CRISPR(Cas9) System斑马鱼基因敲除-实验流程3

1、gRNA模板扩增：（以gRNA质粒为模板，扩增片段大小为100bp多）
40ul体系，利用保真性>= Extaq的酶扩增4管；
可以通过胶回收纯化扩增模板（四管过同一个回收柱子），或通过沉淀纯化（附件1）;
沉淀回收模板前，要进行利用5ul电泳检测是否扩增出目的条带；
以上模板皆用20ul DEPC水回溶(,反复洗柱子两次)。

2、gRNA合成：
10ul
反应温度37
3、gRNA纯化
a.加入1ul DNase I，37℃处理15min；
b.加入1ul 0.5 M EDTA 8.0，65℃处理10min；
c.加入57.5ul DEPC water 和 7.5ul 3M sodium Acetate solution(pH 5.2);
d.加入等体积（即77ul）酚氯仿（1:1 mix）；12000rpm，15min；
e.吸取上部水相到新的PCR-tube，加入等体积氯仿，12000rpm，15min；
f.重复操作e；
g.收集水相到new-PCR-tube，加入2倍体积无水乙醇；-20℃沉淀至少30min；
h.12000rpm，15min，去除液体，留下白色gRNA沉淀；
i.70%乙醇洗3次（每次12000rpm，6min）；
j.去除70%，自然干燥，10-20ul DEPC water溶解；-80℃保存。

注意：以上为RNA操作，请使用灭菌未开封的tips and tubes，尽量不说话，避免RNA酶污染。

以上合成与纯化过程为KIT说明书翻译得到，如使用与本实验室不同KIT，请阅读相关说明书。

4、Cas9 template 准备（酶切4h，40ul体系）
将zf-cas9-vector 线性化，即XbaI 单酶切；酶切2 tube，2.3或2.5ug/tube；过同一个胶回收柱子；20ul DEPC water 回溶，洗涤柱子两边，-20℃保存。

5、cas9-mRNA 合成
20ul
反应温度37℃，时间4.5h。

纯化：
A．加入1ul DNase I，37℃处理15min；
B．20ul反应体系，加入30ul LiCl；
C．冰浴或-20℃沉淀至少30min；
D．4℃,12000rpm,15min;
E．100ul 70%乙醇洗2次（每次12000rpm，6min）；
F．10ul DEPC water溶解；-80℃保存。

注意：RNA样品根据每次用量的多少分装保存，避免反复冻融，降解。

一般1ul/tube保存。

6、 斑马鱼注射：
利用混合好的cas9与gRNA 样品注射（混合后终浓度分别为300ng/ul 和 20ng/ul, 如果注射效果不佳，可自行提高混合比例再次注射，最好不要超过500ng/ul 和80ng/ul ） 7、 F0注射胚胎检测
准备：50mM NaOH 、1 M Tris-HCl PH8.0；30% PAGE ；5XTBE ；10%APS ； 5X TBE
12% PAGE-gel ：（两块）
说明：其他所需溶液请自行查询《分子克隆》的配方。

8、 基因组提取及PCR
a. 8 embryos/Tube ，加入80ul 50mM NaOH ，95℃，40min ；（可取3-5tubes ）
b. 加入1/10体积 1 M Tris-HCl PH8.0；mix well ，3000rpm ，5min ；
c. 取1ul 作为template ，PCR 扩增包含靶位点的基因片段；
d. 加6xloading buffer ，run 12% PAGE-gel ；、
e. EB 染色，凝胶成像仪拍照看条带结果；
f. 如果条带与WT 存在差异，则说明敲除有效果； 9、 养鱼
将test 有效果的靶位点对应的F0代斑马鱼饲养起来； 10、筛鱼
a.将成熟的F0代斑马鱼与WT mate ，取其发育24h 的胚胎test ，方法同8；
b.将test 有效果的靶位点对应的F1代斑马鱼饲养起来； c ．1个月大的幼鱼，剪尾鳍提基因组逐条test ；（如图）
11、测序
PCR 产物(胶块)直接测序；T-clone 直接菌液测序；前者读峰图获得结果后者与标准序列blast 获得；具体如下例：（在标准序列上找到套峰之前的序列，读出套峰处的碱基，重叠套峰上下写，最后将套峰处标准序列（序列1）找到，其他碱基组合即为序列2；比较后得出碱基缺失情况。

）T-clone sequence 获得单一序列（有野生型sequence 及mutant sequence ，与网上序列blast 后，有碱基缺失的即为突变情况）
12、后续筛鱼及传代（标准程序）
A:F0 X WT F1 B: F1 X WT F2
C:F2 X WT F3 D:F3 X F3 观察表型
注：step 12的传代都是要通过剪尾鳍test传代的。