CRISPR(Cas9) System斑马鱼基因敲除-实验流程3

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1、gRNA模板扩增:(以gRNA质粒为模板,扩增片段大小为100bp多)

40ul体系,利用保真性>= Extaq的酶扩增4管;

可以通过胶回收纯化扩增模板(四管过同一个回收柱子),或通过沉淀纯化(附件1);

沉淀回收模板前,要进行利用5ul电泳检测是否扩增出目的条带;

以上模板皆用20ul DEPC水回溶(,反复洗柱子两次)。

2、gRNA合成:

10ul

反应温度37

3、gRNA纯化

a.加入1ul DNase I,37℃处理15min;

b.加入1ul 0.5 M EDTA 8.0,65℃处理10min;

c.加入57.5ul DEPC water 和 7.5ul 3M sodium Acetate solution(pH 5.2);

d.加入等体积(即77ul)酚氯仿(1:1 mix);12000rpm,15min;

e.吸取上部水相到新的PCR-tube,加入等体积氯仿,12000rpm,15min;

f.重复操作e;

g.收集水相到new-PCR-tube,加入2倍体积无水乙醇;-20℃沉淀至少30min;

h.12000rpm,15min,去除液体,留下白色gRNA沉淀;

i.70%乙醇洗3次(每次12000rpm,6min);

j.去除70%,自然干燥,10-20ul DEPC water溶解;-80℃保存。

注意:以上为RNA操作,请使用灭菌未开封的tips and tubes,尽量不说话,避免RNA酶污染。以上合成与纯化过程为KIT说明书翻译得到,如使用与本实验室不同KIT,请阅读相关说明书。

4、Cas9 template 准备(酶切4h,40ul体系)

将zf-cas9-vector 线性化,即XbaI 单酶切;酶切2 tube,2.3或2.5ug/tube;过同一个胶回收柱子;20ul DEPC water 回溶,洗涤柱子两边,-20℃保存。

5、cas9-mRNA 合成

20ul

反应温度37℃,时间4.5h。

纯化:

A.加入1ul DNase I,37℃处理15min;

B.20ul反应体系,加入30ul LiCl;

C.冰浴或-20℃沉淀至少30min;

D.4℃,12000rpm,15min;

E.100ul 70%乙醇洗2次(每次12000rpm,6min);

F.10ul DEPC water溶解;-80℃保存。

注意:RNA样品根据每次用量的多少分装保存,避免反复冻融,降解。一般1ul/tube保存。

6、 斑马鱼注射:

利用混合好的cas9与gRNA 样品注射(混合后终浓度分别为300ng/ul 和 20ng/ul, 如果注射效果不佳,可自行提高混合比例再次注射,最好不要超过500ng/ul 和80ng/ul ) 7、 F0注射胚胎检测

准备:50mM NaOH 、1 M Tris-HCl PH8.0;30% PAGE ;5XTBE ;10%APS ; 5X TBE

12% PAGE-gel :(两块)

说明:其他所需溶液请自行查询《分子克隆》的配方。 8、 基因组提取及PCR

a. 8 embryos/Tube ,加入80ul 50mM NaOH ,95℃,40min ;(可取3-5tubes )

b. 加入1/10体积 1 M Tris-HCl PH8.0;mix well ,3000rpm ,5min ;

c. 取1ul 作为template ,PCR 扩增包含靶位点的基因片段;

d. 加6xloading buffer ,run 12% PAGE-gel ;、

e. EB 染色,凝胶成像仪拍照看条带结果;

f. 如果条带与WT 存在差异,则说明敲除有效果; 9、 养鱼

将test 有效果的靶位点对应的F0代斑马鱼饲养起来; 10、筛鱼

a.将成熟的F0代斑马鱼与WT mate ,取其发育24h 的胚胎test ,方法同8;

b.将test 有效果的靶位点对应的F1代斑马鱼饲养起来; c .1个月大的幼鱼,剪尾鳍提基因组逐条test ;(如图)

11、测序

PCR 产物(胶块)直接测序;T-clone 直接菌液测序;前者读峰图获得结果后者与标准序列blast 获得;具体如下例:(在标准序列上找到套峰之前的序列,读出套峰处的碱基,重叠套峰上下写,最后将套峰处标准序列(序列1)找到,其他碱基组合即为序列2;比较后得出碱基缺失情况。)T-clone sequence 获得单一序列(有野生型sequence 及mutant sequence ,与网上序列blast 后,有碱基缺失的即为突变情况)

12、后续筛鱼及传代(标准程序)

A:F0 X WT F1 B: F1 X WT F2

C:F2 X WT F3 D:F3 X F3 观察表型

注:step 12的传代都是要通过剪尾鳍test传代的。

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