蛋白裂解液
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蛋白质的定位与蛋白质裂解液的选择:
全细胞:NP-40或RIPA
细胞质(可溶):Tris-HCl
细胞质(细胞骨架):Tris-Triton
细胞膜:NP-40或RIPA
细胞核:RIPA
线粒体:RIPA
RIPA裂解液配方
Aprotinin 10μg/μl ;用10mM HEPES-KOH(PH8.0)溶解,备用。
●Nonidet P-40简称NP-40,乙基苯基聚乙二醇,常用非离子性去垢剂。
●Na-deoxycholale,脱氧胆酸钠,离子型去垢剂。离子型去垢剂主要作用有:裂解细胞;溶解蛋白,尤其是可以溶解一些难溶于水的蛋白,如膜蛋白等;很适合做WB,但在Co-IP中使用,需要谨慎。
●亮抑霉肽(Leupeptin):抑制丝氨酸蛋白酶包括胰蛋白酶、纤溶酶、猪胰激肽原酶)和半胱氨酸蛋白酶(包括木瓜蛋白酶和组织蛋白酶B)
●抑肽素A(Pepstatin A)抑制各种天门冬氨酸蛋白酶,例如组织蛋白酶D、肾素、胃蛋白酶、细菌天门冬氨酸蛋白酶和HIV蛋白酶;
●胰凝乳蛋白酶抑制剂(Chymostatin)抑制具有糜蛋白酶类特异性丝氨酸蛋白酶(包括糜蛋白酶、胃促胰酶、组织蛋白酶G)和大多数丝氨酸蛋白酶(包括组织蛋白酶B,H,L)
●抗木瓜蛋白酶(Antipain)抑制木瓜蛋白酶、胰蛋白酶和纤溶酶。
●氟化钠抑制酸性磷酸酶
●正钒酸钠:抑制碱性磷酸酶和酪氨酸磷酸酶(tyrosine phosphatase)
●焦磷酸钠(sodium pyrophosphate):抑制丝氨酸-苏氨酸磷酸酶(serine-threonine phosphatase)。
在与蛋白相关的检测中,首先最关键的一步便是蛋白质的提取。蛋白质的提取过程中,我们要经常加和蛋白酶抑制剂以防止蛋白质的降解。另外在磷酸化蛋白的研究过程中,磷酸酶抑制剂也是必不可少的,本文总结了常用的蛋白酶抑制剂PMSF,Leupeptin 亮肽素,Aprotinin 抑肽酶,Pepstatin胃蛋白酶抑制剂,EDTA-Na2等以及磷酸酶抑制剂NaF氟化钠,Na3VO4 原矾酸钠,BETA-glycerophosphate 甘油磷酸钠,Na2P2O4 焦磷酸钠等。对这些蛋白酶抑制剂的溶解配制,贮存液与工作液浓度,保存都做了详细的说明。
PMSF:
特性:丝氨酸蛋白酶抑制剂,如胰凝乳蛋白酶,胰蛋白酶和凝血酶,也抑制半胱氨酸蛋白酶如木瓜蛋白酶(可逆的地面处理)。
溶解性:溶于异丙醇,乙醇,甲醇和丙二醇果>10mg/ml。在水溶液中不稳定。在100%异丙醇,+25℃时稳定至少9个月
分子量:174.2
使用:贮存浓度:200mM,工作浓度:1mM
Leupeptin 亮肽素
特性:抑制丝氨酸和半胱氨酸蛋白酶如胰蛋白酶,木瓜蛋白酶,纤溶酶,和组织蛋白酶B
溶解性:高度溶于水(1mg/ml)。4℃一周稳定,分成小份冷冻在-20℃至少6个月
分子量:C20H38N6O4 x 1/2 H2SO4:475.6
C20H38N6O4 x 1/2 H2SO4 x H2O:493.6
使用:贮存浓度:1mg/ml,工作浓度0.5 ug/ml (1mM)
Aprotinin抑肽酶
特性:丝氨酸蛋白酶抑制剂,抑制纤维蛋白溶酶,激肽释放酶,胰蛋白酶,糜蛋白酶的高活性。不抑制凝血酶或因子X。
溶解性:易溶于水(10mg/ml)或缓冲液(例如,tris,0.1M,pH8.0)。pH约7-8的溶液在4℃可保存1周,分装保存在-20℃可至少保存6个月。避免反复冻融, pH>12.8的碱性环境可使其灭活。
分子量:6,512
使用:贮存浓度:1mg/ml, 工作浓度:0.06–2.0 ug/ml(0.01–0.3 uM)
Pepstatin胃蛋白酶抑制剂
特性:抑制天冬氨酸(酸)蛋白酶如胃蛋白酶,肾素,组织蛋白酶D,凝乳酶,许多微生物酸性蛋白酶
溶解性:溶于甲醇约1mg/ml;可溶于乙醇,过夜溶解可达到1 mg/ml;在6当量乙酸中溶解度为300ug/ml。4℃稳定一周,分装储存于-20℃时可保存1个月
分子量:685.9
使用:贮存浓度:1mg/ml,使用浓度:0.7 μg/ml(1 μM)
EDTA-Na2
特性:金属蛋白酶抑制剂
溶解性:溶于水至0.5M,在pH8-9的条件下,4℃稳定至少6个月
分子量: 372.24
使用:工作浓度:0.2–0.5 mg/ml(0.5–1.3 mM),不需现用现配,在溶液pH值调至8-9时再加入。
NaF氟化钠
溶解性:溶于水
分子量:41.99
使用:贮存液:5M 工作浓度:10-20mM
Na3VO4原矾酸钠
分子量:183.91
溶解性:溶于水,我们购买过来的是原矾酸钠.原矾酸钠需要经过处理以后才能成为激活的矾酸钠,激活的矾酸钠才具有抑制去磷酸化的作用.原矾酸钠变成激活的矾酸钠的过程是:
100mM原矾酸钠激活储存液配制
(1).取0.183克的原矾酸钠溶解于10ml的双蒸水中,加酸调节PH至10(颜色变黄)
(2).煮至无色
(3).室温冷却
(4).重调PH至10
(5)重复(1)(2)(3)(4)直至溶液保持无色,并且PH稳定于10,分装100ul/管,每10ml 裂解液加一管.(终浓度为1mM),-20度保存.
使用:贮存液:100mM 工作浓度:1mM
BETA-glycerophosphate 甘油磷酸钠
溶解性:溶于水
分子量:306.11
使用:贮存液:100mM 工作浓度:25mM
Na2P2O4焦磷酸钠
溶解性:溶于水
分子量:265.9
贮存液:100mM, 工作浓度:1-2 mM
SDS ,NP-40 ,TritonX-100这三种去垢剂的作用是不同的,或者说作用力量强弱不同。SDS属于离子型去垢剂,最厉害,基本可以把细胞完全破掉,DNA会释放出来,裂解液变得很粘稠。
NP-40是很温和的去垢剂,1%浓度的基本可以破坏掉胞膜,而对核膜破坏的作用弱,结合特定的buffer可以获得胞浆蛋白。
TritonX-100的能力介于NP40和SDS之间,偏向于NP40,也是常用的细胞裂解液成分之一,在保护蛋白活性方面有一定作用(SDS基本会使蛋白变性失活)。
Brij Buffer I