乳酸菌胞外多糖的生物合成及其遗传调控

乳酸菌胞外多糖的生物合成及其遗传调控

*

姚晶1，任婧2，吴正钧2，王荫榆2，郭本恒

1，2

1（上海海洋大学食品学院，上海，

201306）2（乳业生物技术国家重点实验室光明乳业股份有限公司技术中心，上海，

200436）摘

要

作为食品级的乳酸菌分泌的胞外多糖，由于其具有很多优良的功能特性，成为了近年来的研究热点。

胞外多糖产量偏低限制了其工业化应用，因此从基因水平上探索增加乳酸菌胞外多糖产量的途径是大有裨益的。文中详细阐述了胞外多糖的分类、结构，同型多糖和异性多糖生物合成过程及其差异，以及在合成过程中的遗传调控，并介绍了一些增加产量的有效调控手段，为深入的研究提供理论参考。关键词

乳酸菌，胞外多糖，生物合成，遗传调控

第一作者：硕士研究生（郭本恒教授为通讯作者，E-mail ：guo-benheng@ ）。

*“十一五”国家科技支撑计划（2006BAD04A14，

2006BAD04A06）。收稿日期：2010－08－13，改回日期：2010－12－17

胞外多糖（Exopolysaccharide ，

EPS ）是一种微生物在生长过程中分泌到细胞外的长链多糖。以荚膜的形式附着在细胞表面的胞外多糖称为荚膜多糖（capsular polysaccharides ，CPS ），以黏液的形式分散在胞外环境中的胞外多糖称为游离多糖（或黏液多

糖）。很多微生物都能分泌EPS ，

尤其是乳酸菌（Lac-tic acid bacteria ，LAB ）。LAB 是公认安全（generally

recognized as safe ，

GRAS ）的食品级微生物，EPS 作为LAB 重要的次生代谢产物，具有很高的研究和利用价值。20世纪40年代开发出的由肠膜明串珠菌

（L .mesenteroides ）产生的右旋糖酐（dextrans ）是最早被开发利用的乳酸菌胞外多糖，也是食品和药品管理

局（Food and Drug Administration ，

FDA ）批准的第一种食品级微生物胞外多糖。至今，人们已经筛选出了多

株产EPS 的LAB 。不同LAB 菌株EPS 的合成量是不同的，

而EPS 合成量的高低决定其发酵菌株是否适用于工业化生产。目前，对于培养基、培养条件、生长因子等外部因素影响EPS 合成量的报道已经很多，而从LAB 的遗传和生理角度对其EPS 合成量影响的报道甚是少见。深入理解和研究LAB 基因簇对EPS 的合成调控，可以从基因水平促进EPS 合成量的增加，从而实现EPS 的工业化生产。本文系统阐述了LAB EPS 相关的生物合成途径、遗传调控体系以及一些有效的调控手段。

1

产EPS 的LAB 菌株及其分类

1.1

产EPS 的菌株

产EPS 的LAB 来源广泛，绝大部分来源于乳制

品，如［1］

酸奶、Kefir 制品、奶酪等，还有一些来源于发

酵肉制品和蔬菜等。目前已经报道的产EPS 的LAB

有

［2］

：嗜热链球菌（S .thermophilus ）、嗜酸乳杆菌（Lb .acidophilus ）、干酪乳杆菌（L .casei ）、德氏乳杆菌

保加利亚亚种（Lb .delbruec kii ssp.bulgaricus ）、瑞士乳杆菌（Lb .helveticus ）、乳酸乳球菌乳脂亚种

（Lc .lactis ssp.cremoris ）、乳酸乳球菌（Lc .lactis ）、植物乳杆菌（L .plantarum ）、肠膜明串珠菌（Leuc .mesenteroides ）、酒样乳杆菌（L .kefiranofaciens ）等等。其中研究较多的是

［3］

：嗜热链球菌筛选菌株

S .thermophilus EU20，NCFB2393，IMDO 01，SFi6，SFi39和Sfi12等；保加利亚乳杆菌（Lb .bulganicus ）筛

选菌株L .bulganicus CNRZ 397，

CNRZ 1187，CNRZ 416，

Lb1，LY03等；乳酸乳球菌乳脂亚种筛选菌株L .lactis subsp.cremoris NIZO B35，NIZO B40，AHR 53等。

1.2EPS 的种类及其结构

根据所在位置的不同，可以分为荚膜多糖和黏液多糖。荚膜多糖又可以分为：（1）大荚膜，简称荚膜，可在光学显微镜下看到，最低厚度为0.25μm ，具有

相当大的外部表面积；（2）微荚膜，

厚度在0.2μm 以下，光学显微镜看不到，可用免疫学方法检验；（3）粘液层堆积在细胞表面，其多糖成分常渗入培养基中。粘液多糖可以进入培养基形成黏液

［4］

。

根据合成位点和模式的不同，

LAB EPS 又可以分为同型多糖（homopolysaccharides ，

HoPS ）和异型多糖

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（heteropolysaccharides，HePS）。HoPS含有4个亚基，即：（1）α-D-葡聚糖，主要由葡萄糖残基以α-1，6键连接，同时在3位有不同程度分支，在2位和4位上很少有分支；（2）β-D-葡聚糖，由葡萄糖以β-1，3键连接，以β-1，2键形成分支；（3）果聚糖，主要由以β-2，6键连接的D-果糖分子组成；（4）其它，像聚半乳糖，它是由结构一致的重复单体以不同的糖苷键连接组成的。HePS主要由嗜热菌和嗜温菌产生，由不同的糖单体组成，此类多糖由几种糖单体共同组成糖单元进一步连接而成，且每一个糖单元中包含有2种以上的单糖。通常组成LAB EPS的糖单体包括葡萄糖、半乳糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、海藻糖、N-乙酰半乳糖胺（GlcNAc）和乙酰半乳糖（GalNAc）等。HePS的分子量在4ˑ104 6ˑ106u之间，而分子质量的大小，又是EPS功能性质的决定因素［5］。与HoPS相比，其结构更复杂些，不同的HePS，其重复结构单元中单糖之间的连接方式也不同［3］。

EPS具有与蛋白质类似的三维立体结构，其一级结构，即糖基的组成、糖基排列顺序、相邻糖基的连接方式、异头碳构型以及糖链有无分支、分支的位置等，决定了它的高级结构。一级结构中相对较小的变化都会引起EPS空间构型及其性质的巨大改变［6］。LAB EPS中存在3种重要的结构单元：（1）葡聚糖，主要是由α-1，6和α-1，3连接的葡聚糖残基；（2）果聚糖，主要由β-2，6键连接的果糖分子；（3）四聚糖，一般由β-1，3键连接。随着对LAB EPS研究的不断深入，通过生化手段和分子生物学手段改变其一级结构，从而定向生产出优良性能的EPS，为实现工业化生产奠定基础。

2EPS的生物合成

EPS的生物合成因菌种不同而发生在生长的不同阶段和环境条件下。按合成位点和合成模式的不同，分为位于细胞壁外的HoPS的合成与位于细胞质内的HePS的合成。

2.1HoPS的生物合成

HoPS，如葡聚糖（dextran）、果聚糖（levan），是在LAB细胞外合成的。HoPS的合成可以在LAB培养液中，也可以在无细胞的酶液中进行［7］。HoPS的合成体系包括糖基供体（蔗糖）、糖基受体（延长中的糖基链）及糖基转移酶（如葡聚糖蔗糖酶，dextransu-crase）。HoPS的合成是单链反应，合成的能量来源于蔗糖的水解。高能态的糖基转移酶是一个核苷酸转移酶，它将糖基供体的糖基基团转移到糖基受体上，蔗糖可以启动自身的多聚化反应。图1所示的是葡聚糖的生物合成反应。

图1葡聚糖的生物合成反应

2.2HePS的生物合成

较HoPS的生物合成相比，HePS的生物合成过程比较复杂，涉及到多种酶与蛋白质。HePS的生物合成是在细胞质内由许多复合体聚合而成的。典型的HePS合成途径见图2。由图2可以看出，葡萄糖和乳糖是HePS的来源。葡萄糖-6-磷酸是糖酵解途径和HePS合成途径的关键中间产物：既可以经磷酸己糖异构酶转化形成果糖-6-磷酸，进入糖酵解途径，产生的ATP中一部分用于HePS的合成；又可以经α-磷酸葡萄糖变位酶转化形成葡萄糖-1-磷酸，进入HePS合成途径。葡萄糖-1-磷酸经相关酶转化形成HePS前体糖核苷酸，这些糖核苷酸发挥着重要的作用，不仅为聚合提供能量，而且可以激活糖基和促进糖基的相变（如差向异构、脱羧、脱氢等）。糖核苷酸前体在糖基转移酶作用下，将第一个糖基加载在一种磷酸盐脂载体上，随后相关的一种或多种特异性糖基转移酶按一定顺序将新的糖基加载在不断增长的重复单元上［7］，最终聚合成HePS，通过细胞膜转移分泌到胞外。目前重复单元的聚合机制以及聚合体的分泌输出机制仍不是很清楚。但已有初步证据证明LAB中存在类异戊二烯脂载体［9］。图3所示的是乳酸乳球菌乳脂亚种NIZO B40HePS的生物合成模型。

通过和HoPS的合成体系比较可以发现，HePS 的合成体系除了具有糖基供体（糖核苷酸）、糖基受体（增长中的重复单元）外，还包括脂载体、酰基供体及酶系统。脂载体整合多糖的重复单元；乙酸、丙酮