基因工程课程综合实验---转基因斑马鱼的构建

TALEN构建与斑马鱼基因组定点突变的实验方法与流程

TALEN构建与斑马鱼基因组定点突变的实验⽅法与流程HEREDITAS (Beijing)2013年4⽉,35(4):533―544ISSN /doc/1a6ad63daaea998fcc220ed0.html实验指南收稿⽇期:2012?12?30;修回⽇期:2013?02?05基⾦项⽬:国家重⼤科学研究计划项⽬(编号：2012CB945101和2011CBA01000)和国家⾃然科学基⾦项⽬(编号：31110103904)资助作者简介:沈延,博⼠,研究⽅向：斑马鱼遗传与发育机制。

Tel ：010-********;E-mail:yshen@/doc/1a6ad63daaea998fcc220ed0.html 通讯作者:张博,博⼠,教授,研究⽅向：斑马鱼遗传与发育机制。

E-mail:bzhang@/doc/1a6ad63daaea998fcc220ed0.html 致谢:感谢祖尧为改进检测技术做出的贡献。

⽹络出版时间:2013-3-515:03:12URL:/doc/1a6ad63daaea998fcc220ed0.html /kcms/detail/11.1913.R.20130305.1503.002.htmlDOI:10.3724/SP.J.1005.2013.00533TALEN 构建与斑马鱼基因组定点突变的实验⽅法与流程沈延,黄鹏,张博北京⼤学⽣命科学学院,细胞增殖与分化教育部重点实验室,北京100871摘要:类转录激活因⼦效应物核酸酶(Transcription activator-like effector nuclease,TALEN)是最近发展起来的⼀类新型的⼈⼯核酸内切酶,它由特异性的TALE DNA 结合结构域和⾮特异性的Fok Ⅰ核酸内切酶切割结构域组成。

TALEN 能够根据⽤户需要切割特定的核苷酸靶序列,造成DNA 双链断裂,从⽽诱导该靶序列产⽣indel 突变,⽬前已成功地应⽤于多个物种或体外培养细胞的基因组定点突变。

基因敲除斑马鱼构建方法!

基因敲除斑马鱼构建方法!一、基因敲除的设计方案1.1 基因的基本信息确认斑马鱼基因的基本信息，包括名称ID号等，一般会在NCBI 等查询。

1.2 分析基因结构、氨基酸序列等做生物学信息的分析1.3分析蛋白质的保守结构功能域通过综合考虑，设计最佳的KO靶点。

1.4 分析并设计CRISPR，分析其效率及脱靶的情况一般使用CCTOP，少数物种如没有可找其它专业网站。

二、CRISPR活性验证2.1 分析并确认基因组序列设计Genotyping引物，确认实际基因组序列与理论匹配情况，如CRISPR靶点验证与理论序列存在出入，需回到1.4重做。

该步骤还需要确认引物扩增条件，以备后用，如不能正常扩增需要重新设计，并且不能进行下一步操作。

2.2 合成sgRNA使用Thermo转录试剂盒转录，完成后需测定浓度（不得低于400 ng/μl）和OD值（260/280需在1.8~2.2）。

2.3 显微注射将上述合成好的sgRNA按照一定的比例与Cas9蛋白预混，使用显微注射技术将其注入斑马鱼早起胚胎中。

2.4 活性验证随机选取8~24 hpf的8枚注射后的胚胎通过PCR后将其产物送商业公司sanger测序，需要看到至少有一组在靶向位置存在Indel突变。

•如有，挑取存在Indel突变的亚克隆确认；•如没有，回到2.3或2.2或1.4（具体回到哪一步需要根据实际情况决定）三、突变体制备及确认3.1 F0饲养如2.4验证有活性，一般需要显微注射400~500枚胚胎作为F0（一般由胚胎发育至成体有10~20%），至少需要40尾以上的F0。

3.2 F0可遗传突变的确认将上述F0亲本与野生型杂交（或者自交），将所产胚胎随机选取8枚经测序确认，如存在Indel突变，则该F0亲本即为可遗传突变体。

以此方法至少鉴定出3尾可遗传的F0。

3.3 F1饲养将3.2至少3尾亲本经交配，每组一般15~25尾，一般总量需到达40~50尾。

3.4 F1确认将3.3的F1饲养至2~2.5月龄,获得其尾鳍基因组，通过PCR后测序确认其具体基因型（要求必须是移码突变或出现提前终止密码子的突变）。

基因工程试验指导

《基因工程》实验指导湖南师范大学生命科学学院遗传与发育生物学系2009年5月基因工程课程综合实验---转基因斑马鱼的构建一、实验目的本课程的教学目的是让学生对基因工程技术所涉及的主要环节的基本原理、完整流程和基本技术进行系统地学习和掌握，培养学生具有通过这些原理进行基因工程实验和研究方面的设计能力。

在基因工程理论课程的讲授和实践课程的实际操作过程中对学生进行基因操作与社会伦理方面的训练和教育，重在素质和能力的培养。

二、实验原理转基因动物（transgenic animal）是指动物所有细胞基因组中整合有外源基因的一类动物，具有将外源基因遗传给子代的能力，整入动物基因的外源基因被称为转基因（transgene）。

转基因动物技术是常规分子生物学技术的延伸和拓展，是基因工程技术的核心内容之一，它不仅为人们研究生命科学提供了一个更有效的工具，转基因技术是生物学领域最新重大进展之一，已能渗透到生物学、医学、畜牧学等学科的广泛领域。

转基因动物已成为探讨基因调控机理、致癌基因作用和免疫系统反应的有力工具。

同时人类遗传病的转基因动物模型的建立，为遗传病的基因治疗打下坚实的理论和实验基础。

转基因技术涉及外源基因的获取、重组载体的构建与检测鉴定、受体系统的准备、显微注射基因导入、供转基因胚胎发育的体外培养系统和宿主动物的饲养等方面的内容。

三、材料限制性内切酶：Eco R I、Sal I、Age I、Not I、Bam H I；T4 DNA聚合酶；LA DNA聚合酶混合物均为大连TaKaRa公司产品；3. 2菌株及细胞系DH5α感受态细胞：由本实验室自行制备并存于-20℃；3. 3 质粒与表达载体系统3. 3.1 pEGFP-N1载体pEGFP- N1载体是一种把异源性的蛋白质融合至EGFP的N端的哺乳动物表达载体，为Clontech公司的产品。

含有人类巨细胞病毒（CMV）启图1 含有绿色荧光蛋白基因的卡那霉素抗性的pEGFP-N1质粒动子，SV40 Poly A尾，pUC复制起始点（原核）和SV40复制起始点（真核），20个多克隆位点，具有筛选标志卡那霉素（原核）和新霉素（真核）的抗性基因，见图1。

斑马鱼p53基因原核表达载体的构建及其在大肠杆菌中的表达

p53 基因在大肠杆菌中成功表达，表达的 p53 融合蛋白分子量大约为 53kD，透析复性后获得了高纯度
可溶性的 p53 蛋白。
关键词：p53 基因；斑马鱼；原核表达
中图分类号：Q786
文献标识码：A
文章编号：0439－8114 （2010）03－0526-03
胞。挑取单克隆菌落接种于 LB 培养基中，37℃摇荡过夜，转接扩大培养至菌液 OD600 达 0．5～0．8 时，加入终浓度为 1 mmol ／ L 的 IPTG，37℃ 诱导 1、3、5h 后，分别取样进行 SDS－PAGE 分析，5 h 后收集菌体溶于溶菌缓冲液（50 mmol ／ L NaH2PO4，300 mmol ／ L NaCl，10 mmol ／ L 咪唑，pH 值 8．0）中，超声破碎菌体，12 000 r ／ min 离心 20 min，分别取上清和沉淀进行 SDS－PAGE 分析。 1．2．6 p53 蛋白的变性纯化及复性参照 Qiagen 镍柱蛋白纯化操作步骤，在变性条件下纯化以包涵体形式表达的 p53 蛋白。采用尿素梯度透析法对纯化的 p53 蛋白进行复性，尿素浓度梯度分别为 8、6、 4、2，0M。首先将变性纯化的 p53 蛋白用变性结合缓冲液（8 mol ／ L 尿素，100 mmol ／ L NaH2PO4，100mM Tris－HCl， pH 值 8．0）稀释 5 倍后装入透析袋中，放置在透析液中（100 mmol ／ L Tris－HCl，100 mmol ／ L NaH2PO4，1 mmol ／ L EDTA，2 mmol ／ L 还原型谷胱甘肽，0．2 mmol ／ L 氧化型谷胱甘肽，20％丙三醇，1％甘氨酸，pH 值 8．0），4℃磁力搅拌透析 12 h，每隔 12 h 更换含低浓度尿素的透析液，其他成分不变，最后将 p53 透析至水中，离心去除沉淀，复性的 p53 蛋白冷冻干燥后经 12％ SDS－PAGE 电泳检测后于－ 80℃保存。

将制作转基因斑马鱼的实验引入本科生基因工程实验课教学的探索与实践

ｇｒｅａｔｖａｌｕｅｔｏｐｏｐｕｌａｒｉｚｅ．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃａｎｉｍａｌｓ；ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｚｅｂｒａｉｓｆｈ；ｇｅｎｅｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ；ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｔｅａｃｈｉｎｇ
ＤｏＩ：１０．３７２４／ＳＰ．Ｊ．１００５．２０１３．０１３２７
遗传学教学
将制作转基因斑马鱼的实验引入本科生基因工程实验
课教学的探索与实践
袁婺洲，邓云
湖南师范大学生命科学学院，长沙４１００８１
基因工程是生物技术的核心，涉及基因片段的获取、基因克隆、基因转化、基因的体外修饰、转基因技术、基因表达及表达产物下游的大规模生产等。基因工程作为一门实践性和技术性都很强的课
程，已经成为国内外高校生物技术、生物工程及相
ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＬＳｃｉｅｎｃｅ，ＨｕｎａｎＮｏｒｍａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｃｈａｎｇｓｈａ４１００８１，ＣｈｉｎａＡｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｅｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｏｆｒｔａｎｓｇｅｎｉｃａｎｉｍａｌｓｉｓｏｎｅｏｆｔｈｅｃｏｒｅｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙａｎｄｃｒｉｔｉｃａｌａｃｈｉｅｖｅｍｅｎｔｏｆｇｅｎｅｅｎｇｉ－

转基因斑马鱼构建技术

转基因斑马鱼构建技术
斑马鱼是一种近年来发展非常迅速的模式动物，在生物医学研究领域有越来越多的应用。

斑马鱼和人类的基因同源性85%以上，疾病信号转导通路高度保守，某些疾病相关基因与人类基因保守性高达99%，这意味着在其身上做药物实验所得到的结果在多数情况下也适用于人体，利用高效的ToI2转座酶系统可构建转基因斑马鱼。

斑马鱼作为模式动物，还具有以下的优点：
1、与人类同属于脊椎动物
2、个体较小，因此养殖需要的场地空间较小
3、繁殖力强，可进行高通量筛选
4、体外受精，便于繁育
5、药物用量小
6、早期透明，早期发育迅速，受精后24h主要器官已建成，受精后七天内部器官清晰可见，可以活体进行荧光观察斑马鱼可以用于研究基因表达调控、基因功能域发育、分化、形态发生的关系，也可以用于研究发病机理，也可以用于药物筛选。

[宝典]转基因斑马鱼构建与果蝇幼虫荧光基因的瞬时表达打印版

[宝典]转基因斑马鱼构建与果蝇幼虫荧光基因的瞬时表达打印版转基因斑马鱼构建与果蝇幼虫荧光基因的瞬时表达蒋驭天(生命科学学院 2008级生物技术 2008300113)同组人:王诗婕吕晓霞刘楚怡一.摘要:本实验对斑马鱼和果蝇幼虫分别导入含EGFP和DFP的质粒，观察其在2中动物体内的表达情况，在斑马鱼体内，绿色荧光蛋白从原肠胚到出苗期均能在荧光显微镜下观察的绿色荧光;在果蝇幼虫体内，才3-4小时时也能观察到红色荧光蛋白基因的瞬时表达。

关键字:转基因斑马鱼果蝇幼虫二.实验器材与试剂:仪器:试管、试管架、可调式微量加样器、电泳仪、电泳槽、染色缸;42?恒温水浴箱、冰浴、恒温振荡箱，超净工作台、手动显微注射器、体式显微镜，硼硅酸玻璃毛细管、倒置显微镜、摄像系统(CCD)、自动水循环系统一套，孵化水槽、培养皿、解剖镜、小规模质粒提取试剂盒。

试剂:EGFP绿色荧光蛋白基因 DFP红色荧光蛋白基因 pEGFP-N2载体 E coli三.实验步骤:转基因斑马鱼构建:1.转染细菌的培养(1)培养基的制备:称取胰蛋白胨3 g，酵母提取物1.5g，NaCl 3g，于一500 mL的三角瓶中，加入蒸馏水至300 mL溶解.若配制固体培养基，则需加入4.5 g 琼脂(1.5%)，然后用NaOH调pH至7.5。

分装于3个250 mL的三角瓶中，加塞，包扎。

(2)培养基的灭菌与消毒: 在灭菌锅中，加入适当的水，放入已包扎好的培养基，盖好盖子，加热。

当压力升至0.05 MPa时，打开放汽阀，排除冷空气，当压力回到0时，关闭放汽阀，当压力升至1.034 MPa时保持15-30分钟后，停止加热，压力降为0时，打开放汽阀排汽取物。

(3)含Amp的LB固体培养基:将配好的LB固体培养基高压灭菌后冷却至60?左右，加入Amp(氨苄青霉素)储存液,使终浓度为50 μg/mL,摇匀后铺板。

(4)接种加甘油保存的分别含质粒的E coli.，每管接种体积为10 微升(5)37 ?摇床过夜培养24h.2.质粒的小量提取提取步骤:(1). 样本处理:收集已培养12,16 小时的菌液13ml，12000rpm 离心1 分钟，尽量吸除上清。

过表达Baff转基因斑马鱼的构建

过表达Baff转基因斑马鱼的构建张力;谢英;刘树锋【摘要】Objective To construct pEGFP-Cl-baff, pEGFP-N1 -baff, and pIRES2-EGFP-baff recombinant plasmids, and establish a SLE disease model of Baff overexpressed zebrafish by microinjection and fluorescence screening . The aim is to evaluate the meaning of Baff over expression zebrafish in study of SLE mechanism and drug selection . Methods We cloned baff full length cDNA encoded by 807 bp nuclear acid using spleens RNA of zebrafish by RT-PCR and constructed 3 types of baff overexpression plasmids : pEGFP-Cl -baff, pEGFP-N1-baff- and pIRES2-EGFP-baff. Baff protein expression was estimated by in -vitro cell transfection and Western blotting. Results 3 types of baff overexpression plasmids were examined by agarose gel electrophoresis . Western blotting and in-vitro transfection confirmed the expression of Baff-GFP fusion protein. We also obtained the baff over expression zebrafish by microinjection and fluorescence screening. Conclusion All the plasmid we constructed in our research have been estimated and could be used to generate the disease model of baff overexpression zebrafish which can be manipulated for immune -disease research.%目的体外克隆斑马鱼baff基因并分别构建pEGFP-C1-baff、pEGFP-N1-baff、pIRES2-EGFP-baff重组质粒,通过胚胎显微注射获得过表达baff的转基因斑马鱼,以探讨其作为人类SLE模型和用于SLE药物筛选的意义.方法通过RT-PCR法由斑马鱼脾脏克隆出斑马鱼baff基因全长807 bp蛋白编码区域,分别构建baff过表达载体pEGFP-C1-baff,pEGFP-N1-baff 及 pIRES2-EGFP-baff重组质粒,体外细胞转染并通过免疫印迹法验证蛋白表达后,通过胚胎显微注射过表达载体,GFP荧光跟踪并筛选阳性鱼.结果通过体外细胞转染实验与免疫印迹法验证了pEGFP-C1-baff,pEGFP-N1-baff转染后细胞Baff-GFP融合蛋白的成功表达,通过胚胎显微注射与GFP荧光筛选,成功获得过表达baff的转基因斑马鱼.结论本研究所构建pEGFP-C1-baff、pEGFP-N1-baff、pIRES2-EGFP-baff重组质粒均可通过显微注射获得过表达baff的阳性转基因斑马鱼,为进一步探讨其作为人类SLE疾病模型的意义及Baff拮抗药物的筛选奠定基础.【期刊名称】《中国比较医学杂志》【年(卷),期】2012(022)011【总页数】5页(P46-49,后插4)【关键词】系统性红斑狼疮;B细胞活化因子;斑马鱼;转基因【作者】张力;谢英;刘树锋【作者单位】河北医科大学,河北省实验动物重点实验室,石家庄,050017;河北医科大学,河北省实验动物重点实验室,石家庄,050017;河北医科大学,河北省实验动物重点实验室,石家庄,050017【正文语种】中文【中图分类】R332斑马鱼具有繁殖能力强、体外受精和发育、胚胎透明、性成熟周期短、个体小易养殖，可针对治疗药物进行高通量筛选等诸多特点，使其成为后基因组时代生命科学研究中重要的模式脊椎动物之一［1，2］。

转基因斑马鱼实验

转基因动物（transgenic animal）是指基因组中整合有外源基因的一类动物，整入动物基因的外源基因被称为转基因（transgene）。

嵌合体动物（chimera mosaic animal）是只有部分组织细胞的基因组中整合有外源基因的动物，称为嵌合体动物（chimera mosaic animal）。

这类动物只有当外源基因整合入的“部分组织细胞”恰为生殖细胞时，才能将其携带的外源基因遗传给子代，一般用胚胎干细胞法或逆转录病毒载体法制备的第一代转基因动物均为嵌合体动物，而显微注射法得到的第一代转基因动物中，也有20％为嵌合体动物。

转基因动物是指动物所有细胞均整合有外源基因，则具有将外源基因遗传给子代的能力，通常被称为转基因动物。

转基因动物技术是常规分子生物学技术的延伸和拓展，它不仅为人们研究生命科学提供了一个更有效的工具，而且随着转基因动物技术的发展，转基因产品将会广泛渗透到医疗、卫生、农产品和食品中。

转基因技术是生物学领域最新重大进展之一，已能渗透到生物学、医学、畜牧学等学科的广泛领域。

转基因动物已成为探讨基因调控机理、致癌基因作用和免疫系统反应的有力工具。

同时人类遗传病的转基因动物模型的建立，为遗传病的基因治疗打下坚实的理论和实验基础。

转基因技术涉及外源基因的组建、载体、受体、基因导入技术、供转基因胚胎发育的体外培养系统和宿主动物等方面的内容。

鱼类是脊椎动物中最丰富多样性的类群，估计达30000 种。

这种多样性反映在诸如形态、行为、生殖、发育、世代时间和对环境的耐受等各种特征的广泛差异，从而使各种转基因鱼模型的常规制作既是挑战，又是机遇。

有的鱼类的卵是透明的，能直接对发育进行监察，有的情况下对活体内报告基因的表达进行判断。

有些鱼的种类还可能进行其他的遗传操作来诱导单倍体、三倍体和纯合子产雌品系。

尽管鱼的种类很多，但作研究用的却要少的多。

因为野生种群的持续减少，为帮助满足高质量蛋白质需要，水产养殖较常用鱼是鲶鱼、虹鳟鱼、罗非鱼、大西洋鲑和鲤鱼。

核酸酶I-SceI介导的转基因斑马鱼构建及连接蛋白Connexin48.5的定位研究

核酸酶I-SceI介导的转基因斑马鱼构建及连接蛋白Connexin48.5的定位研究刘俊;杨镇滔;李汉杰;田书也;韩家淮【摘要】细胞连接蛋白是由多基因家族编码的一类结构相似、分子质量不同的蛋白质.在细胞膜上,每6个相同或不同的连接蛋白围绕中央孔排列形成一个连接子,相邻细胞膜上的连接子相互对接形成细胞间隙连接,细胞间隙连接是一种重要的通讯连接,它不仅是细胞间代谢偶联、冲动传导的结构基础,而且可以通过介导与细胞的迁移、分化、增生和器官形成有关的信号物质而在胚胎发育中起重要作用.为了进一步探讨细胞间隙连接在生物体中的作用,采用斑马鱼胚胎显微注射核酸酶I-SceI 和质粒DNA的方法成功构建了绿色荧光蛋白GFP与细胞连接蛋白Connexin48.5融合表达的转基因荧光斑马鱼品系,并通过对荧光蛋白发光的观察在斑马鱼鱼体中进行连接蛋白Connexin48.5的定位.实验结果表明:核酸酶I-SceI介导下的斑马鱼转基因方法效率较高,可行性好;连接蛋白Connexin48.5在斑马鱼体内主要定位于眼球晶状体和脊索.所获得的Connexin48.5-GFP融合表达斑马鱼系,以及利用该品系进行的Connexin48.5定位研究对细胞连接蛋白在生物体内的功能研究将具有重要作用.%Connexinj are a group of proteins coded by multi gene family. On the cell membrane,every 6 Connexins combine together to form a Connexon,and two Connexons of two different cells connect with each other to form a gap junction. Gap junction is a very important kind of communicational connection between cells,which is not only the constructional basic of metabolic coupling and signal transduction betweens cells,but also the channel of signal substance controlling cell migration,differentiation,proliferation and or-ganogenesis. For a deeperstudy of gap junction function in organisms, we generated a transgenic zebrafish line that expresses Con-nexin48. 5-GFP fusion protein by co-injecting meganuclease I-Scel and plasmid DNA into zebrafish embryos. I-Scel mediated trans-genesis showed high efficiency,which made it a better way to get transgenic animals than the traditional method. While the working mechanism of I-Scel remains unclear, in our opinion, I-Seel binds to its recognition site after the cleavage and promotes nuclear localization of the transgene could be a good explanation. Using our transgenic zebrafish line, we found that Connexin48. 5 is highly expressed in lens and notochord in zebrafish. In addition to its expression in lens,which has been reported preciously,our new finding suggested that Connexin48. 5 could have important roles in notochord development or nervous system function【期刊名称】《厦门大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2012(051)006【总页数】4页(P1066-1069)【关键词】I-SceI;Connexin48.5;转基因;晶状体;脊索【作者】刘俊;杨镇滔;李汉杰;田书也;韩家淮【作者单位】厦门大学生命科学学院,细胞应激生物学国家重点实验室,福建厦门361005;厦门大学生命科学学院,细胞应激生物学国家重点实验室,福建厦门361005;厦门大学生命科学学院,细胞应激生物学国家重点实验室,福建厦门361005;厦门大学生命科学学院,细胞应激生物学国家重点实验室,福建厦门361005;厦门大学生命科学学院,细胞应激生物学国家重点实验室,福建厦门361005【正文语种】中文【中图分类】Q356.1斑马鱼属鲤科（Cyprinidae）短担尼鱼属（Brachydanio），原产于南亚，是一种常见的热带鱼，具有繁殖能力强、体外受精和发育、胚胎透明、性成熟周期短、个体小易养殖等诸多特点，特别是可以进行大规模的正向基因突变与筛选.这些特点使其成为功能基因组时代生命科学研究中重要的模式脊椎动物之一.由于斑马鱼具有胚胎透明这一突出优点，绿色荧光便于观察，我们选取其作为构建Connexin48.5－GFP融合表达品系的实验动物，从而进行细胞连接蛋白Connexin48.5的定位以及功能研究.细胞连接蛋白是构成间隙连接的基本单位，6个连接蛋白聚合成一个中间有孔道的连接子，两个连接子对接形成一个间隙连接.目前在哺乳动物中发现的连接蛋白至少有20种，分子质量从26～50ku不等，依分子质量的不同而分别命名为Connexin32、Connexin48.5、Connexin26、Connexin43、Connexin36等［1－2］.细胞间隙连接是在相互接触的细胞之间建立的有孔道的、由连接蛋白构成的亲水性跨膜通道，允许无机离子、第二信使及水溶性小分子质量的代谢物质从中通过，从而沟通细胞达到代谢与功能的统一，在细胞生长、细胞增殖与分化、组织稳态、肿瘤发生、伤口愈合等生理和病理过程中具有重要作用.我们的工作有助于进一步研究连接蛋白以及间隙连接在这些过程中的具体功能.1 材料与方法1.1 材料实验所用的pBSKI2转基因质粒，大肠杆菌DH5α，野生型斑马鱼由本实验保存；分子克隆所需试剂，Taq酶，核酸外切酶ExoⅢ，限制性内切酶，核酸酶I－SceI 等均购自 Takara公司；Tris－HCl、EDTA、氯化钠、十二烷基磺酸纳（SDS）、酚－三氯甲烷、蛋白酶K等购于上海生工生物工程有限公司.斑马鱼饲养：所用斑马鱼均饲养于厦门大学生命科学院斑马鱼室循环水系统中，温度：24～30℃，光照周期：14h（光照）∶10h（黑暗），每天3次定时投喂丰年虫.1.2 方法1.2.1 利用 LIC（ligase independent cloning）的高效克隆方法构建pBSKI2转基因质粒从斑马鱼基因组中采用PCR的方法分段扩增并回收目的片段，包括连接蛋白基因的表达调控区域及蛋白编码区域.用BamHⅠ和HindⅢ对质粒pBSKI2进行双酶切并回收.在冰上混合载体和片段，加入1μL ExoIII，吹吸混匀，反应1h，然后加入1μL 0.5 mol／L EDTA（pH 8.0），吹吸混匀，终止反应.将反应体系放入60℃水浴锅5min，然后冰浴5min.之后转化大肠杆菌DH5α，冰浴30min后42℃热激45s，冰上放置5min.涂板，37℃恒温培养箱中培养16h后挑取单克隆，扩增后进行质粒提取并鉴定，获得目的克隆.1.2.2 核酸酶I－SceI介导的高效率转基因斑马鱼构建1）斑马鱼胚胎获取：在繁殖的前一天，光周期的暗周期前用隔板将繁殖的亲鱼分开，并在水箱底部铺上隔离网以防止亲鱼产卵后吞卵.次日清晨，将水族箱中的隔板拆掉，在光照的刺激下，雄鱼开始追逐雌鱼，并用身体冲撞雌鱼的腹部，这时雌鱼产卵，雄鱼排精，受精卵落入隔离网下.在卵产下0.5h内，捞出亲鱼，收集受精卵，用培养液清洗数次，待用.2）斑马鱼胚胎显微注射：优化注射条件，尝试质粒DNA浓度梯度和重组酶浓度梯度，确定目的基因整合效率最高时的注射条件（表1）［3－4］.表1 显微注射体系Tab.1 The microinjection cocktail?将获取待用的斑马鱼胚胎在琼脂固定槽中摆放整齐，在胚胎发育的单细胞期（约受精后40min内），将适量注射液注入胚胎细胞中（确保注入细胞中，而不是卵黄中），注射体积不超过胚胎总体积的1／10，注射完成后，将胚胎置于斑马鱼胚胎培养液中，28℃培养.每晚挑出弃去死去的胚胎并换液，注射后第2天晚上，在倒置荧光显微镜下观察，挑出发荧光的胚胎置于另一培养皿中培养；注射后第4天，将小鱼移入斑马鱼幼鱼培养箱中饲养.2 实验结果2.1 GFP与Connexin48.5融合表达的转基因斑马鱼品系的构建共构建了4个不同亚型的连接蛋白与GFP的融合表达质粒（pBSKI2－Connexin48.5－GFP、pBSKI2－Connexin39.9－GFP、 pBSKI2－Connexin28.6－GFP、pBSKI2－Connexin43－GFP），经斑马鱼胚胎显微注射后，注射质粒pBSKI2－Connexin48.5－GFP 的胚胎可观察到较强的荧光（图1），其余3个质粒未见发光.挑选出注射后发荧光的胚胎后，通过饲养、杂交、自交等过程，获得了纯合的Connexin48.5－GFP融合表达的转基因斑马鱼品系.图1 pBSKI2－Connexin48.5－GFP 注射结果（60×）Fig.1Microinjection results of pBSKI2－Connexin48.5－GFP（60×）2.2 Connexin48.5在斑马鱼眼球晶状体和脊索中的表达鉴定在获得纯合的Connexin48.5－GFP融合表达的转基因斑马鱼品系后，为了确定Connexin48.5在斑马鱼全鱼中的定位，进行了共聚焦拍照，结果显示Connexin48.5在斑马鱼眼球晶状体和脊索中高表达（图2，红色箭头所指区域），在晶状体中的高表达与已有的研究结果相同［5－7］，而其在脊索中的高表达是我们的一个新发现.由于已知细胞连接蛋白表达于细胞间的连接处，为了验证获得的融合表达品系的Connexin48.5表达情况是否正常，对大量表达于细胞间隙的连环蛋白β（β－catenin）进行了免疫荧光染色（红光）从而确定细胞膜的位置，与Connexin48.5－GFP放出的绿光对比后发现存在共定位（图3），这表明获得的转基因品系的Connexin48.5的细胞内表达定位情况正常，与GFP的融合表达不影响其正常功能.3 讨论通过核酸酶I－SceI介导下的转基因方法，成功构建了Connexin48.5与GFP融合表达的转基因斑马鱼品系（Connexin48.5－GFP）.利用该品系斑马鱼，通过对绿色荧光蛋白发光的观察确定了Connexin48.5在斑马鱼全鱼中的定位，该结果在验证了已有的研究成果的同时还做出了新的发现.作为工具，该品系斑马鱼在将来Connexin48.5的功能研究中将具有重要价值.相对于直接注射线性DNA的传统转基因方法，所采用的I－SceI介导下的转基因方法具有更高的阳性率.不过对于I－SceI提高转基因效率的分子机制目前尚无研究定论，认为一个可能的解释是由于I－SceI在对质粒进行酶切后仍会继续在识别位点与DNA相互结合，这种结合可能会提高目的DNA向核内的转运效率，从而提高目的片段插入基因组的效率.过去已有的研究显示Connexin48.5在mRNA水平于斑马鱼晶状体中高表达，且有证据表明其在晶状体发育中至关重要［3－4］，我们的实验结果在蛋白水平验证了Connexin48.5在晶状体中的高表达，这对研究其在晶状体发育中的具体功能具有重要指导作用.在此基础上，还发现Connexin48.5在斑马鱼脊索中也存在高表达，这一新发现表明Connexin48.5可能在斑马鱼的脊索发育中或神经系统功能中具有重要作用，这为将来Connexin48.5的功能研究指出了新的方向.【相关文献】［1］Kibschull M，Gellhaus A，Winterhager E.Analogous and unique functions of connexins in mouse and human placental development［J］.Placenta，2008，29（10）：848－854.［2］Yeager M，Harris A L.Gap junction channel structure in the early 21st century：facts and fantasies［J］.Curr Opin Cell Biol，2007，19（5）：521－528.［3］Violette T，Clemens G，Filomena R，et al.I－SceI meganuclease mediates highly efficient transgenesis in fish ［J］.Mechanisms of Development，2002，118（1／2）：91－98.［4］Minjung K，Kyung K，Cheol K，et al.Real－time imaging of mitochondria in transgenic zebrafish expressing mitochondrially targeted GFP［J］.Biotechniques，2008，45（3）：331－334.［5］Charles K，William B，Seth K，et al.Stages of embryonic development of the zebrafish［J］.Developmental Dynamics，1995，203（1）：253－310.［6］Shaohong C，Tara C，Gunnar V.Expression of Connexin48.5，Connexin44.1，and Connexin43during zebrafish（Danio rerio）lens development［J］.Developmental Dynamics，2003，228（4）：709－715.［7］Shaohong C，Teresa S，Rickie M，et al.Connexin48.5is required for normal cardiovascular function and lens development in zebrafish embryos［J］.The Journal of Biological Chemistry，2004，279（35）：36993－37003.。

人BAFF转基因斑马鱼的构建及早期免疫基因表达检测

建立人ＢＡＦＦ转基因斑马鱼模型，探讨其在自身免疫性疾病发病中的作用。方法ＲＴ．ＰＣＲ
法由人淋巴瘤细胞克隆了人ＢＡＦＦ基因全长８５５ｂｐ蛋白编码区域，构建表达人ＢＡＦＦ重组质粒Ｔｏ１２一ｈＢＡＦＦ，体外
ｇｅｎｅｓｉｓｏｆａｕｔｏｉｍｍｕｎｅｄｉｓｅａｓｅｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ８５５ｂｐＢＡＦＦｃＤＮＡｗａｓｃｌｏｍｈｕｍａｎｌｙｍｐｈｏｍａｃｅｌｌｌｉｎｅｔｏｃｏｎｓｔｒｕｃｔｔｈｅＢＡＦＦｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｌａｓｍｉｄＴｏ１２・ｈＢＡＦＦ．ＴｈｅｐｒｏｔｅｉｎｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎＨｅＬａｃｅｌｌｓｗａｓｄｅｔｅｃｔｅｄｂｙ
张力，周昕，谢英，刘超，徐增年，刘树锋
（１．河北医科大学实验动物学部、河北省实验动物实验室，石家庄
２．河北医科大学第三医院检验科，石家庄０５００５１）
０５００１７；
【摘要】目的
【Ａｂｓｔｒａｃｔ】０ｂｊｅｃｔｉｖｅＴｏｃｏｎｓｔｒｕｃｔａｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｚｅｂｒａｉ￣ｈｍｏｄｅｌｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇｈｕｍａｎＢＡＦＦ，ａｎｄｓｔｕｄｙｔｈｅｐａｔｈｏ —

斑马鱼myo7ab基因敲除品系的构建

激光生物学报ACTA　LASER　BIOLOGY　SINICA Vol. 30 No. 3 Jun. 2021第30卷第3期2021年6月斑马鱼myo7ab基因敲除品系的构建谢缤灵1，2，邓慧玲1，2，付贵芳1，2，王金福5，谢鼎华4*，谢华平1，2，3*（1. 湖南师范大学动物肠道功能调控湖南省重点实验室，长沙 410081；2. 湖南师范大学动物营养与人体健康实验室，长沙 410081；3. 湖南师范大学淡水鱼类发育生物学国家重点实验室，长沙 410081；4. 中南大学湘雅二医院耳鼻咽喉科，长沙 410011；5. 浙江大学生命科学学院细胞与发育生物学研究所，杭州 310058）摘　要：MYO7A是人类Usher综合征（US）的致病基因。

由MYO7A突变导致的Usher综合征病例占Usher综合征1型病例的29%～55%。

研究发现人类MYO7A突变能够导致Usher综合征1B型（USH1B），包括感觉神经性听力损伤及年龄依赖性视网膜色素变性（RP），但其分子机制尚不清楚。

为了研究该基因在内耳及视网膜发育中的具体分子作用机制，利用Cloning free CRISPR/Cas9基因编辑技术构建斑马鱼myo7ab基因敲除品系。

首先，通过分析软件筛选出该基因的敲除位点，利用聚合酶链式反应（PCR）技术扩增该基因的向导DNA（gDNA），再以gDNA为模板转录得到向导RNA（gRNA），将gRNA和Cas9蛋白共同注射到斑马鱼1细胞期胚胎中；随后，进行基因编辑的有效性检测。

研究结果表明，CRISPR/Cas9系统对该基因的敲除有效。

对其进行进一步筛选，成功获得斑马鱼myo7ab 基因敲除突变品系，这为研究该基因在内耳及视网膜发育过程中的作用奠定了基础。

关键词：斑马鱼；CRISPR/Cas9；myo7ab基因；内耳及视网膜发育中图分类号：Q78 文献标志码：A DOI：10.3969/j.issn.1007-7146.2021.03.004The Establishment of the Zebrafish myo7ab Knockout LinesXIE Binling1, 2, DENG Huiling1, 2, FU Guifang1, 2, WANG Jinfu5, XIE Dinghua4*, XIE Huaping1, 2, 3*(1. Hunan Provincial Key Laboratory of Animal Intestinal Function and Regulation, Hunan Normal University, Changsha410081, China; 2. Animal Nutrition and Human Health Laboratory, Hunan Normal University, Changsha 410081, China;3. State Key Laboratory of Developmental Biology of Freshwater Fish, Hunan Normal University, Changsha 410081, China;4. Otorhinolaryngology of Second Xiangya Hospital, Central South University, Changsha 410011, China;5. Institute of Cell and Development Biology, College of Life Sciences, Zhejiang University, Hangzhou 310058, China) Abstract:MYO7A is the causative gene of human Usher syndrome (US). Usher syndrome cases caused by MYO7A muta-tion account for 29% to 55% of Usher syndrome type 1 cases. It has been reported that MYO7A mutations can cause Usher syn-drome type 1B (USH1B), including sensorineural hearing impairment and age-dependent retinitis pigmentosa (RP), whereas the molecular mechanism is still unclear. In order to elucidate the molecular mechanism of this gene in inner ear and retina devel-opment, we used cloning free CRISPR/Cas9 gene editing technology to establish the zebraﬁsh myo7ab knockout lines. Firstly, two knockout sites of the gene were screened by bioinformatics analysis. Next, the template guide DNA of this gene were ampli-ﬁed by polymerase chain reaction (PCR). Then, the template guide DNA were transcribed into the guide RNA. Finally, the guide收稿日期：2020-12-30；修回日期：2021-03-09。

转基因系构建斑马鱼胰岛β-细胞发育模型

转基因系构建斑马鱼胰岛β-细胞发育模型夏铭;潘雪;王和生;邓敏;金怡;陈漪;李敏燕;孔德明【期刊名称】《贵阳中医学院学报》【年(卷),期】2009(031)005【摘要】目的:斑马鱼的发育周期短和胚胎透明等特点使其已经迅速成为研究脊椎动物器官发育和人类痰病的模式生物之一.为研究斑马鱼的胰岛β细胞的发育,构建了胰岛素生殖系转基因斑马鱼系.方法:构建了斑马鱼胰岛素(insulin,INS)启动子与增强型绿色荧光蛋白(eGFP)组成的表达栽体,命名为INS:eGFP.通过显微注射的方法将INS:eGFP注射到斑马鱼1-细胞期内的细胞质中,荧光筛选获得生殖系胰岛素转基因斑马鱼,并稳定表达传代.结果:建立生殖系胰岛素转基因斑马鱼,活体动态研究胰岛β细胞发育,原位杂交证实eGFP对胰岛β细胞可靠的示踪性.结论:通过胰岛素转基因斑马鱼的构建.可以直观判断胰岛的发育情况,为研究胰岛的损伤和修复提供了一个简便和直观的新型工具.【总页数】5页(P18-22)【作者】夏铭;潘雪;王和生;邓敏;金怡;陈漪;李敏燕;孔德明【作者单位】贵阳中医学院,贵州贵阳,550001;贵阳中医学院,贵州贵阳,550001;贵阳中医学院,贵州贵阳,550001;上海健康科学研究所;上海瑞金医院血液学研究所,上海,200025;上海瑞金医院血液学研究所,上海,200025;贵阳中医学院,贵州贵阳,550001;贵阳中医学院,贵州贵阳,550001【正文语种】中文【中图分类】R965.8;Q578【相关文献】1.新型的动物模型-可示踪胰岛β细胞发育的转基因斑马鱼 [J], 夏铭;潘雪;邓敏;金怡;陈漪;王和生;孔德明2.构建甲硝唑诱导转基因斑马鱼胰岛β细胞的破坏模型 [J], 孔德明;秦帅;李珊珊3.转基因斑马鱼分析胰岛β-细胞发育情况 [J], 夏铭;潘雪;李敏燕;邓敏;张勇;金怡;陈漪;王和生;孔德明4.斑马鱼胰岛α细胞细胞核特异表达mCherry转基因模型的构建 [J], 林春雨; 郏建新; 康琪; 吴志强; 李明玉5.斑马鱼胰岛α细胞细胞核特异表达mCherry转基因模型的构建 [J], 林春雨;郏建新;康琪;吴志强;李明玉因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

基因工程课程综合实验转基因斑马鱼的构建

基因工程课程综合实验转基因斑马鱼的构建基因工程是一项对生物的基因进行精确调整的技术。

通过使用基因工程技术，人们可以设计出更加优良的生命体，并为生命体的研究提供更加有力的工具。

此前，学生们在课堂上只是通过书本等介质来学习基因工程的相关知识，而课程实验则更多的停留在理论层面，无法给学生们带来更加深刻的印象。

针对以上问题，一些高校开设了基因工程课程综合实验。

通过此课程，学生们可以在实验室中亲手操作各种基因工程实验，并更好的掌握相关的基因工程实验技术。

本文以某高校为例，介绍一项基因工程课程综合实验——转基因斑马鱼的构建，并从实验的背景、实验步骤和实验意义三个方面来进行详细剖析。

一、实验背景斑马鱼是一种热带淡水鱼，其生长发育周期短，幼鱼透明，移植简便等优点使它成为了许多生物学门类研究的模型生物。

斑马鱼表层神经细胞活动强烈，非常适合用来研究感知、运动和认知的神经环路。

因此，斑马鱼成为神经科学研究、药物筛选、疾病诊断等领域的重要模型生物。

转基因斑马鱼的构建是一项基因工程研究中的重要课题。

通过向斑马鱼中植入人类基因或与斑马鱼有关的基因，可以使得斑马鱼显示出人类疾病的症状，从而更好的研究这些疾病的发生和发展机制。

例如，植入人类神经退行性疾病相关基因的斑马鱼，可以展现出某些神经退行症的症状，可以更好地研究这些疾病的病理涅槃。

二、实验步骤1、设计转基因构和转基因斑马鱼的构建需要进行基因克隆，制备转基因构建质粒。

课程设计中的实验制备的是pPtre-3xFlag-Nf1（Nf1:神经母细胞瘤），这是一种携带3xFlag标签的神经母细胞瘤基因，可用于斑马鱼的转基因实验。

2、制备大量转基因质粒使用大肠杆菌进行转基因质粒大量制备，获得足够多的质粒进行后续操作。

Ptre-3xFlag-Nf1质粒用水切割得到15Kb和6.3Kb的两个DNA段，经过凝胶电泳后得到目标DNA。

3、定量测序分析对转基因质粒进行定量测序分析，保证重要区域为正确序列。

斑马鱼的培养及TALENs技术的应用

预习实验报告：实验二斑马鱼的培养及TALENs技术的应用一．实验背景和目的基因敲除是自80年代末以来发展起来的一种新型分子生物学技术，是通过一定的途径使机体特定的基因失活或缺失的技术。

通常意义上的基因敲除主要是应用DNA同源重组原理，用设计的同源片段替代靶基因片段，从而达到基因敲除的目的。

随着基因敲除技术的发展，除了同源重组外，新的原理和技术也逐渐被应用，比较成功的有基因的插入突变和iRNA，它们同样可以达到基因敲除的目的。

在现代生物医药领域中，基因敲除技术应用越来越广泛，主要体现在以下五个方面：①．建立生物模型，在基因功能，代谢途径等研究中模型生物的建立非常重要，基因敲除技术就常常用于建立某种特定基因缺失的生物模型，从而进行相关的研究；②.疾病的分子机理研究和疾病的基因治疗，通过基因敲除技术可以确定特定基因的性质以及研究它对机体的影响，这无论是对了解疾病的根源或者是寻找基因治疗的靶目标都有重大的意义。

③.提供廉价的异种移植器官，众所周知，器官来源稀少往往是人体器官移植的一大制约因素，而大量廉价的异种生物如猪等的器官却不能用于人体，这是因为异源生物的基因会产生一些能引起人体强烈免疫排斥的异源分子，如果能将产生这些异源分子的基因敲除，那么动物的器官将能用于人体的疾病治疗，这将为患者带来具大的福音。

如：PPL Therapeutics 公司于1999 年已成功地在猪的体细胞中用基因敲除技术敲除了α－1，3GT 基因。

使每只猪都缺乏产生a１－３半乳糖基转移酶的基因的２个拷贝。

这些酶在细胞表面产生一种糖分子，人体的免疫系统可以立即辨认出这种糖分子为异源性，从而引发超急性免疫排斥反应。

在缺乏这种酶的情况下，超急性排斥反应即不会再发生[10]。

④. 免疫学中的应用，同异源器官移植相似，异源的抗体用于人体时或多或少会有一定的免疫排斥，使得人用抗体类药物的生产和应用受阻。

而如果将动物免疫分子基因敲除，换以人的相应基因，那么将产生人的抗体，从而解决人源抗体的生产问题。

转红色荧光蛋白基因斑马鱼的构建

Construction of Red Fluorescence Protein Transgenic Zebrafish JIAN Qing, BAI Jun-jie, YE Xing, XIA Shi-ling, LAO Hai-hua, LUO Jian-ren（Key Laboratory of Tropical & Subtropical Fish Breeding & Cultivation, CAFS. Pearl River Fishery Research Institute,CAFS. Guangzhou 510380,China）Abstract The cloned myosin light chain 2 promoter was modified by PCR method and was inserted into the vector(pDSRed2) to construct the red fluorescence protein expression vector. The linlinearized expression vector was delivered into one or two cells stage embryo zebrafish by micro-injection. Under fluorescence microscope, red fluorescence had been observed in muscle tissue as early as embryo blood-circling stage, and red fluorescence intends to increase with the growth of the fish. After hatching, almost all the trunk of the red fluorescence transgenic zebrafish was covered with red fluorescence. Keywords: Danio rerio, red fluorescence protein, transgenic, myosin, promoter转红色荧光蛋白基因斑马鱼的构建简清*, 白俊杰, 叶星, 夏仕玲, 劳海华, 罗建仁（中国水产科学研究院珠江水产研究所，中国水产科学研究院热带亚热带鱼类选育与养殖重点开放实验室，广东广州510380）摘要: 采用PCR方法，改造肌球蛋白轻链2启动子，使其适合定向插入红色荧光蛋白载体的多克隆位点，构建成肌肉特异性表达的红色荧光载体。

基因工程综合实验---转基因斑马鱼的构建

基因工程综合实验---转基因斑马鱼的构建一、实验目的本实验的教学目的是通过构建转基因斑马鱼的表达载体、利用显微注射法制备转基因斑马鱼及转基因个体的鉴定等实验让学生对基因工程技术所涉及的主要环节的基本原理、完整流程和基本技术进行系统地学习和掌握，熟悉转基因动物的制备过程，培养学生利用基因工程的原理和技术进行生命科学基础理论和应用研究的基本思路和实验设计能力。

二、实验原理转基因动物（transgenic animal）是指动物所有细胞基因组中整合有外源基因的一类动物，具有将外源基因遗传给子代的能力。

转基因动物技术是常规分子生物学技术的延伸和拓展，是基因工程技术的核心内容之一，它不仅为人们研究生命科学的基本问题提供了一个更有效的工具，成为探讨基因功能及其调控机理、致癌等疾病基因的作用机理与调控机制不可或缺的研究手段，转基因技术也是生物学领域最具应用价值的实用技术，已经渗透到医学、畜牧学、农业生产及工业生产等各个方面，同时人类遗传病的转基因动物模型的建立，为遗传病的基因治疗打下坚实的理论和实验基础。

转基因动物的制备涉及外源目的基因的获取、重组表达载体的构建与检测鉴定、受体系统的准备、外源目的基因导入、转基因个体的检测等方面的内容。

本次实验动物选取斑马鱼作为实验材料。

斑马鱼(Danio rerio)是属于辐鳍亚纲(Actinopterygii)鲤科(Cyprinidae) 短担尼鱼属(Danio)的一种硬骨鱼，产于印度东部、巴基斯坦、缅甸以及孟加拉国的小溪、稻田及恒河中游地区，是一种常见的热带观赏鱼，因其斑马鱼饲养所需空小、成本体侧具有像斑马一样纵向的暗蓝与银色相间的条纹而得名。

間低，且斑马鱼生活史短，2-3 个月即性成熟，生活周期容易控制，每次可产卵100-200颗，胚胎透明且大，容易操作和观察，所以用斑马鱼制备转基因动物具有明显的优势。

三、实验内容与学时分配序号实验内容与名称实验类型与性质学时分配每组人数1 转基因质粒的转化专业技术实验 3 42 转基因质粒的大量提取专业技术实验3 43 重组表达质粒的酶切检测专业技术实验 3 4专业技术应用 3 44 受体系统鱼受精卵的获得及培养专业技术应用 6 45 用显微注射法制备转基因斑马鱼6 转基因斑马鱼的表型鉴定专业技术应用 3 4四、材料、试剂与设备4.1 菌株及斑马鱼DH5α感受态细胞：由本实验室自行制备并存于-20℃。