荧光共定位的标准操作规程

荧光共定位的标准操作规程（编号：058）

1、目的及适用范围

该SOP用来规范荧光共定位操作。

2、主要仪器

摇床、细胞培养箱、激光共聚焦显微镜

3、试剂及配制方法

DMEM （配方参考培养基）过滤灭菌、PBS pH7.2、PBST （PBS中加入0.5%TritonX100）、4%BSA （PBST配置）、一抗和相应的二抗、DAPI（1：5000 PBS配置）、4%多聚甲醛（PBS配置）、封片液（50%甘油，PBS配制）

4、操作步骤

4.1将灭菌后的盖玻片放入24孔板，每孔放一片，每孔加入0.5mL培养于含10%FCS的DMEM培养液中的293T细胞，37℃5%CO2孵箱孵育，待细胞长至合适密度，进行相关的实验。

4.2在相应的实验进行后，取出37℃5%CO2孵箱中培养的24孔板，吸去24孔板中的培养液，用PBS 洗一次。

4.3用含4%多聚甲醛的PBS室温固定细胞30min以上（可4℃固定过夜）。

4.4弃去多聚甲醛固定液，用PBST洗3次。时间保持在15min以上。

4.5用PBST配4%BSA 4℃封闭过夜或37℃1h，500μL/孔。

4.6取出4℃封闭过夜的24孔板，加入一定浓度用BSA稀释的一抗。37℃1h。

4.7 PBST洗5次，500μL /孔，10min/次，慢摇。

4.8选用相应的二抗荧光抗体，室温或37℃孵育1h，500μL/孔。

4.9 PBST洗5次，500μL /孔，10min/次，慢摇。

4.10 加入DAPI室温染色2~5min。PBST洗3次。

4.11 在盖片上滴一滴封片液，将盖片扣在载片上，以指甲油封闭四周。在避光4℃环境中可保存一周左右。激光共聚焦荧光显微镜观察。

5、注意事项

5.1本实验的最终细胞密度不能超过80%，在固定细胞时，尽量使细胞密度处于合适的状态，这样荧光照片的效果才比较好。

118