蛋白裂解液

合集下载
  1. 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性,平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
  2. 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
  3. 3、如文档侵犯您的权益,请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间:9:00-18:30)。

蛋白质的定位与蛋白质裂解液的选择:

全细胞:NP-40或RIPA

细胞质(可溶):Tris-HCl

细胞质(细胞骨架):Tris-Triton

细胞膜:NP-40或RIPA

细胞核:RIPA

线粒体:RIPA

RIPA裂解液配方

Aprotinin 10μg/μl ;用10mM HEPES-KOH(PH8.0)溶解,备用。

●Nonidet P-40简称NP-40,乙基苯基聚乙二醇,常用非离子性去垢剂。

●Na-deoxycholale,脱氧胆酸钠,离子型去垢剂。离子型去垢剂主要作用有:裂解细胞;溶解蛋白,尤其是可以溶解一些难溶于水的蛋白,如膜蛋白等;很适合做WB,但在Co-IP中使用,需要谨慎。

●亮抑霉肽(Leupeptin):抑制丝氨酸蛋白酶包括胰蛋白酶、纤溶酶、猪胰激肽原酶)和半胱氨酸蛋白酶(包括木瓜蛋白酶和组织蛋白酶B)

●抑肽素A(Pepstatin A)抑制各种天门冬氨酸蛋白酶,例如组织蛋白酶D、肾素、胃蛋白酶、细菌天门冬氨酸蛋白酶和HIV蛋白酶;

●胰凝乳蛋白酶抑制剂(Chymostatin)抑制具有糜蛋白酶类特异性丝氨酸蛋白酶(包括糜蛋白酶、胃促胰酶、组织蛋白酶G)和大多数丝氨酸蛋白酶(包括组织蛋白酶B,H,L)

●抗木瓜蛋白酶(Antipain)抑制木瓜蛋白酶、胰蛋白酶和纤溶酶。

●氟化钠抑制酸性磷酸酶

●正钒酸钠:抑制碱性磷酸酶和酪氨酸磷酸酶(tyrosine phosphatase)

●焦磷酸钠(sodium pyrophosphate):抑制丝氨酸-苏氨酸磷酸酶(serine-threonine phosphatase)。

在与蛋白相关的检测中,首先最关键的一步便是蛋白质的提取。蛋白质的提取过程中,我们要经常加和蛋白酶抑制剂以防止蛋白质的降解。另外在磷酸化蛋白的研究过程中,磷酸酶抑制剂也是必不可少的,本文总结了常用的蛋白酶抑制剂PMSF,Leupeptin 亮肽素,Aprotinin 抑肽酶,Pepstatin胃蛋白酶抑制剂,EDTA-Na2等以及磷酸酶抑制剂NaF氟化钠,Na3VO4 原矾酸钠,BETA-glycerophosphate 甘油磷酸钠,Na2P2O4 焦磷酸钠等。对这些蛋白酶抑制剂的溶解配制,贮存液与工作液浓度,保存都做了详细的说明。

PMSF:

特性:丝氨酸蛋白酶抑制剂,如胰凝乳蛋白酶,胰蛋白酶和凝血酶,也抑制半胱氨酸蛋白酶如木瓜蛋白酶(可逆的地面处理)。

溶解性:溶于异丙醇,乙醇,甲醇和丙二醇果>10mg/ml。在水溶液中不稳定。在100%异丙醇,+25℃时稳定至少9个月

分子量:174.2

使用:贮存浓度:200mM,工作浓度:1mM

Leupeptin 亮肽素

特性:抑制丝氨酸和半胱氨酸蛋白酶如胰蛋白酶,木瓜蛋白酶,纤溶酶,和组织蛋白酶B

溶解性:高度溶于水(1mg/ml)。4℃一周稳定,分成小份冷冻在-20℃至少6个月

分子量:C20H38N6O4 x 1/2 H2SO4:475.6

C20H38N6O4 x 1/2 H2SO4 x H2O:493.6

使用:贮存浓度:1mg/ml,工作浓度0.5 ug/ml (1mM)

Aprotinin抑肽酶

特性:丝氨酸蛋白酶抑制剂,抑制纤维蛋白溶酶,激肽释放酶,胰蛋白酶,糜蛋白酶的高活性。不抑制凝血酶或因子X。

溶解性:易溶于水(10mg/ml)或缓冲液(例如,tris,0.1M,pH8.0)。pH约7-8的溶液在4℃可保存1周,分装保存在-20℃可至少保存6个月。避免反复冻融, pH>12.8的碱性环境可使其灭活。

分子量:6,512

使用:贮存浓度:1mg/ml, 工作浓度:0.06–2.0 ug/ml(0.01–0.3 uM)

Pepstatin胃蛋白酶抑制剂

特性:抑制天冬氨酸(酸)蛋白酶如胃蛋白酶,肾素,组织蛋白酶D,凝乳酶,许多微生物酸性蛋白酶

溶解性:溶于甲醇约1mg/ml;可溶于乙醇,过夜溶解可达到1 mg/ml;在6当量乙酸中溶解度为300ug/ml。4℃稳定一周,分装储存于-20℃时可保存1个月

分子量:685.9

使用:贮存浓度:1mg/ml,使用浓度:0.7 μg/ml(1 μM)

EDTA-Na2

特性:金属蛋白酶抑制剂

溶解性:溶于水至0.5M,在pH8-9的条件下,4℃稳定至少6个月

分子量: 372.24

使用:工作浓度:0.2–0.5 mg/ml(0.5–1.3 mM),不需现用现配,在溶液pH值调至8-9时再加入。

NaF氟化钠

溶解性:溶于水

分子量:41.99

使用:贮存液:5M 工作浓度:10-20mM

Na3VO4原矾酸钠

分子量:183.91

溶解性:溶于水,我们购买过来的是原矾酸钠.原矾酸钠需要经过处理以后才能成为激活的矾酸钠,激活的矾酸钠才具有抑制去磷酸化的作用.原矾酸钠变成激活的矾酸钠的过程是:

100mM原矾酸钠激活储存液配制

(1).取0.183克的原矾酸钠溶解于10ml的双蒸水中,加酸调节PH至10(颜色变黄)

(2).煮至无色

(3).室温冷却

(4).重调PH至10

(5)重复(1)(2)(3)(4)直至溶液保持无色,并且PH稳定于10,分装100ul/管,每10ml 裂解液加一管.(终浓度为1mM),-20度保存.

使用:贮存液:100mM 工作浓度:1mM

BETA-glycerophosphate 甘油磷酸钠

溶解性:溶于水

分子量:306.11

使用:贮存液:100mM 工作浓度:25mM

Na2P2O4焦磷酸钠

溶解性:溶于水

分子量:265.9

贮存液:100mM, 工作浓度:1-2 mM

SDS ,NP-40 ,TritonX-100这三种去垢剂的作用是不同的,或者说作用力量强弱不同。SDS属于离子型去垢剂,最厉害,基本可以把细胞完全破掉,DNA会释放出来,裂解液变得很粘稠。

NP-40是很温和的去垢剂,1%浓度的基本可以破坏掉胞膜,而对核膜破坏的作用弱,结合特定的buffer可以获得胞浆蛋白。

TritonX-100的能力介于NP40和SDS之间,偏向于NP40,也是常用的细胞裂解液成分之一,在保护蛋白活性方面有一定作用(SDS基本会使蛋白变性失活)。

Brij Buffer I

相关文档
最新文档