医用口罩，并将操作区域密闭。
要严格按照使用要求和安全操作规程进行操作。
如无必要不要直接接触此类物质。
3.辐射安全作业规程（1）严格遵守相关国家和地方的辐射安全规定。
（2）在辐射过程中，使用周围的防辐射材料隔绝辐射的影响。
（3）严格限制辐射作业人员进入辐射区域，留意辐射剂量计的实时监测数据。
（4）除操作人员外，禁止其他人进入辐射区域。
（5）执行照射工作之前，必须进行辐射安全防护设施测试和辐射测量，确保安全。
（6）如果操作辐射敏感荧光物质，应提前通知专业人员，照射前要预先准备荧光样品并进行适当的抗辐射处理，以尽可能减少样品的敏感性。
以上是对荧光分析仪安全操作规程的简要说明。
免疫荧光共定位数据处理
免疫荧光共定位数据处理
免疫荧光共定位数据处理主要包括以下步骤：
1.采集图像：使用荧光显微镜获取待测样本的荧光图像。
2.图像预处理：对采集的图像进行预处理，包括去噪、对比度增强、色彩校正等，
以提高图像质量。
3.目标识别与定位：利用图像处理算法对预处理后的图像进行目标识别和定位，
提取出感兴趣的荧光信号区域。
4.荧光信号提取：从识别出的荧光信号区域中提取出荧光信号的强度和分布信息。
5.共定位分析：根据提取出的荧光信号强度和分布信息，利用共定位系数计算各
荧光信号之间的共定位情况。
6.结果可视化：将共定位分析结果可视化，以更直观的方式展示各荧光信号之间
的共定位情况。
在免疫荧光共定位数据处理中，需要注意以下几点：
1.采集图像时要保证荧光标记的特异性，避免非特异性荧光干扰。
2.预处理过程中要去除背景噪声和非特异性荧光信号，提高图像质量。
3.在目标识别和定位时，要选择合适的算法和参数，确保识别的准确性和可靠性。
4.在提取荧光信号时，要注意提取的区域和信号的完整性，避免漏提或错提。
5.在共定位分析时，要选择合适的共定位系数计算方法，确保结果的准确性和可
靠性。
6.在结果可视化时，要选择合适的可视化方式，如颜色编码、箭头指示等，以更
直观地展示共定位情况。
荧光分析岗位安全操作规程
荧光分析岗位安全操作规程1. 前言本文档旨在规范荧光分析岗位的安全操作。
荧光分析是一种常用的实验技术，但在操作过程中存在一定的安全风险，必须严格遵守操作规程以确保操作人员的安全和实验结果的准确性。
2. 实验室准备在进行荧光分析之前，必须确保实验室符合相关的安全要求。
包括：•实验室通风良好，保持空气流通。
•实验室配备应急处理设备，如紧急洗眼器和紧急淋浴设施。
•实验室内有足够的灭火器、灭火器和其他安全设备。
•实验室内有足够的工作台面和储存空间，以避免杂乱和混乱。
3. 个人防护装备荧光分析过程中应佩戴适当的个人防护装备，包括：•实验服：穿戴干净、合身的实验服，确保全身被覆盖。
•实验手套：戴上实验手套以保护双手，定期更换新手套。
•护目镜：佩戴密封性良好的护目镜，保护双眼免受化学品和光线的伤害。
•防护面罩：在进行高风险操作时，如处理有毒气体或剧烈反应的试剂时，需要佩戴防护面罩。
•防护鞋：穿戴有防滑性能的防护鞋，以防止滑倒和腿部受伤。
4. 荧光分析操作步骤4.1 准备样品1.根据实验要求选择适当的样品。
2.准备样品容器，确保容器干净无污染。
3.从原样品中取得适量样品，并将其放入样品容器中。
4.2 取得分析数据1.打开荧光分析设备并启动。
2.针对样品容器选择适当的设置和参数。
3.放置样品容器到设备中，并确保正确固定。
4.启动数据采集，等待分析结果稳定。
5.记录并保存所得到的分析数据。
4.3 清理和处理1.关闭荧光分析设备并断开电源。
2.将样品容器和实验器具放入相应的清洗区域。
3.使用适当的清洗剂和刷子清洗样品容器和实验器具，确保彻底去除残留物。
4.将清洗后的容器和实验器具晾干或使用干燥设备干燥。
5.打扫实验台面和周围区域，清除杂物和废弃物。
6.将废弃物和化学品按规定分类处理，避免造成污染和环境危害。
5. 紧急情况处理在发生紧急情况时，如实验事故、化学品泄漏等，应采取以下措施：1.保持冷静，迅速评估紧急情况严重程度。
学术干货共聚焦显微镜中荧光团的共定位
学术干货：共聚焦显微镜中荧光团的共定位在多标荧光样品图像中，因两个或多个荧光团在显微结构中距离很近，经常会有发射信号叠加，这种效应就称为共定位。
目前，高特异性合成荧光团和经典免疫荧光技术的应用、精密光切技术的应用、共聚焦和多光子显微镜提供的数字图像处理技术等大大提高了生物样品中共定位检测的能力。
图1共定位在生物表述上是这样定义的：两个或多个不同的分子位于样品上同一个物理位置。
对显微镜中看到的组织切片、单个细胞或亚细胞器官，共定位意味着不同的分子连接到同一个受体上；在数字图像方面，这个术语指的是不同荧光分子发射的颜色分享图像中的同一个像素。
在共聚焦显微镜中，样品被记录成含有很多像元的多维阵列数字图像，每个像元代表一个三维像素。
像元的尺寸（或检测单元）由物镜的数值孔径、照明波长以及共焦检测针孔直径等决定。
因此，在一个样品中两个荧光探针的共定位，比如发绿光的Alexa Fluor488，发橘红色光的Cy3，在图像中就是由含有红色和绿色两者贡献的像素表示（经常产生各种各样的橘色和黄色）。
举一个例子，图 1 的一系列图表明了骨骼肌动蛋白和黏着斑蛋白侧向光学平面上的共定位（激光扫描共聚焦显微镜中的XY 面）。
这些共定位点可作为肌动蛋白丝的成核位点，也可作为外部介质、质膜和肌动蛋白骨架之间的交联剂。
图1（a）是Alexa Fluor 568 通道（目标对象是黏着斑蛋白），由543nm 的氦氖激光器激发；而Figure1（b）是Alexa Fluor488 通道(目标对象是丝状肌动蛋白)，由488nm 的氩离子激光器激发；Figure1（c）是前面两幅图的叠加，表明两种荧光信号在丝状肌动蛋白纤维末端的共定位。
必须指出的是，共定位并不指的是具有相似发射光谱的荧光团出现在合成图像的同一个像素上。
准确的共定位分析只有在荧光团的荧光发射光谱足够分离且滤色片（或光谱狭缝宽度）正确设置的情况下才有可能。
荧光团发射光谱之间的大量叠加或滤色片组合的不正确使用，都可能导致光谱串色，这种情况下共定位的测量就没有意义。
荧光操作规程(3篇)
第1篇一、前言荧光技术是一种利用荧光物质在特定波长下发出荧光现象进行物质检测和分析的方法。
荧光操作规程旨在确保荧光实验的准确性和安全性，以下为荧光操作规程的具体内容。
二、实验前准备1. 确认实验设备和试剂：检查荧光仪器是否正常运行，试剂是否过期，确保实验所需试剂和仪器齐全。
2. 实验环境：确保实验室内光线充足，避免强光直射样品，避免外界干扰。
3. 实验人员：实验人员应熟悉荧光技术及相关操作，了解荧光物质的特性和注意事项。
三、荧光操作步骤1. 样品处理：根据实验需求，对样品进行适当的处理，如溶解、离心、过滤等。
2. 样品标记：将荧光标记物加入样品中，确保标记物与样品充分混合。
3. 荧光仪器操作：a. 开启荧光仪器，预热仪器约30分钟；b. 设置激发波长和发射波长，确保仪器稳定运行；c. 调整样品室温度，根据实验需求设定温度；d. 设置曝光时间、增益等参数，确保图像清晰。
4. 样品检测：a. 将标记后的样品放入样品室，调整样品位置；b. 观察荧光信号，记录数据；c. 如需多次检测，重复上述步骤。
5. 数据分析：将检测到的荧光信号进行定量分析，得出实验结果。
四、注意事项1. 试剂和仪器：避免使用过期或受污染的试剂，确保荧光仪器清洁、稳定运行。
2. 样品处理：确保样品处理过程中避免荧光物质降解或漂白。
3. 标记物：选择合适的荧光标记物，确保标记效果明显。
4. 实验环境：避免强光直射样品，确保实验室内光线充足。
5. 操作规范：实验人员应严格按照操作规程进行实验，避免人为错误。
6. 安全防护：操作过程中，注意防护措施，如佩戴防护眼镜、手套等。
五、实验后处理1. 清洁实验器材：使用专用清洗剂清洗荧光仪器、样品室等实验器材。
2. 试剂处理：剩余试剂妥善存放，避免污染。
3. 数据整理：整理实验数据，撰写实验报告。
4. 关闭荧光仪器：关闭荧光仪器，确保实验室内安全。
六、总结荧光操作规程是确保荧光实验顺利进行的重要保障。
外泌体荧光共定位
外泌体荧光共定位
外泌体荧光共定位是一种用于研究外泌体与细胞内特定结构或分子相互作用的技术。
该技术结合了外泌体的分离和荧光标记，以及共定位分析，以确定外泌体与目标结构或分子在细胞内的空间关系。
以下是外泌体荧光共定位的一般步骤：
1. 外泌体的分离：首先，需要从细胞培养上清液或生物体液中分离出外泌体。
这可以通过超速离心、超滤、沉淀法或其他外泌体分离方法来实现。
2. 荧光标记：将分离得到的外泌体进行荧光标记。
常见的荧光标记方法包括使用荧光染料、荧光蛋白或量子点等。
根据研究的需要，可以选择单标记或双标记。
3. 细胞培养和处理：将标记后的外泌体与目标细胞共培养，或者将外泌体引入目标细胞内。
可以通过不同的方法，如孵育、转染或内吞作用等，将外泌体传递到细胞中。
4. 共定位分析：使用荧光显微镜或共聚焦显微镜观察细胞，同时检测外泌体和目标结构或分子的荧光信号。
通过图像分析软件，可以确定外泌体与目标结构或分子是否共定位，并计算共定位系数。
免疫荧光共定位步骤
免疫荧光共定位步骤嘿，咱今儿就来唠唠免疫荧光共定位步骤这事儿哈！你想想，这免疫荧光共定位就像是一场精心编排的舞蹈，每个步骤都得恰到好处，才能跳出完美的舞步呢！首先呢，得准备好你的“舞台”，也就是样本啦。
把样本处理得妥妥当当的，这可是基础哦！就像盖房子得先把地基打好一样。
然后呢，就是给样本染上那些漂亮的“色彩”，也就是抗体啦。
这可不能马虎，得选对抗体，就像给公主挑裙子一样，得合适才行呢。
把抗体轻轻滴在样本上，让它们亲密接触，发生奇妙的反应。
接着呀，就是让这些染上色彩的样本在合适的环境里“休息”一下，让抗体和样本充分结合。
这时候可别去打扰它们哦，就像让宝宝安静地睡个好觉一样。
再之后呢，就是清洗啦。
把那些多余的东西洗掉，只留下精华部分。
这就像是给花朵修剪枝叶，让它更漂亮。
接下来，就是最精彩的时刻啦——观察！把样本放在显微镜下，哇哦，那里面的世界可神奇啦！你能看到那些漂亮的荧光标记，就像夜空中闪烁的星星一样。
在这个过程中，可不能着急哦，要像个耐心的艺术家一样，慢慢雕琢。
每一步都得细心再细心，不然就可能会出岔子呢。
你说，这免疫荧光共定位是不是很有意思呀？就像在创造一个微观世界的艺术品一样！要是哪一步没做好，那不就像画画的时候颜色涂错了地方，整个画面都不好看啦。
所以呀，可得认真对待每一个步骤呢。
你想想，如果最后看到的结果乱七八糟的，那多让人失望呀！但要是每一步都做得特别好，看到那清晰的共定位图像，哇，那成就感简直爆棚呀！这不就跟努力准备了一场考试，最后考了个好成绩一样开心嘛！总之呢，免疫荧光共定位步骤虽然有点复杂，但只要咱用心去做，肯定能做出漂亮的成果来。
这就跟生活中的很多事情一样，只要肯下功夫，就没有做不好的！加油吧，让我们在免疫荧光共定位的世界里尽情探索！。
学术干货共聚焦显微镜中荧光团的共定位
学术干货：共聚焦显微镜中荧光团的共定位在多标荧光样品图像中，因两个或多个荧光团在显微结构中距离很近，经常会有发射信号叠加，这种效应就称为共定位。
目前，高特异性合成荧光团和经典免疫荧光技术的应用、精密光切技术的应用、共聚焦和多光子显微镜提供的数字图像处理技术等大大提高了生物样品中共定位检测的能力。
图 1共定位在生物表述上是这样定义的：两个或多个不同的分子位于样品上同一个物理位置。
对显微镜中看到的组织切片、单个细胞或亚细胞器官，共定位意味着不同的分子连接到同一个受体上；在数字图像方面，这个术语指的是不同荧光分子发射的颜色分享图像中的同一个像素。
在共聚焦显微镜中，样品被记录成含有很多像元的多维阵列数字图像，每个像元代表一个三维像素。
像元的尺寸（或检测单元）由物镜的数值孔径、照明波长以及共焦检测针孔直径等决定。
因此，在一个样品中两个荧光探针的共定位，比如发绿光的 Alexa Fluor488，发橘红色光的 Cy3，在图像中就是由含有红色和绿色两者贡献的像素表示（经常产生各种各样的橘色和黄色）。
举一个例子，图 1 的一系列图表明了骨骼肌动蛋白和黏着斑蛋白侧向光学平面上的共定位（激光扫描共聚焦显微镜中的 XY 面）。
这些共定位点可作为肌动蛋白丝的成核位点，也可作为外部介质、质膜和肌动蛋白骨架之间的交联剂。
图 1（ a）是 Alexa Fluor 568 通道（目标对象是黏着斑蛋白），由 543nm 的氦氖激光器激发；而 Figure1（ b）是 Alexa Fluor488 通道(目标对象是丝状肌动蛋白)，由 488nm 的氩离子激光器激发； Figure1（ c）是前面两幅图的叠加，表明两种荧光信号在丝状肌动蛋白纤维末端的共定位。
必须指出的是，共定位并不指的是具有相似发射光谱的荧光团出现在合成图像的同一个像素上。
准确的共定位分析只有在荧光团的荧光发射光谱足够分离且滤色片（或光谱狭缝宽度）正确设置的情况下才有可能。
【操作篇】荧光共定位的定量分析！
【操作篇】荧光共定位的定量分析！
荧光共定位是很常见的实验方法，一般用来验证2种或3种蛋白是否存在共定位关系。
在常规Protocol的指导下进行实验操作，很容易得到双荧光或多重荧光染色图像。
这种图像，一般由红色通道（代表蛋白A）和绿色通道（代表蛋白B）两种图像merge后得到。
（红色通道：蛋白A）
（绿色通道：蛋白B）
仅仅通过肉眼和语言描述是很难说清楚蛋白A和蛋白B的共定位程度到底如何。
因此，我们需要对这种共定位关系进行定量分析。
今天的文章主要从操作上做出说明，之后将会从测量原理、分析、后期组图上系统地说明。
图文步骤
1. 请出老朋友Image Pro Plus，并打开一张共定位图像。
2. 点击Measure，选择Co-localization。
3. 因为是红绿通道，因此在弹窗中按照如下选项进行设置，然后点击Forward。
4.点完后，我们会得到一张图像。
（这是红色通道-绿色通道性形成的散点图，可以看出散点几乎都落在对角线上，说明红绿通道相关性极强，且红绿通道荧光强度基本相当。
）
5. 接着再次按照如下设置勾选，然后点击Forward。
6. 然后我们会得到如下参数。
（数据是基于以上散点图进行回归分析，得到的皮尔逊相关系数为0.919032，重叠系数R为0.932092，接近1，说明红绿通道散点相关性极强！）
7.总结一下，操作后我们得到红绿通道散点图、皮尔逊相关系数以及重叠系数，这三个要素是报告荧光共定位分析的最重要的数据，必须在论文中报告。
下期预告：测量原理和分析
Ending~。
免疫荧光检测Reg-与PML的定位
免疫荧光检测Reg-γ与PML的定位为例1. 实验目的：通过免疫荧光检测Reg-γ与PML是否存在共定位2. 实验原理：细胞内的蛋白可通过特异性的抗体识别，带有荧光基团的二抗识别一抗从而放大信号，用特定的激发波长激发荧光基团可观察被检蛋白在细胞内的定位或者表达情况。
不同种属来源的不同抗体可识别两个（理论上可多个）抗体，再用相应的带有不同荧光基团的二抗去识别各自的一抗，可观察到两个蛋白之间的定位情况。
3. 实验过程：（1）各实验组取20000～30000个细胞，用1640补齐各组的体积于100-200μl，1000rpm，5min甩片，用铅笔标记各处理组。
（2）稍晾干细胞，用阻水笔画圈，圈中滴满预冷的4％的多聚甲醛，室温固定10min。
（3）预冷的PBS洗去多聚甲醛，将载玻片浸没于甲醇中，室温透化10min。
（4）预冷的PBS洗去甲醇，将载玻片放入湿盒中，2％的BSA室温封闭2h。
（5）吸去BSA，加入配制于2％的BSA中的一抗，50μl/片，放入湿盒，冷库过夜或者室温2h。
（6）吸去一抗，PBS洗3次，每次5min（7）加入配制于2％的BSA中的二抗，50μl/片，放入湿盒，避光。
室温孵育2h。
（8）吸去一抗，PBS洗3次，每次5min，注意避光。
（9）吸去PBS，DAPI室温染色3～5min。
（10）PBS吸去游离的DAPI，加入抗淬灭剂，10μl/片，指甲油封片。
（11）湿盒避光冷藏或者镜检。
4. 实验实例及注意事项：（1）整个过程中注意保持载玻片在一个潮湿的环境中，不能让细胞区域太干燥。
（2）从加入荧光基团开始应注意避光，一抗如带有荧光基团应从加入一抗后避光。
检测活细胞状态下标记的荧光物质应从一开始进行避光。
（3）注意二抗的种属来源，二抗之间不可有反应，否则无法判断二者之间的共定位。
（4）不宜过长时间冷场片子，做完后尽早镜检。
（5）镜检时不宜长时间对一块区域长时间激发。
（6）共聚焦显微镜观察时不一定要用指甲油封片（指甲油掉在共聚焦的镜头上老师会不高兴），应加入抗淬灭剂后，改上盖玻片后及时去拍片。
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荧光共定位的标准操作规程（编号：058）
1、目的及适用范围
该SOP用来规范荧光共定位操作。
2、主要仪器
摇床、细胞培养箱、激光共聚焦显微镜
3、试剂及配制方法
DMEM （配方参考培养基）过滤灭菌、PBS pH7.2、PBST （PBS中加入0.5%TritonX100）、4%BSA （PBST配置）、一抗和相应的二抗、DAPI（1：5000 PBS配置）、4%多聚甲醛（PBS配置）、封片液（50%甘油，PBS配制）
4、操作步骤
4.1将灭菌后的盖玻片放入24孔板，每孔放一片，每孔加入0.5mL培养于含10%FCS的DMEM培养液中的293T细胞，37℃5%CO2孵箱孵育，待细胞长至合适密度，进行相关的实验。
4.2在相应的实验进行后，取出37℃5%CO2孵箱中培养的24孔板，吸去24孔板中的培养液，用PBS 洗一次。
4.3用含4%多聚甲醛的PBS室温固定细胞30min以上（可4℃固定过夜）。
4.4弃去多聚甲醛固定液，用PBST洗3次。
时间保持在15min以上。
4.5用PBST配4%BSA 4℃封闭过夜或37℃1h，500μL/孔。
4.6取出4℃封闭过夜的24孔板，加入一定浓度用BSA稀释的一抗。
37℃1h。
4.7 PBST洗5次，500μL /孔，10min/次，慢摇。
4.8选用相应的二抗荧光抗体，室温或37℃孵育1h，500μL/孔。
4.9 PBST洗5次，500μL /孔，10min/次，慢摇。
4.10 加入DAPI室温染色2~5min。
PBST洗3次。
4.11 在盖片上滴一滴封片液，将盖片扣在载片上，以指甲油封闭四周。
在避光4℃环境中可保存一周左右。
激光共聚焦荧光显微镜观察。
5、注意事项
5.1本实验的最终细胞密度不能超过80%，在固定细胞时，尽量使细胞密度处于合适的状态，这样荧光照片的效果才比较好。
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