红细胞裂解

对于组织细胞样品：
1. 新鲜组织经过胶原酶或胰酶等消化处理，通过适当方法分散成细胞悬液，离心弃上清。

2. 加入3-5倍细胞体积的红细胞裂解液，轻轻吹打混匀，裂解1-2分钟。

例如细胞沉淀的体积为1ml，则加入3-5ml的红细胞裂解液。

本步骤在室温或4度操作均可。

3. 400-500g离心5分钟，弃红色上清。

4℃离心效果更佳。

4. 如果发现红细胞裂解不完全，可以重复上述步骤2和步骤3一次。

通常极微量的红细胞不会影响后续的一些检测。

5. 洗涤1-2次：加入适量PBS、HBSS、生理盐水或无血清培养液，重悬沉淀，400-500g离心2-3分钟，弃上清。

可再重复1次，共洗涤1-2次。

洗涤液的用量通常应至少为细胞沉淀体积的5倍。

4℃离心效果更佳。

6. 根据实验需要用适当溶液重悬细胞沉淀后即可进行计数等后续实验。

对于组织细胞样品无需洗涤的快速操作步骤：
1. 新鲜组织经过胶原酶或胰酶等消化处理，通过适当方法分散成细胞悬液，离心弃上清。

2. 对于0.2ml细胞沉淀加入1ml红细胞裂解液，轻轻吹打混匀，裂解1-2分钟。

本步骤在室温或4度操作均可。

3. 加入15-20ml PBS、HBSS、生理盐水或无血清培养液，混匀。

4. 400-500g离心5分钟，弃红色上清。

4℃离心效果更佳。

5. 如果发现红细胞裂解不完全，可以重复上述步骤2和步骤3一次。

通常极微量的红细胞不会影响后续的一些检测。

6. 根据实验需要用适当溶液重悬细胞沉淀后即可进行计数等后续实验。

说明：对于常规步骤，多一步洗涤过程中的离心，但可以节省洗涤液的用量，并且洗涤效果也更好一些，同时不需要大体积的离心管。

快速步骤少了一次离心，但洗涤效果略差一些，同时需要大体积的离心管。

对于血液样品：
1. 取新鲜抗凝血，400-500g离心5分钟，离心弃上清。

2. 加入6-10倍细胞体积的红细胞裂解液，轻轻吹打混匀，裂解1-2分钟。

例如细胞沉淀的体积为1ml，则加入6-10ml的红细胞
裂解液。

本步骤在室温或4度操作均可。

注意：对于鼠的血液，裂解1-2分钟已经足够，对于人的外周血，宜延长裂解时
间至4-5分钟，并且裂解过程中宜适当偶尔摇动以促进红细胞裂解。

3. 400-500g离心5分钟，弃红色上清。

4℃离心效果更佳。

4. 如果发现红细胞裂解不完全，可以重复上述步骤2和步骤3一次。

通常极微量的红细胞不会影响后续的一些检测。

5. 洗涤1-2次：加入适量PBS、HBSS、生理盐水或无血清培养液，重悬沉淀，400-500g离心2-3分钟，弃上清。

可再重复1
次，共洗涤1-2次。

洗涤液的用量通常应至少为细胞沉淀体积的5倍。

4℃离心效果更佳。

6. 根据实验需要用适当溶液重悬细胞沉淀后即可进行计数等后续实验。

注意：对于微量或少量的血液样品，可以在第一步中不进行离心弃上清的操作，直接在第二步中加入10倍血液体积的红细胞裂
解液，并在室温或4℃裂解4-5分钟。

对于鼠的血液，裂解4-5分钟已经足够，对于人的外周血，宜延长裂解时间至10分钟，但
通常不宜超过15分钟，并且裂解过程中宜适当偶尔摇动以促进红细胞裂解。

后续步骤相同。

对于血液样品无需洗涤的快速操作步骤：
1. 每1ml新鲜抗凝血中加入10ml红细胞裂解液，轻轻吹打混匀，裂解4-5分钟。

本步骤在
室温或4度操作均可。

注意：对于鼠
的血液，裂解4-5分钟已经足够，对于人的外周血，宜延长裂解时间至10分钟，但通常不宜超过15分钟，并且裂解过程中
宜适当偶尔摇动以促进红细胞裂解。

2. 加入20-30ml PBS、HBSS、生理盐水或无血清培养液，混匀。

3. 400-500g离心5分钟，弃红色上清。

4℃离心效果更佳。

4. 如果发现红细胞裂解不完全，可以重复上述步骤2和步骤3一次。

通常极微量的红细胞不会影响后续的一些检测。

5. 根据实验需要用适当溶液重悬细胞沉淀后即可进行计数等后续实验。

说明：对于常规步骤，多一步洗涤过程的离心，但可以节省洗涤液的用量，并且洗涤效果也更好一些，同时不需要大体积的离心管。

快速步骤少了一次离心，但洗涤效果略差一些，同
时需要大体积的离心管。

5.细胞分选
5.1分选细胞样本处理
贴壁细胞培养：一个细胞样本悬浮细胞培养：一个细胞样本
至少需要一个10cm细胞板细胞总数应大于1×107
(细胞总数大于1×107 )
收集细胞
去除培养液
胰酶消化(一般加入2ml胰酶，
37 ºC充分消化，大约3分钟,
消化至细胞轻拍脱壁)
加入5ml培养液中和，充分
分散细胞(尽量使之呈单
细胞悬液,可通过显微镜观察判断)
取100ul细胞上机，测定转染效率，剩余细胞记数，离心
根据转染效率，分选模式(一般选用exclusion模式)，调节细胞浓度，达到上样速率1000-3000个/秒，目的细胞300个/秒(细胞浓度(个/ul)=300/目的细胞百分率)
上机，分选
分选后细胞，1500转/秒，5min,离心收集细胞
1) 若所要分选的是悬浮细胞，要求细胞总数大于1×107，直接收集细胞液
2) 必需的control：举例说明，如果需要筛选的是GFP阳性的细胞，必须提供没
有转染的同种细胞。

3) 如果分选后的细胞还需要继续培养，需要预先用无菌的4%BSA包埋收集管
(在无菌收集管中，加满4%BSA ，并放置于4℃至少1小时，使用前倒除包埋液)。

4) 如果分选后的细胞还需要继续培养，所有用到的试剂，包括鞘液，都必须无
菌处理；在分选前及分选过程中，必须进行严格无菌操作，机器需要经过酒精冲洗，无菌PBS冲洗的过程。

5.2 分选细胞的上机操作程序
5.2.1上机分选前准备
1)无菌分选
分选前夜FACS仪器间需紫外照射过夜，收集管预先用4%BSA包埋(4℃至少1小时) 分选前冲洗机器程序：1. 将上样管换成75%酒精，鞘液桶中换成3L 75%酒精冲洗，至3L酒精完全跑完； 2. 倒去鞘液桶中残余的酒精，用无菌PBS冲洗鞘液桶使酒精彻底去除，加无菌PBS至鞘液桶满，同时上样管中换成无菌PBS，冲洗，使每个收集管收集液体约20ml 左右,即可上机分选。

2)非无菌分选
如果不需要无菌分选，可仅用少量酒精冲洗，再用PBS冲洗至每管收集约20ml后即可上机分选。

5.2.2 上机分选步骤
打开cellquest软件，先上control样本，确定细胞获取条件，并划定需要获取的细胞范围；在Acquire menu菜单下，选择SortSetup，并设定SortSetup下的一系列参数，设定完毕，Acquire,上样分选。

注：SortSetup下主要的参数设定如下：
SortGate选择分选门，SortCount选择0(连续分选)，
SortMode选择分德国美天妮磁珠分选.ppt
选模式(一般使用exclusion)
*须知：分选完毕后，用水冲洗，使每个收集管收集液体约20ml 左右后可停止(防止分选管道中形成盐结晶)。

继而用常规冲洗方法冲洗上样管。