通用细胞裂解液
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通用细胞裂解液
产品简介:
多种成分均可以从细胞中提取总蛋白,例如去Triton、SDS、NP-40等。通用细胞裂解液(Common Lysis Buffer ),是采用一种非变性裂解方法来裂解细胞,并获得总蛋白的裂解液。所获得的蛋白质可以用于PAGE电泳,Western,免疫沉淀(Immunol Precipitation,IP)和免疫共沉淀(co-IP)等,主要由Tris、Triton X-100等组成,并含有多种蛋白酶抑制剂成分,可以有效抑制蛋白的降解,并维持原有的蛋白间相互作用。
用Common Lysis Buffer得到的蛋白,可以用leagene BCA蛋白浓度测定试剂盒(PT0001)测定蛋白浓度。由于含有较高浓度的Triton X-100等干扰物质,不宜用Bradford 法测定由通用细胞裂解液获得样本的蛋白浓度。
主要成分:主要由Tris-HCl、NaCl、低浓度Triton X-100,低浓度sodium pyrophosphate,β-glycerophosphate,EDTA等多种蛋白酶抑制剂组成。
自备材料:
1、高速离心机
2、微量移液器
3、PMSF,亦可采购Leagene的苯甲基磺酰氟溶液(PMSF,100mmol/L)(PI0011)
操作步骤(仅供参考):
(一)贴壁培养细胞
1、取Leagene Common Lysis Buffer 置于室温溶解混匀后,使用前取适当量的裂解液
加入PMSF,使其最终浓度为1mM。
2、去除贴壁细胞的培养液,用PBS、NS或无血清培养液清洗1次,低速离心,弃上清,
留取沉淀。
3、按照6孔板每1孔加入100~200μl含有PMSF的裂解液的比例,加入Common Lysis
Buffer。移液器轻轻吹打,使裂解液和细胞充分接触。冰上或4℃裂解30~60min。
4、10000~12000g,4℃离心10~15min(如无低温离心机,室温下离心亦可),取上清。
5、进行后续的SDS-PAGE、Western、免疫沉淀和免疫共沉淀等操作。
(二) 悬浮培养细胞
1、取Common Lysis Buffer 置于室温溶解混匀后,使用前取适当量的裂解液加入PMSF,
使其最终浓度为1mM。
2、低速离心悬浮细胞,一般500~1000g即可,弃上清,收集沉淀。
3、用手指轻弹细胞,使其松散。按照6孔板每孔细胞加入100~200μl含有PMSF的裂
解液的比例加入Common Lysis Buffer 。通常6孔板每孔细胞加入100ul裂解液已经足够,但如果细胞密度非常高可以适当加大裂解液的用量到150~200μl。再用手指轻弹以充分裂解细胞, 充分裂解后应没有明显的细胞沉淀。
4、10000~12000g,4℃离心10~15min(如无低温离心机,室温下离心亦可), 取上清。
5、进行后续的PAGE、Western、免疫沉淀和免疫共沉淀等操作。
(三) 组织样本
1、取Common Lysis Buffer 置于室温溶解混匀后,使用前取适当量的裂解液加入PMSF,
使其最终浓度为1mM。
2、把组织剪切成细小的碎片,越小越好。
3、取在液氮或超低温冰箱中冷冻30min以上的组织,迅速用液氮研磨,研磨过程尽量控
制在1~2min之内,以减少蛋白的降解。
4、按照每20mg组织加入100~200μl裂解液的比例,加入含有PMSF的Common Lysis
Buffer。冰上或4℃裂解30~60min。
5、步骤3、4亦可以采用如下过程:按照每20mg组织加入100~200μl裂解液的比例,
加入含有PMSF的Common Lysis Buffer。用玻璃匀浆器或组织研磨器匀浆,直至充分裂解,过程尽量控制在1~2min之内,以减少蛋白的降解。
6、10000~12000g,4℃离心10~15min (如无低温离心机,室温下离心亦可),取上清。
7、进行后续的PAGE、Western、免疫沉淀和免疫共沉淀等操作。
注意事项:
1、在壁培养细胞的操作步骤中,去除贴壁细胞的培养液后,如果血清中的蛋白没有干扰,
可以不用清洗。
2、如果裂解不充分可以适当增加裂解液的用量,如果需要高浓度的蛋白样品,可以适当减
少裂解液的用量。
3、在培养细胞的裂解中,如果细胞量较多,必需分装成50~100万细胞/离心管,然后再
裂解。大团的细胞较难裂解充分,而少量的细胞由于裂解液容易和细胞充分接触,相对比较容易裂解充分。
4、如果组织样品本身非常细小,可以适当剪切后直接加入裂解液裂解,通过强烈vortex
使样品裂解充分。然后同样离心取上清,用于后续实验。直接裂解的优点是比较方便,不必使用匀浆器,缺点是不如使用匀浆器那样裂解得比较充分。
5、溶解Leagene Common Lysis Buffer的时候,应尽量缩短溶解时间,避免裂解液中的
有效成分失效。
6、细胞裂解的操作步骤,应置于冰上或4℃进行。
7、为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。
有效期:12个月有效。
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