CRISPR(Cas9) System斑马鱼基因敲除-实验流程3
基因敲除斑马鱼构建方法!
基因敲除斑马鱼构建方法!一、基因敲除的设计方案1.1 基因的基本信息确认斑马鱼基因的基本信息，包括名称ID号等，一般会在NCBI 等查询。
1.2 分析基因结构、氨基酸序列等做生物学信息的分析1.3分析蛋白质的保守结构功能域通过综合考虑，设计最佳的KO靶点。
1.4 分析并设计CRISPR，分析其效率及脱靶的情况一般使用CCTOP，少数物种如没有可找其它专业网站。
二、CRISPR活性验证2.1 分析并确认基因组序列设计Genotyping引物，确认实际基因组序列与理论匹配情况，如CRISPR靶点验证与理论序列存在出入，需回到1.4重做。
该步骤还需要确认引物扩增条件，以备后用，如不能正常扩增需要重新设计，并且不能进行下一步操作。
2.2 合成sgRNA使用Thermo转录试剂盒转录，完成后需测定浓度（不得低于400 ng/μl）和OD值（260/280需在1.8~2.2）。
2.3 显微注射将上述合成好的sgRNA按照一定的比例与Cas9蛋白预混，使用显微注射技术将其注入斑马鱼早起胚胎中。
2.4 活性验证随机选取8~24 hpf的8枚注射后的胚胎通过PCR后将其产物送商业公司sanger测序，需要看到至少有一组在靶向位置存在Indel突变。
•如有，挑取存在Indel突变的亚克隆确认；•如没有，回到2.3或2.2或1.4（具体回到哪一步需要根据实际情况决定）三、突变体制备及确认3.1 F0饲养如2.4验证有活性，一般需要显微注射400~500枚胚胎作为F0（一般由胚胎发育至成体有10~20%），至少需要40尾以上的F0。
3.2 F0可遗传突变的确认将上述F0亲本与野生型杂交（或者自交），将所产胚胎随机选取8枚经测序确认，如存在Indel突变，则该F0亲本即为可遗传突变体。
以此方法至少鉴定出3尾可遗传的F0。
3.3 F1饲养将3.2至少3尾亲本经交配，每组一般15~25尾，一般总量需到达40~50尾。
3.4 F1确认将3.3的F1饲养至2~2.5月龄,获得其尾鳍基因组，通过PCR后测序确认其具体基因型（要求必须是移码突变或出现提前终止密码子的突变）。
CRISPR-Cas9细胞-动物KOKI实验基本流程-2
一、CRISPR-Cas9 细胞基因敲除敲入实验基本操作流程1)设计sgRNA ：1.1、确定待敲除基因的靶位点根据提供的物种、基因名称或者基因ID在NCBI或ENSEMBLE中进行查找。
找到该基因CDS 区，分析相应的基因组结构，明确CDS的外显子部分。
按照基因本身的性质，选择候选的待敲除位点，确定待敲除位点。
对于蛋白编码基因，如果该蛋白具重要结构功能域，可考虑将基因敲除位点设计在编码该结构域的外显子；如果不能确定基因产物性质，可选择将待敲除位点放在起始密码子A TG后的外显子上。
如果是microRNA，可以将待敲除位点设计在编码成熟microRNA的外显子或在编码成熟microRNA的外显子的5’和3’侧翼序列。
1.2、设计识别靶位点的一对DNA Oligos确定待敲除位点后，选择23-至250bp的外显子序列输入到在线免费设计sgRNA的软件Input 框中（/），然后进行设计运算，软件会自动输出sgRNA序列（网站设计一般很慢或数据输出不完整，可使用我的内部软件，2天内输出全部结果，无物种限制）。
一般地，基因特异的sgRNA模板序列为位于PAM序列（Protospacer AdjacentMotif）前间区序列邻近基序，这是一种见于crRNA分子的短核苷酸基序，可以被Cas9蛋白特异性识别并切割）的20个nt。
而PAM序列的特征为NGG（其中N为任意核苷酸）。
因此，sgRNA模板序列选择非常方便，即使没有软件，研究者也可手工进行选择。
不过，在线软件可以给出该序列在基因组中存在相似序列的情况，即可能的脱靶位点。
因此，利用在线软件可以选择脱靶机会小的序列作为sgRNA模板序列。
根据选择的sgRNA模板序列，合成一对序列互补的DNA Oligos （同时设计检测目的基因的引物一起合成）。
1、/2、/mpg/crispr_design/3、/~slin/cas9.html4、/E-CRISP/5、/6、/crispr/,Drosophila7、/index.jsp8、/casot/index.php9、/ZiFiT/ChoiceMenu.aspx10、/根据酶切方式，选择合适接头，例如，PX458等质粒sgRNA靶点oligo如下（Bbs1酶切）5‘-CACCGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-3’3‘- CNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-CAAA-5‘（1）对于sgRNA的长度，一般应为20 nt左右；（2）对于sgRNA序列的碱基组成，可选3'末端含GG的sgRNA，同时sgRNA种子序列尽量避免以4个以上的T结尾，GC%含量最佳为40%~60%；（3）sgRNA的种子序列与脱靶位点的匹配数尽可能低（4）如果构建U6或T7启动子驱动sgRNA的表达载体，需考虑sgRNA的5' 碱基为G或GG，以提高其转录效率；（5）对于sgRNA靶向基因的结合位置，如需造成基因移码突变，需尽量靠近基因编码区的A TG下游，最好位于第一或第二外显子；（6）检查sgRNA靶向结合位点基因组序列是否存在SNPs；（7）如采用Cas9单切口酶，设计paired-gRNA需考虑成对sgRNA的间距；（8）全基因脱靶效应分析，需考虑脱靶位点最大允许几个错配碱基数，建议最少5个碱基。
CRISPRCas9基因编辑操作步骤及详细说明
CRISPRCas9基因编辑操作步骤及详细说明实验材料与方法一、细胞培养人宫颈癌细胞 HeLa，常规培养使用含 10% FBS 的 DMEM 培养基 ( 含 1.5 mg/L-Glutamine,100 U/mL Penicillin,100 μg/mL Streptomycin) 中，37ºC 5% CO2 饱和湿度培养箱中培养。
二、基因信息及双 gRNA 设计基因信息及分析1.hsa-mir-152 基因信息：pubmed2.hsa-mir-152 基因位于蛋白编码基因 COPZ2 内含子内，敲除hsa-mir-152 基因不会影响该蛋白编码3.hsa-mir-152 precursor 序列（87 bp）：TGTCCCCCCCGGCCCAGGTTCTGTGATACACTCCGACTCGGGCTCTGGAGCAGTCAGTGCATGACAGAACTTGGGCCCGGAAGGACC双 gRNA 设计使用在线 gRNA 设计软件在 hsa-mir-152 precursor 基因组序列两侧设计双 gRNA注：dgRNA 即为双 gRNA.三、慢病毒侵染实验材料及试剂DMEM 培养基 + 10% FBSD-Hank’s SolutionTrypsin-EDTA Solution96 孔板24 孔板Lentivirus- 病毒液（GenePharma）步骤靶细胞侵染实验1.靶细胞铺板：24-well，加入2.5×105 cells/well（根据细胞种类调整），0.5 mL 完全培养基，37℃，5% CO2 过夜；2.稀释病毒：稀释液（靶细胞维持液培养基）400 μL + 终浓度 5 μg/mL Polybrene，将慢病毒原液按 1:9 加入到稀释液中；3.移去 Step1 中细胞培养液，加入 Step2 稀释后的病毒液，同时建立对照（blank、negative），37℃，5% CO2 过夜；4.12~24 小时移去细胞侵染后的病毒液，加入 0.5 mL 完全培养基，37℃，5% CO2 过夜；5.根据细胞状态和类型，如果必要分出 1/3~1/5，加入0.5 mL 完全培养基，继续培养 24~48 小时，荧光倒置显微镜下观察结果。
cas9 构建基因敲除细胞系 步骤
cas9 构建基因敲除细胞系步骤1. 设计gRNA序列需要设计合适的gRNA（guide RNA）序列。
gRNA是一种由RNA和DNA组成的分子，在CRISPR-Cas9系统中起到引导Cas9蛋白识别和切割目标DNA的作用。
gRNA序列应当与目标基因的特定区域互补，并且要避免与其他基因的序列相互匹配。
2. 合成gRNA和Cas9蛋白合成设计好的gRNA序列，并将其与Cas9蛋白结合。
Cas9蛋白是CRISPR-Cas9系统中的核酸酶，能够与gRNA一起识别目标DNA 序列，并在其靶向区域引发双链断裂。
3. 转染细胞将gRNA和Cas9蛋白复合物转染到目标细胞中。
转染可以使用多种方法，如化学法、电穿孔法或病毒载体介导的转染等。
转染后，gRNA和Cas9蛋白会进入细胞质，并寻找目标基因。
4. 筛选敲除细胞系根据需要敲除的基因，选择适当的筛选方法来鉴定敲除细胞系。
常用的筛选方法包括PCR、Western blot和细胞克隆等。
通过这些方法，可以检测到目标基因的敲除情况。
5. 确认敲除细胞系对筛选出的细胞系进行进一步的确认。
可以使用DNA测序技术对目标基因的敲除位点进行测序验证。
此外，还可以通过功能实验来验证目标基因的敲除效果。
6. 存储和维护敲除细胞系成功敲除目标基因后，需要对敲除细胞系进行存储和维护。
细胞系应当保存在液氮中，以确保其长期保存和使用的稳定性。
同时，细胞系也需要定期培养和检测，以确保其生长状态和敲除效果。
以cas9构建基因敲除细胞系的步骤包括设计gRNA序列、合成gRNA和Cas9蛋白、转染细胞、筛选敲除细胞系、确认敲除细胞系以及存储和维护敲除细胞系。
这些步骤需要在实验室中进行，确保操作的准确性和稳定性。
基因敲除细胞系的建立为研究基因功能和疾病机制提供了有力的工具，对于深入理解生命活动和疾病发生发展具有重要意义。
cas9基因敲除实验步骤英语
cas9基因敲除实验步骤英语CRISPR-Cas9 Gene Knockout Protocol.Materials:CRISPR-Cas9 plasmid containing sgRNA targeting the gene of interest.Cell line or organism to be edited.Transfection reagent.Selection antibiotic (if applicable)。
Genomic DNA extraction kit.PCR primers flanking the target site.Restriction enzymes.Agarose gel electrophoresis equipment.Gel extraction kit.Procedure:1. Plasmid Transfection.Transfect the CRISPR-Cas9 plasmid into the targetcells or organism using an appropriate transfection method.Incubate according to the manufacturer's instructionsto allow for gene editing to occur.2. Selection of Edited Cells.If the CRISPR-Cas9 plasmid contains a selection marker, apply the appropriate antibiotic to select for cells that have successfully integrated the plasmid.Incubate for a sufficient time to eliminate non-transfected cells.3. Genomic DNA Extraction.Extract genomic DNA from the treated cells or organism using a standard DNA extraction method.4. PCR Amplification of Target Region.Design PCR primers that flank the target site and amplify it in the extracted genomic DNA.Perform PCR under appropriate conditions.5. Restriction Enzyme Digestion.Digest the PCR products with restriction enzymes that recognize specific sequences within or near the target site.This step is optional but can enhance the detection of mutations.6. Agarose Gel Electrophoresis.Analyze the restriction enzyme digestion products on an agarose gel to visualize the presence of mutations.Successful gene knockout should result in the loss of the wild-type allele or the appearance of a smaller or larger fragment due to insertions or deletions.7. Gel Extraction and Sequencing.Extract the DNA fragment(s) of interest from the gel using a gel extraction kit.Sequence the extracted DNA to confirm the presence and nature of the mutations introduced by CRISPR-Cas9.8. Analysis of Mutation and Phenotype.Analyze the sequencing results to determine the type of mutation (e.g., deletion, insertion, point mutation).Assess the phenotypic effects of the gene knockout inthe edited cells or organism.Additional Considerations:Optimize the transfection efficiency and CRISPR-Cas9 plasmid design for your specific experimental conditions.Use control cells or organisms to account for any non-specific effects or off-target editing.Validate the gene knockout by using multiple independent sgRNAs or by targeting multiple regions within the gene.Thoroughly characterize the phenotypic consequences of the gene knockout to ensure its specificity and avoidance of compensatory mechanisms.。
CRISPRCas9基因敲除细胞株详细构建流程
CRISPRCas9基因敲除细胞株详细构建流程Puro 抗性浓度摸索实验将细胞如下图1稀释。
给药7天后，弃培养液，用台盼蓝染色2 min，显微镜下观察细胞存活情况。
确定细胞多克隆细胞筛选和单克隆细胞筛选浓度。
图1 抗性浓度摸索单克隆形成验证实验细胞计数，将细胞悬液稀释混匀后加入96孔板，用封口胶将孔板封好，放于培养箱中培养。
静置培养48 h后每日观察并记录单克隆形成情况。
sgRNA 靶标设计根据基因序列信息，设计 sgRNA。
靶标位点序列信息确认PCR扩增（图2），测序验证基因序列，以确定sgRNA区域有无SNP。
图2 靶标序列扩增sgRNA克隆引物合成根据sgRNA设计sgRNA克隆引物。
lentiCRISPRv2-sgRNA载体构建退火，连接，转化，涂板（LB/Amp）培养。
lentiCRISPRv2-sgRNA载体验证每个实验组各挑取6个单克隆菌落，于LB/ Amp培养基中扩增，提取质粒，琼脂糖凝胶电泳检测质粒抽提效果（图3）。
图3 质粒抽提酶切验证：取3个单克隆进行酶切，琼脂糖凝胶电泳检测酶切效果（图4）。
选择2个样品送样测序。
图4 单克隆酶切验证病毒包装lentiCRISPRv2-sgRNA无内毒素质粒提取，病毒包装。
细胞转染配制梯度病毒稀释液，细胞于培养箱中静置培养48h。
阳性单克隆细胞株筛选细胞转染48h后，更换完全培养基，筛选至对照组大部分细胞死亡，实验组细胞扩大培养，进行单克隆筛选。
几天后挑选阳性单克隆进行扩增，并取样验证。
阳性单克隆细胞株验证测序验证阳性单克隆细胞株的基因序列，以确定是否敲除成功。
实验结果示例：该基因有两个单克隆细胞株，A1和A2。
单克隆细胞A1的目的基因在sgRNA2位置出现两种突变形式，分别缺失1个和19个碱基，在新序列的第337位和第355位碱基提前出现终止密码子。
单克隆细胞A2的目的基因在sgRNA2位置发生突变，插入1个碱基，在新序列的第340位碱基提前出现终止密码子。
cas9 敲除 流程
cas9 敲除流程下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。
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动物建模--定向删除外显子---CRISPR-Cas9技术流程.pdf
动物建模—定向删除外显子CRISPR/Cas9技术基本流程基因组编辑（Genome Editing）步入Cas9的时代专业的CRISPR/Cas9介导的knock-out和knock-in就在南京尧顺禹！南京尧顺禹—CRISPR/Cas9技术专业服务公司一、CRISPR/Cas9技术介导的基因敲除和敲入1、基本原理CRISPR/Cas9靶向基因改造（敲除、敲入）技术是最新发展起来的一种强有力的用于基因组编辑（genome editing）的分子生物学工具，现已广泛应用于人、短尾猴、大鼠、小鼠、斑马鱼、果蝇、家蚕、线虫、酵母、拟南芥、烟草、高粱、水稻和小麦等各类动植物个体或细胞基因组的遗传学改造。
相较于TALEN（Transcription Activator-Like Effector Nuclease）技术，CRISPR技术的效率要高得多，而且采用CRISPR技术可以一次性的对多个基因同时进行基因敲除和/或敲入（Science, 2013, 15 February, p. 823）。
而先前担心CRISPR/Cas9技术的脱靶问题，最近已有美国马萨诸塞州坎布里奇博大研究所（Broad Institute in Cambridge, Massachusetts）的合成生物学家张丰（Feng Zhang）通过使用带有点突变的Cas9完全解决（Cell. 2013 Sep 12;154(6):1380-9）。
美国哈佛大学的George Church认为，CRISPR/Cas9技术的高效率和易用性将是其它已有基因组改造技术包括TALEN等所无法匹敌的（Science. 2013 Aug 23;341(6148):833-6）。
CRISPR（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats），即成簇规律间隔的短回文重复序列。
Cas9蛋白是一种能够降解DNA分子的核酸酶（nuclease），其中含有两个酶切活性位点，每一个位点负责切割DNA 双螺旋中的一条链。
基因敲除细胞系构建流程
基因敲除细胞系构建流程
基因敲除细胞系构建流程通常包括以下步骤：
1. 确定目标基因：选择需要敲除的目标基因。
2. 基因敲除设计：设计合适的靶向序列，该序列将在基因敲除过程中与目标基因发生特异性的DNA双链断裂。
3. CRISPR-Cas9系统构建：构建CRISPR-Cas9系统，其中包
括Cas9核酸酶和相应的靶向RNA（sgRNA）。
4. 细胞系培养：培养适合的细胞系，如细胞株或原代细胞。
5. 转染：将CRISPR-Cas9系统转染到细胞中，可以使用化学
转染、电转染或病毒载体转染等方法。
6. 筛选敲除细胞：在转染后的细胞中，通过添加选择性抗生素或使用基因标记物等方法，筛选出含有目标基因敲除的细胞。
7. 制备克隆：将筛选出的细胞进行单细胞克隆，并培养扩增。
8. 确定敲除效果：通过PCR、Western blot、流式细胞术或其
他适合的实验方法检测敲除细胞的基因表达水平和蛋白质表达。
9. 验证敲除细胞的功能：通过细胞功能实验，如细胞增殖、凋亡、迁移等实验，验证目标基因敲除对细胞功能的影响。
注意：以上流程是一般化的基因敲除细胞系构建流程，具体步
骤和条件可能因实验目的、细胞类型、基因敲除方法等而有所不同。
CRISPR Cas9敲除细胞系构建步骤及方法
CRISPR/Cas9敲除细胞系构建步骤及方法一、技术简介CRISPR/Cas9是最新出现的一种由RNA指导的Cas9核酸酶对靶向基因进行编辑的技术，也是目前研究最热的基因编辑技术。
由于其具有构建方法简单快捷、基因修饰效率高、成本低廉、实验周期短、适用范围广等诸多优点，目前已成功应用于人类细胞、斑马鱼、大/小鼠等多种动植物的基因组精确修饰。
二、实验流程1. 预实验1.1 Cas9导入细胞方法：尝试各种方法，如脂质体类转染、电转、慢病毒感染、腺病毒感染等，确定高效导入Cas9方法。
1.2 药物浓度预实验：降低后续阳性克隆筛选和检测工作难度。
1.3 单克隆培养情况：确认细胞是否可以单克隆培养。
2. 基因敲除（敲入）2.1 靶点设计：一般在不同转录产物的共同外显子上设计3个靶点，靶点位置尽量在基因CDS的前1/3，ATG之后，最好能破坏重要的domain和所有的转录产物isoform。
第一批合成构建3个，效果不佳或时间紧张的可一次构建6个。
2.2 载体构建和病毒包装：根据预实验结果，选择合适的普通载体或病毒载体（普通Cas9载体、慢病毒Cas9载体和腺病毒Cas9载体）。
2.3 内源活性筛选：转染细胞或感染细胞48h后，使用Puro或Blasticidin筛选48h，提取基因组DNA。
使用T7E1酶验证打靶载体的活性，将有效的突变型PCR产物测序验证。
2.4 Donor载体（基因敲入）：根据筛选的gRNA靶点位置，构建Donor普通载体或腺病毒载体，共转染/感染Cas9-gRNA和Donor。
2.5 单克隆筛选：无限稀释到每孔1个细胞的数量，每株细胞铺至少2个96孔板。
细胞数量足够后，验证内源活性并送测。
2.6 获得突变型：如需纯合子，则可能需要重复步骤3-5。
手把手教你学会CRISPRCas9基因敲除技术（需要挑选成对的靶点一般在正义链和反义链上分。。。
⼿把⼿教你学会CRISPRCas9基因敲除技术（需要挑选成对的靶点⼀般在正义链和反义链上分。
h ttp:///a/214091994_177233(需要挑选成对的靶点⼀般在正义链和反义链上分别挑选靶点配对)C RISPR/Cas 是进⾏基因编辑的强⼤⼯具，可以对基因进⾏定点的精确编辑。
在向导 RNA（guide RNA， gRNA）和 Cas9 蛋⽩的参与下，待编辑的细胞基因组 DNA 将被看作病毒或外源 DNA，被精确剪切。
⼀、寻找⽬的基因的靶标使⽤在线设计⽹站 CRISPR direct，如需直接复制⽹址，可在⽣物学霸后台对话框回复 direct即可。
靶点挑选要点：1. 基因敲除靶点应设计在起始密码⼦附近（包括起始密码⼦）或者起始密码⼦下游的外显⼦范围内。
2. 不同Cas9/gRNA 靶点在基因敲除效率上有较⼤差异，因此同时设计构建2～3 个靶点的基因敲除载体再从中选出敲减效果较佳的靶点。
3. N1-N20NGG 靠近 PAM 的碱基对靶点的特异性很重要，前 7～12 个碱基的错配对 Cas9 切割效率影响较⼩。
设计好的靶点序列应在基因库中进⾏ BLAST 检测。
4. Cas9Nicknase 需要挑选成对的靶点。
⼀般在正义链和反义链上分别挑选相距 20～30bp 的靶点配对。
多对靶点的敲除效率常有较⼤差异。
由于基因敲除实验时间长，在正式对⽬的细胞进⾏敲除前对靶点进⾏验证和挑选⾮常必要。
⼆、插⼊⽚段设计插⼊寡核苷酸序列设计（必须 PAGE 纯化寡核苷酸）：正向序列5’ACACCGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTT3’反向序列3’TGTGGCNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCAAAATCTCGATCTTTATCGTTCAATTTTATTCCGATCAGGCAA5’插⼊⽚段的合成1. ⽤⽔将寡核苷酸稀释为 100 µM。
CRISPRCas9基因敲除原理及实验建议
CRISPRCas9基因敲除原理及实验建议
CRISPR/Cas9基因敲除原理及实验建议
CRISPR Cas9已经成为了最受欢迎的基因编辑技术之⼀，在2016年的国⾃然基⾦中也有很多项⽬是关于 CRISPR Cas9的。
⽬前在市场上已经有很多Cas9的基因敲除试剂盒，这些试剂盒的操作流程较为简单，客户可让公司直接帮忙设计gRNA，乃⾄最后的载体验证全包。
公司会根据您的要求收取不同的费⽤，如果只是合成载体，不验证，那么会便宜些。
如果要合成载体同时⼜验证，那么价格⼜会贵⼀些。
下⾯是对Cas9基因敲除试剂盒的⼀个详细说明，我们可以从中了解Cas9基因敲除所需要的敲除原理，基本试剂，基本步骤和研究⽅法，希望对⼤家可以有帮助。
建议⼤家直接依靠公司来进⾏设计，因为⾃⼰做的话前期的摸索过程可能会长⼀些。
⽬前有在线的软件来设计gRNA，如张锋实验室推出的gRNA设计软件等，后⾯就是分⼦克隆⽅⾯的实验。
从实验条件和时间成本考虑，对于⼤部分的临床医⽣⽽⾔，选择试剂盒要⽐选择⾃⼰做载体进⾏验证要好得多。
CRISPR Cas 细胞 动物KOKI实验基本流程
一、CRISPR-Cas9 细胞基因敲除敲入实验基本操作流程1)设计sgRNA ：1.1、确定待敲除基因的靶位点根据提供的物种、基因名称或者基因ID在NCBI或ENSEMBLE中进行查找。
找到该基因CDS 区，分析相应的基因组结构，明确CDS的外显子部分。
按照基因本身的性质，选择候选的待敲除位点，确定待敲除位点。
对于蛋白编码基因，如果该蛋白具重要结构功能域，可考虑将基因敲除位点设计在编码该结构域的外显子；如果不能确定基因产物性质，可选择将待敲除位点放在起始密码子A TG后的外显子上。
如果是microRNA，可以将待敲除位点设计在编码成熟microRNA的外显子或在编码成熟microRNA的外显子的5’和3’侧翼序列。
1.2、设计识别靶位点的一对DNA Oligos确定待敲除位点后，选择23-至250bp的外显子序列输入到在线免费设计sgRNA的软件Input 框中（/），然后进行设计运算，软件会自动输出sgRNA序列（网站设计一般很慢或数据输出不完整，可使用我的内部软件，2天内输出全部结果，无物种限制）。
一般地，基因特异的sgRNA模板序列为位于PAM序列（Protospacer AdjacentMotif）前间区序列邻近基序，这是一种见于crRNA分子的短核苷酸基序，可以被Cas9蛋白特异性识别并切割）的20个nt。
而PAM序列的特征为NGG（其中N为任意核苷酸）。
因此，sgRNA模板序列选择非常方便，即使没有软件，研究者也可手工进行选择。
不过，在线软件可以给出该序列在基因组中存在相似序列的情况，即可能的脱靶位点。
因此，利用在线软件可以选择脱靶机会小的序列作为sgRNA模板序列。
根据选择的sgRNA模板序列，合成一对序列互补的DNA Oligos （同时设计检测目的基因的引物一起合成）。
1、/2、/mpg/crispr_design/3、/~slin/cas9.html4、/E-CRISP/5、/6、/crispr/,Drosophila7、/index.jsp8、/casot/index.php9、/ZiFiT/ChoiceMenu.aspx10、/根据酶切方式，选择合适接头，例如，PX458等质粒sgRNA靶点oligo如下（Bbs1酶切）5‘-CACCGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-3’3‘- CNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-CAAA-5‘（1）对于sgRNA的长度，一般应为20 nt左右；（2）对于sgRNA序列的碱基组成，可选3'末端含GG的sgRNA，同时sgRNA种子序列尽量避免以4个以上的T结尾，GC%含量最佳为40%~60%；（3）sgRNA的种子序列与脱靶位点的匹配数尽可能低（4）如果构建U6或T7启动子驱动sgRNA的表达载体，需考虑sgRNA的5' 碱基为G或GG，以提高其转录效率；（5）对于sgRNA靶向基因的结合位置，如需造成基因移码突变，需尽量靠近基因编码区的A TG下游，最好位于第一或第二外显子；（6）检查sgRNA靶向结合位点基因组序列是否存在SNPs；（7）如采用Cas9单切口酶，设计paired-gRNA需考虑成对sgRNA的间距；（8）全基因脱靶效应分析，需考虑脱靶位点最大允许几个错配碱基数，建议最少5个碱基。
利用CRISPRCas9技术建立斑马鱼Asb11基因敲除品系
利用ＣＲＩＳＰＲ/Ｃａｓ９技术建立斑马鱼Ａｓｂ１１基因敲除品系尹丽阳ꎬ罗世锋ꎬ陈㊀宇ꎬ漆轲婧ꎬ彭㊀云ꎬ万永奇ꎬ吴秀山ꎬ李永青∗(湖南师范大学省部共建淡水鱼类发育生物学国家重点实验室ꎬ教育部重点实验室ꎬ生命科学学院心脏发育研究中心ꎬ湖南长沙４１００８１)摘㊀要:Ａｓｂ１１基因被报道与斑马鱼Ｎｏｔｃｈ信号的激活有关ꎬ本研究室过去的研究显示该基因在心肌和骨骼肌中特异性表达ꎮ因此推测Ａｓｂ１１基因可能是心脏发育相关候选基因ꎮ为了阐明Ａｓｂ１１基因在斑马鱼心脏发育过程中的作用ꎬ本文利用ＣＲＩＳＰＲ/Ｃａｓ９打靶技术构建敲除Ａｓｂ１１基因的斑马鱼品系ꎮ首先在线分析筛选出Ａｓｂ１１基因最适合的打靶位点ꎬ然后ＰＣＲ扩增出Ａｓｂ１１基因ｇＲＮＡ的双链ｃＤＮＡꎬ再将Ａｓｂ１１基因的ｇＲＮＡ和Ｈｃａｓ９的ｍＲＮＡ共同注射到斑马鱼胚胎Ⅰ细胞期胚胎中ꎮ进行打靶的有效性检测ꎬ发现Ａｓｂ１１基因的一号外显子出现了碱基的缺失ꎬ表明ＣＲＩＳＰＲ/Ｃａｓ９系统对Ａｓｂ１１基因的敲除是有效的ꎮ对其Ｆ０代㊁Ｆ１代㊁Ｆ２代进行筛选ꎬ成功获得了Ａｓｂ１１基因敲除的斑马鱼品系ꎬ为探究Ａｓｂ１１在心脏发育中的作用奠定了基础ꎮ关键词:斑马鱼ꎻＡｓｂ１１基因ꎻＣＲＩＳＰＲ/Ｃａｓ９中图分类号:Ｑ７８文献标志码:ＡＤＯＩ:１０.３９６９/ｊ.ｉｓｓｎ.１００７￣７１４６.２０１８.０３.０１０ＥｓｔａｂｌｉｓｈｉｎｇｔｈｅＡｓｂ１１ＫｎｏｃｋｏｕｔＬｉｎｅｓｏｆＺｅｂｒａｆｉｓｈｗｉｔｈＣＲＩＳＰＲ/Ｃａｓ９ＴａｒｇｅｔｉｎｇＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙＹＩＮＬｉｙａｎｇꎬＬＵＯＳｈｉｆｅｎｇꎬＣＨＥＮＹｕꎬＱＩＫｅｊｉｎｇꎬＰＥＮＧＹｕｎꎬＷＡＮＹｏｎｇｑｉꎬＷＵＸｉｕｓｈａｎꎬＬＩＹｏｎｇｑｉｎｇ∗(ＳｔａｔｅＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌＢｉｏｌｏｇｙｏｆＦｒｅｓｈｗａｔｅｒＦｉｓｈꎬＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＭｉｎｉｓｔｒｙｏｆＥｄｕｃａｔｉｏｎꎬＣｅｎｔｅｒｏｆＨｅａｒｔＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔꎬＨｕｎａｎＮｏｒｍａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬＣｈａｎｇｓｈａ４１００８１ꎬＨｕｎａｎꎬＣｈｉｎａ)Ａｂｓｔｒａｃｔ:Ａｓｂ１１ｇｅｎｅｗａｓｒｅｐｏｒｔｅｄｔｈａｔｉｔｗａｓａｓｓｏｃｉａｔｅｄｗｉｔｈａｃｔｉｖａｔｉｏｎｏｆＮｏｔｃｈｓｉｇｎａｌｉｎｇｐａｔｈｗａｙ.Ｔｈｅｐｒｅｖｉｏｕｓｒｅ￣ｓｕｌｔｓｉｎｏｕｒｌａｂｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｅｄｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙｉｎｃａｒｄｉａｃｍｕｓｃｌｅａｎｄｓｋｅｌｅｔａｌｍｕｓｃｌｅ.Ｔｈｅｒｅｆｏｒｅꎬｉｔｗａｓｈｙ￣ｐｏｔｈｅｓｉｚｅｄｔｈａｔＡｓｂ１１ｇｅｎｅｍｉｇｈｔｂｅａｃａｎｄｉｄａｔｅｇｅｎｅｒｅｌａｔｅｄｔｏｈｅａｒｔｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ.ＩｎｔｈｉｓｓｔｕｄｙꎬＣＲＩＳＰＲ/Ｃａｓ９ｔａｒｇｅ￣ｔｉｎｇｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙｗａｓｅｍｐｌｏｙｅｄｔｏｋｎｏｃｋｏｕｔｚｅｂｒａｆｉｓｈＡｓｂ１１ｇｅｎｅ.ＦｉｒｓｔｌｙꎬｔｈｅｍｏｓｔｓｕｉｔａｂｌｅｔａｒｇｅｔｓｉｔｅｓｉｎＡｓｂ１１ｇｅｎｅｗｅｒｅｓｃｒｅｅｎｅｄｏｕｔｏｎｗｅｂｓｉｔｅｓ.Ｓｅｃｏｎｄｌｙꎬｄｏｕｂｌｅ￣ｓｔｒａｎｄｅｄＤＮＡｏｆｔｈｅＡｓｂ１１ｇｅｎｅｔａｒｇｅｔｉｎｇｇＲＮＡｗａｓａｍｐｌｉｆｉｅｄｂｙＰＣＲ.ＴｈｉｒｄｌｙꎬｔｈｅＡｓｂ１１ｇｅｎｅｇＲＮＡａｎｄＨｃａｓ９ｍＲＮＡｗｅｒｅｃｏ￣ｉｎｊｅｃｔｅｄｉｎｔｏｚｅｂｒａｆｉｓｈｅｍｂｒｙｏｓａｔ１￣ｃｅｌｌｓｔａｇｅ.Ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｏｆｔｈｅｅｆｆｅｃｔｉｖｅｎｅｓｓ￣ｔｅｓｔｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｂａｓｅｓｗｅｒｅｄｅｌｅｔｅｄｉｎｔｈｅｅｘｏｎ１ｏｆｔｈｅｚｅｂｒａｆｉｓｈＡｓｂ１１ｇｅｎｅꎬｓｕｇｇｅｓｔｉｎｇｔｈａｔｔｈｅＣＲＩＳＰＲ/Ｃａｓ９ｓｙｓｔｅｍｗａｓｅｆｆｅｃｔｉｖｅｆｏｒｋｎｏｃｋｏｕｔｏｆＡｓｂ１１ｇｅｎｅ.ＡｆｔｅｒｓｃｒｅｅｎｉｎｇｉｎｔｈｅＦ０ꎬＦ１ａｎｄＦ２ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｓꎬｔｈｅｌｉｎｅｓｏｆｚｅｂｒａｆｉｓｈｗｉｔｈＡｓｂ１１ｇｅｎｅｋｎｏｃｋｅｄ￣ｏｕｔｗｅｒｅｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙ.Ｔｈｅｗｏｒｋｌａｉｄａｆｏｕｎｄａｔｉｏｎｆｏｒｅｘｐｌｏｒｉｎｇｔｈｅ第２７卷第３期２０１８年６月㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀激㊀光㊀生㊀物㊀学㊀报ＡＣＴＡ㊀ＬＡＳＥＲ㊀ＢＩＯＬＯＧＹ㊀ＳＩＮＩＣＡ㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀Ｖｏｌ.２７Ｎｏ.３Ｊｕｎ.２０１８收稿日期:２０１８￣０３￣２７ꎻ修回日期:２０１８￣０５￣０４基金项目:国家自然科学基金青年科学基金项目(８１４７０３７７)ꎻ湖南省生物发育工程及新产品研发协同创新中心(２０１３￣４４８￣６)作者简介:尹丽阳(１９９３－)ꎬ女ꎬ硕士研究生ꎬ研究方向为分子遗传ꎮ(电子邮箱)８２１７１６１１２＠ｑｑ.ｃｏｍ∗通讯作者:李永青(１９６５－)ꎬ女ꎬ博士ꎬ湖南师范大学教授ꎬ研究方向为遗传学ꎮ(电子邮箱)ｌｉｙｏｎｇｑｉｎｇ２００２ｃｎ＠ａｌｉｙｕｎ.ｃｏｍｒｏｌｅｓｏｆＡｓｂ１１ｉｎｚｅｂｒａｆｉｓｈｈｅａｒｔｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ.Ｋｅｙｗｏｒｄｓ:ｚｅｂｒａｆｉｓｈꎻＡｓｂ１１ꎻＣＲＩＳＰＲ/Ｃａｓ９㊀㊀生物信息学分析显示ＡＳＢ１１蛋白在Ｎ￣末端有６个串联重复的锚蛋白结构域和１个在Ｃ￣末端的ＳＯＣＳ箱形结构域[１]ꎮＡＳＢ１１蛋白是调控Ｄｅｌｔａ￣Ｎｏｔｃｈ信号的元件ꎬ以一种细胞非自主性机制调节ＤｅｌｔａＡ与Ｎｏｔｃｈ之间的侧抑制ꎬ是Ｄｅｌｔａ￣Ｎｏｔｃｈ信号至关重要的调节因子[２]ꎮ近年来有研究表明ꎬＡｓｂ１１在斑马鱼胚胎发育的终端分化过程中表达下调ꎬ且对于外胚层谱系分布范围具有潜在的调节作用ꎬ并表明Ａｓｂ１１的表达是肌肉祖细胞扩增所必须的ꎬ而其表达下调标志着终端分化的开始[３ꎬ４]ꎮ随后也有证据表明ꎬＡｓｂ１１是胚胎发育和成体肌肉再生的主要调节者[５]ꎮ本实验室前期研究发现ꎬＡｓｂ１１基因包含的两个２.９ｋｂ和５.０ｋｂ转录本在心肌和骨骼肌中特异性表达[６]ꎻ前人研究表明斑马鱼Ａｓｂ１１基因与Ｎｏｔｃｈ信号通路的激活有关ꎬ而Ｎｏｔｃｈ信号通路与斑马鱼心脏的瓣膜及流出道的发育有关ꎮ因此ꎬ本文作者推测Ａｓｂ１１基因也是一种与心脏发育相关的候选基因ꎬ其对于心脏的发育可能有重要的调节作用ꎬ且其可能通过Ｎｏｔｃｈ信号途径调控心脏的发育ꎮ作为近年来兴起的基因编辑技术ꎬＣＲＩＳＰＲ/Ｃａｓ９是细菌演化过程中形成的一种适应性免疫防御机制ꎬ可用来对抗外来入侵的病毒及ＤＮＡ[７￣９]ꎮ前人研究中将ＣＲＩＳＰＲ/Ｃａｓ９分为３种类型ꎬ其中Ⅱ型中的Ｃａｓ９能够识别一种非编码ＲＮＡ(ｓｇＲＮＡ)ꎬ从而对靶向ｄｓＤＮＡ序列进行定点切割[１０]ꎮ因此ꎬ本文利用ＣＲＩＳＰＲ/Ｃａｓ９打靶技术对斑马鱼Ａｓｂ１１基因进行基因敲除ꎮ首先经网站分析筛选出Ａｓｂ１１基因最适合的打靶位点ꎬ通过ＰＣＲ扩增出用于转录Ａｓｂ１１基因的ＣＲＩＳＰＲ/Ｃａｓ９打靶ｇＲＮＡ的双链ＤＮＡ模板ꎬ再将Ａｓｂ１１基因的ｇＲＮＡ和Ｈｃａｓ９的ｍＲＮＡ都转录出来ꎬ混合后共同注射到斑马鱼胚胎Ⅰ细胞期胚胎中ꎮ在显微注射后ꎬ对Ａｓｂ１１基因ＣＲＩＳＰＲ/Ｃａｓ９打靶的Ｆ０代进行有效性检测ꎬ发现在斑马鱼Ａｓｂ１１基因的第一号外显子出现了５个和８个碱基的缺失ꎬ证明ＣＲＩＳＰＲ/Ｃａｓ９系统对Ａｓｂ１１基因的敲除是有效的ꎮ进一步对其Ｆ０代㊁Ｆ１代和Ｆ２代进行筛选ꎬ成功获得Ａｓｂ１１基因敲除的斑马鱼品系ꎮ这些工作为探究Ａｓｂ１１在心脏发育中的作用奠定了基础ꎮ１㊀材料与方法１.１㊀材料大肠杆菌感受态菌株Ｅ.ｃｏｌｉ:Ｔｏｐ１０以及ＤＨ５αꎬ克隆Ｔ载体(ＰＭＤ１８￣Ｔ)ꎬ本实验所有的野生型斑马鱼ＡＢ品系(所获得胚胎均在２８.５ħ恒温Ｅ３水中进行孵育)ꎬＤＮＡ胶纯化和回收试剂盒ꎬＴ７转录试剂盒ꎬ质粒快速提取试剂盒ꎬ显微注射仪ꎬＲＮＡＣｙｃｌｅＰｕｒｅｋｉｔ等ꎮ１.２㊀方法１.２.１㊀Ｃｒｉｓｐｒ打靶位点的选择从Ｅｓｅｍｂｌ(ｈｔｔｐ://ｗｗｗ.ｅｎｓｅｍｂｌ.ｏｒｇ/ｉｎｄｅｘ.ｈｔ￣ｍｌ)网站上获取目标基因的完整序列ꎬ各个转录本以及外显子和内含子等信息ꎻ并选取其中序列大小合适的外显子(一般优先选取１号外显子)ꎬ再在ＮＣＢＩ(ｈｔｔｐ://ｗｗｗ.Ｎｃｂｉ.Ｎｌｍ.Ｎｉｈ.ｇｏｖ/)网站上Ｂｌａｓｔ其序列是否单一正确ꎮ然后用网上软件(ｈｔｔｐ://ｗｗｗ.ｇｅｎｏｍｅ￣ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ.ｏｒｇ/ｃｒｉｓｐｒ/?ｐａｇｅ＿ｉｄ＝４１)进行打靶位点的设计选择ꎬ从中选取评分最高㊁最合适的靶标位点ꎮ１.２.２㊀靶标序列ｇＲＮＡ的合成根据国家斑马鱼资中心的资料可知ꎬ科学家已将ｇＲＮＡ的骨架序列克隆至ＰＭＤ１９￣Ｔ载体中ꎬ并命名为ｐ４２２５０质粒(如图１所示)ꎮ运用１.２.１所述网站设计合成的ｇＲＮＡ以Ｐ４２２５０质粒(ｇＲＮＡ骨架载体)为模板进行ＰＣＲ扩增ꎬ将扩增后得到的序列进行ＰＣＲ产物胶纯化回收ꎬ用Ｔ７转录酶系统对纯化回收后的ＰＣＲ序列进行体外转录成ｍＲＮＡꎬ再用ＲＮＡ纯化试剂盒对ｍＲＮＡ纯化回收ꎬ保存于－８０ħ冰箱ꎮ１.２.３㊀Ｃａｓ９的合成与制备用ＸｂａⅠ将ｍＲＮＡＣａｓ９的模板ｈ￣Ｃａｓ９质粒酶切线性化ꎬ经过ＤＮＡ胶纯化回收试剂盒进行纯化回收ꎬ用ＲＮａｓｅＦｒｅｅＨ２Ｏ溶解回收于ＲＮａｓｅＦｒｅｅ的ＥＰ管中ꎮ使用Ｔ７ＵｌｔｒａＫｉｔ(ＡｍｂｉｏｎꎬＡＭ１３４５)进行体外转录成ｍＲＮＡꎬ再用ＲＮＡ纯化试剂盒对ｍＲＮＡ纯化回收ꎬ保存于－８０ħ冰箱ꎮ１.２.４㊀斑马鱼胚胎显微注射及有效性检测收取斑马鱼胚胎ꎬ待其发育至Ⅰ细胞期时排列整齐于注射板上ꎬ用半自动注射仪将提前混合好的ｈＣａｓ９ｍＲＮＡ和ｇＲＮＡ(二者的混合按一定的浓度比:ｈＣａｓ９ｍＲＮＡʒ３００ｎｇ/μＬꎬｇＲＮＡʒ２０ｎｇ/μＬꎻ)共同注３５２第３期㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀尹丽阳等:利用ＣＲＩＳＰＲ/Ｃａｓ９技术建立斑马鱼Ａｓｂ１１基因敲除品系㊀㊀㊀射其中ꎮ同时收取同缸产的野生型胚胎进行对照ꎬ置于２８ħ培养箱培养４８ｈ至７２ｈꎬ期间收取１/３注射过后的胚胎及ＷＴ的胚胎进行有效性检测ꎬ提取其基因组ꎬ然后进行ＰＣＲ扩增ꎬ测序检测ꎮ１.２.５㊀斑马鱼Ｆ０㊁Ｆ１㊁Ｆ２代基因型鉴定胚胎有效性检测为阳性后ꎬ将该批斑马鱼培养至３个月左右成熟ꎬ对单个个体斑马鱼剪尾提取基因组ꎬＰＣＲ后测序分析ꎬ对于测序结果为双峰的个体ꎬ进行ＰＭＤ１８￣Ｔ载体连接转化ꎬ再进行测序分析ꎬ从而获得有缺失的突变个体即Ｆ０代ꎮ将Ｆ０代与ＷＴ杂交ꎬ获得Ｆ１代ꎬ剪尾提取基因组ＤＮＡꎬ进行ＰＣＲꎬ产物进行测序分析ꎬ获得可稳定遗传的Ｆ１代ꎮＦ１代雄性杂合体与Ｆ１代雌性杂合体杂交ꎬ可获得Ｆ２代纯合突变体ꎬ然后进行ＰＣＲ和测序检测分析ꎮ图１㊀ｐ４２２５０质粒示意图Ｆｉｇ.１㊀Ｔｈｅｐｉｃｔｕｒｅｏｆｐ４２２５０ｐｌａｓｍｉｄ图２㊀Ａｓｂ１１基因靶标位点示意图Ｆｉｇ.２㊀ＴｈｅｄｅｓｉｇｎｄｉａｇｒａｍｏｆＡｓｂ１１ｇｅｎｅｔａｒｇｅｔｉｎｇｓｉｔｅ注:以上序列是Ａｓｂ１１基因序列的一部分ꎬ加粗部分是１号外显子ꎻ未加粗的是内含子ꎻ下划线为直线的表示靶标序列ꎻ下划线为双直线的表示ＰＡＭ序列ꎻ阴影部分为检测引物ꎬ绿色为两对引物重叠部分ꎮＮｏｔｅ:ＴｈｅａｂｏｖｅｓｅｑｕｅｎｃｅｉｓａｐａｒｔｉａｌｓｅｑｕｅｎｃｅｏｆｔｈｅＡｓｂ１１ｇｅｎｅꎻｔｈｅｂｏｌｄｐａｒｔｉｓｅｘｏｎ１ꎻｔｈｅｕｎ￣ｅｎｈａｎｃｅｄｐｏｒｔｉｏｎｉｓａｎｉｎｔｒｏｎꎻ ㊀ :ｔｈｅｔａｒｇｅｔｓｅｑｕｅｎｃｅꎻ ㊀ :ｔｈｅＰＡＭｓｅｑｕｅｎｃｅꎻｓｈａｄｏｗｒｅｇｉｏｎ:ｔｈｅｐｒｉｍｅｒｓｆｏｒｄｅｔｅｃｔｉｏｎꎻｇｒｅｅｎｒｅｇｉｏｎ:ｔｈｅｏｖｅｒｌａｐｏｆｔｗｏｐａｉｒｓｐｒｉｍｅｒｓ.２㊀结果２.１㊀Ａｓｂ１１基因靶位点的选择按１.２.１所述的方法在Ａｓｂ１１基因１号外显子上择优选取打靶位点ꎬ将保护碱基ｔｇ和Ｔ７启动子加在设计好的靶位点序列前面ꎬｇＲＮＡ骨架的上游序列加在靶位点后面ꎬ将此作为正向引物序列ꎬ命名为:Ａｓｂ１１￣ｇＲＮＡ￣Ｆ１ꎻ以ｇＲＮＡ骨架的下游序列为反向引物ꎬ即Ａｓｂ１１￣Ｃａｓ￣Ｒ(如表１)ꎮ２.２㊀Ａｓｂ１１基因ｇＲＮＡ和ＣＡＳ９ｍＲＮＡ的合成将按１.２.２中所述方法设计好的靶标ｇＲＮＡ序列送铂尚公司合成后ꎬ用ＸｂａⅠ酶切线性化的ｐ４２２５０质粒为模板ꎬ以Ａｓｂ１１￣ｇＲＮＡ￣Ｆ１为正向引物ꎬＡｓｂ１１￣Ｃａｓ￣Ｒ作为反向引物进行ＰＣＲ扩增(凝胶电泳结果如图３)ꎮ将ＰＣＲ产物纯化回收后ꎬ以Ｔ７体外转录系统进行体外转录成ｍＲＮＡꎬ随后纯化回收(图４所示)ꎻｈＣａｓ９ｍＲＮＡ也是以线性化的ｐ４２２５０质粒为模板体外转录获得ꎬ纯化回收后均保存于－８０ħꎮ４５２㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀激㊀光㊀生㊀物㊀学㊀报㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀第２７卷表１㊀ｇＲＮＡ及引物序列列表Ｔａｂ.１㊀ｇＲＮＡａｎｄｐｒｉｍｅｒｓｌｉｓｔｇＲＮＡ名称ｇＲＮＡｎａｍｅｇＲＮＡ序列ｇＲＮＡｓｅｑｕｅｎｃｅＡｓｂ１１￣ｇＲＮＡ￣Ｆ１ＴｇＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＡＴＴＡＡＧＣＡＡＴＧＧＧＡＴＣＡＣＧＴＴＴ￣ＴＡＧＡＧＣＴＡＧＡＡＡＴＡＧＣＡｓｂ１１￣Ｃａｓ￣ＲＡＡＧＣＡＣＣＧＡＣＴＣＧＧＴＧＣＣＡＣＴＡｓｂ１１￣Ｅｘｏｎ１￣Ｓ５ᶄＡＧＡＧＧＧＧＣＡＧＴＡＡＡＡＧＣＡＣＡＴ３ᶄＡｓｂ１１￣Ｅｘｏｎ１￣ＡＳ５ᶄＡＴＧＣＴＡＣＡＧＴＣＡＣＧＧＴＡＣＡＡＧ３ᶄＡｓｂ１１￣Ｆ２￣Ｓ５ᶄＴＧＧＡＴＴＡＡＧＣＡＡＴＧＧＧＡＴＣＡＣＡＧ３ᶄＡｓｂ１１￣Ｆ２￣ＡＳ５ᶄＣＴＡＣＡＧＴＣＡＣＧＧＴＡＣＡＡＧＴＴＴＣＡ３ᶄ注:其中Ａｓｂ１１￣ｇＲＮＡ￣Ｆ１是ｇＲＮＡ正向引物ꎻｔｇ是保护碱基ꎻＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡ是Ｔ７启动子序列ꎻ下划线部分是靶标序列ꎻＧＴＴＴＴＡＧＡＧＣＴＡＧＡＡＡＴＡＧＣ是ｇＲＮＡ骨架上游序列ꎻＡｓｂ１１￣Ｃａｓ￣Ｒ是ｇＲＮＡ反向引物ꎻＡＡＧＣＡＣ￣ＣＧＡＣＴＣＧＧＴＧＣＣＡＣＴ是ｇＲＮＡ骨架下游序列ꎻＡｓｂ１１￣Ｅｘ￣ｏｎ１￣Ｓ及Ａｓｂ１１￣Ｅｘｏｎ１￣ＡＳꎬＡｓｂ１１￣Ｆ２￣Ｓ和Ａｓｂ１１￣Ｆ２￣ＡＳ是检测引物ꎮＮｏｔｅ:Ａｓｂ１１￣ｇＲＮＡ￣Ｆ１:ｇＲＮＡｆｏｒｗａｒｄｐｒｉｍｅｒꎻＴｇ:ｔｈｅｐｒｏ￣ｔｅｃｔｉｎｇｂａｓｅꎻＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡ:ｔｈｅＴ７ｐｒｏｍｏｔｅｒｓｅ￣ｑｕｅｎｃｅꎻ ㊀ :ｔｈｅｔａｒｇｅｔｓｉｔｅｓｅｑｕｅｎｃｅꎻＧＴＴＴＴＡＧＡＧＣＴＡＧＡＡＡＴＡＧＣ:ｔｈｅｕｐｓｔｒｅａｍｓｅｑｕｅｎｃｅｏｆｔｈｅｇＲＮＡｂａｃｋｂｏｎｅｓｅｑｕｅｎｃｅꎻＡｓｂ１１￣Ｃａｓ￣Ｒ:ａｇＲＮＡｒｅｖｅｒｓｅｐｒｉｍｅｒꎻＡＡＧＣＡＣ￣ＣＧＡＣＴＣＧＧＴＧＣＣＡＣＴ:ｔｈｅｄｏｗｎｓｔｒｅａｍｓｅｑｕｅｎｃｅｏｆｔｈｅｇＲＮＡｂａｃｋ￣ｂｏｎｅｓｅｑｕｅｎｃｅꎻＡｓｂ１１￣Ｅｘｏｎ１￣ＳꎬＡｓｂ１１￣Ｅｘｏｎ１￣ＡＳꎬＡｓｂ１１￣Ｆ２￣ＳꎬＡｓｂ１１￣Ｆ２￣ＡＳ:ｔｈｅｐｒｉｍｅｒｓｆｏｒｄｅｔｅｃｔｉｏｎ.图３㊀Ａｓｂ１１基因ｇＲＮＡ模板ＰＣＲ扩增片段结果Ｆｉｇ.３㊀ＴｈｅＰＣＲａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｒｅｓｕｌｔｓｏｆＡｓｂ１１￣ｇＲＮＡＭ:ＤＮＡｍａｒｋｅｒꎻ１㊁２:Ａｓｂ１１￣ｇＲＮＡ￣Ｆ１图４㊀Ａｓｂ１１基因ｇＲＮＡ体外转录纯化结果Ｆｉｇ.４㊀ＴｈｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｒｅｓｕｌｔｓｏｆＡｓｂ１１￣ｇＲＮＡＭ:ＤＮＡｍａｒｋｅｒꎻ１㊁２:Ａｓｂ１１￣ｇＲＮＡ￣Ｆ１２.３㊀Ａｓｂ１１基因打靶有效性检测分析由１.２.４所述的实验方法将ｈＣａｓ９ｍＲＮＡ与Ａｓｂ１１￣ｇＲＮＡ￣Ｆ１在斑马鱼胚胎发育至Ⅰ细胞期时混合共同注射入胚胎中ꎬ将胚胎置于２８ħ下孵育４８￣７２ｈ后随机挑取８管ꎬ其中１管为野生型胚胎(对照)ꎬ每管大约５￣１０颗胚胎提取基因组ꎬ以其为模板ꎬ分别以Ａｓｂ１１￣Ｅｘｏｎ１￣Ｓ及Ａｓｂ１１￣Ｅｘｏｎ１￣ＡＳ为正反引物进行ＰＣＲ扩增ꎬ凝胶电泳结果显示ＰＣＲ产物的大小约为４００ｂｐ(图５所示)ꎬ与预期的３８７ｂｐ相符ꎮ将ＰＣＲ产物送测序分析ꎬ结果显示在Ａｓｂ１１￣ｇＲＮＡ￣Ｆ１的靶位点处出现双峰(结果如图６)ꎬ提示该位点存在碱基的插入与缺失ꎮ㊀㊀为了更明确Ａｓｂ１１￣ｇＲＮＡ￣Ｆ１注射的有效性ꎬ我们将注射的胚胎提基因组后纯化回收ＰＣＲ产物与ＰＭＤ１８￣Ｔ载体连接后转化ꎬ挑１０个左右单克隆菌落送测序ꎬ测序结果表明确实存在５ｂｐ和８ｂｐ碱基的缺失(如图７)ꎮ进一步说明了Ａｓｂ１１￣ｇＲＮＡ￣Ｆ１注射是有效的ꎮ２.４㊀Ａｓｂ１１基因打靶Ｆ０代突变体的筛选检测过打靶的有效性后ꎬ将注射了Ａｓｂ１１￣ｇＲＮＡ￣Ｆ１与ｈＣａｓ９的胚胎培养至３个月左右性成熟ꎬ养大的斑马鱼一共有２１条ꎬ按编号Ａｓｂ１１￣Ｆ０￣１至Ａｓｂ１１￣Ｆ０￣２１对其进行排序剪尾提基因组ꎬ并以其为模板ꎬ用引物Ａｓｂ１１￣Ｅｘｏｎ１￣Ｓ及Ａｓｂ１１￣Ｅｘｏｎ１￣ＡＳ进行ＰＣＲ扩增ꎬ得到一条３８７ｂｐ的条带ꎬ回收ＰＣＲ产物送测序ꎬ测序结果显示Ａｓｂ１１￣Ｆ０￣３㊁５㊁８㊁９靶位点有双峰ꎬ打靶效率为１９.０４％ꎬ其中Ａｓｂ１１￣Ｆ０￣８的测序结果如图８所示ꎮ５５２第３期㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀尹丽阳等:利用ＣＲＩＳＰＲ/Ｃａｓ９技术建立斑马鱼Ａｓｂ１１基因敲除品系㊀㊀㊀图５㊀ＰＣＲ产物电泳结果示意图Ｆｉｇ.５㊀ＴｈｅｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓｒｅｓｕｌｔｓｏｆＰＣＲｐｒｏｄｕｃｔＭ:ＤＮＡｍａｒｋｅｒꎻ１￣７:注射组１￣７ꎻ８:ＷＴ(野生型对照组)Ｍ:ＤＮＡｍａｒｋｅｒꎻ１￣７:Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎｇｒｏｕｐ１￣７ꎻ８:ＷＴ(ｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐ)图６㊀ＰＣＲ产物测序峰值图Ｆｉｇ.６㊀ＰＣＲｐｒｏｄｕｃｔｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇｐｅａｋｒｅｓｕｌｔｓ注:图为正向测序峰值结果ꎬ黑色下划线部分为Ａｓｂ１１￣ｇＲＮＡ￣Ｆ１靶标位点ꎮＮｏｔｅ:Ｔｈｅｐｉｃｔｕｒｅｉｓｔｈｅｒｅｓｕｌｔｏｆｆｏｒｗａｒｄｄｉｒｅｃｔｉｏｎｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇｐｅａｋｍａｐꎻ ㊀ :ｔｈｅｔａｒｇｅｔｓｅｑｕｅｎｃｅｏｆＡｓｂ１１￣ｇＲＮＡ￣Ｆ１.㊀㊀通过对测序结果进行分析ꎬ我们将Ａｓｂ１１￣Ｆ０￣３㊁５㊁８㊁９这４个基因组ＰＣＲ的纯化产物与ＰＭＤ１８￣Ｔ载体连接ꎬ之后转化挑１０个单克隆菌落送测序ꎬ并对测序结果进行比对ꎬ获知Ａｓｂ１１￣Ｆ０￣９㊁３㊁５㊁８分别出现１个和２个碱基的插入ꎬ９个和１４个碱基的缺失(如图９)ꎬ由于９是３的倍数ꎬ因此Ａｓｂ１１￣Ｆ０￣５的敲除未达到目的ꎮ２.５㊀稳定性遗传的检测为了验证Ｆ０代个体是否能够稳定遗传ꎬ我们将Ｆ０代嵌合体与野生型斑马鱼杂交得到Ｆ１代个体ꎬ培图７㊀ｇＲＮＡ打靶区域序列与正常序列比对结果Ｆｉｇ.７㊀ＴｈｅＢＬＡＳＴｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｒｅｓｕｌｔｓｏｆｇＲＮＡｔａｒｇｅｔｓｅｑｕｅｎｃｅｔｏｔｈｅｓｅｑｕｅｎｃｅｏｆＷＴ注:黑色下划线部分为Ａｓｂ１１￣ｇＲＮＡ￣Ｆ１靶标位点ꎬ黑色下划线为三直线部分表示ＰＡＭ序列Ｎｏｔｅ: ㊀ :ｔｈｅｔａｒｇｅｔｓｅｑｕｅｎｃｅｏｆＡｓｂ１１￣ｇＲＮＡ￣Ｆ１ꎻ㊀ :ｔｈｅＰＡＭｓｅｑｕｅｎｃｅ.图８㊀Ａｓｂ１１￣Ｆ０￣８的ＰＣＲ产物测序峰值结果图Ｆｉｇ.８㊀Ａｓｂ１１￣Ｆ０￣８ＰＣＲｐｒｏｄｕｃｔｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇｐｅａｋｒｅｓｕｌｔｓ注:黑色下划线部分为Ａｓｂ１１￣ｇＲＮＡ￣Ｆ１靶标位点ꎮＮｏｔｅ: ㊀ :ｔｈｅｔａｒｇｅｔｓｅｑｕｅｎｃｅｏｆＡｓｂ１１￣ｇＲＮＡ￣Ｆ１.养至３个月左右性成熟ꎬ对Ｆ１代个体剪尾提基因６５２㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀激㊀光㊀生㊀物㊀学㊀报㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀第２７卷组ꎬ以基因组ＤＮＡ为模板进行ＰＣＲ扩增ꎬ送测序ꎻ将测序结果为双峰的ＰＣＲ产物纯化回收后连接ＰＭＤ１８￣Ｔ载体克隆ꎬ挑单克隆测序比对分析结果见表２ꎬ结果显示有３个突变类型能够稳定遗传ꎮ图９㊀Ａｓｂ１１Ｆ０代测序比对结果示意图Ｆｉｇ.９㊀ＴｈｅｂｌａｓｔｏｆｓｅｑｕｅｎｃｅｒｅｓｕｌｔｓｏｆＡｓｂ１１Ｆ０表２㊀斑马鱼Ａｓｂ１１基因Ｆ１代突变体比对结果图Ｔａｂ.２㊀ＴｈｅｂｌａｓｔｒｅｓｕｌｔｓｏｆｚｅｂｒａｆｉｓｈＡｓｂ１１ｇｅｎｅｍｕｔａｎｔＦ１名称Ｎａｍｅ比对结果ＢｌａｓｔｒｅｓｕｌｔｓＡｓｂ１１￣Ｆ１￣１(１４个碱基缺失)Ａｓｂ１１￣Ｆ１￣２(１个碱基插入)Ａｓｂ１１￣Ｆ１￣３(２个碱基插入)注:Ｑｕｅｒｙ:ＷＴ序列ꎻＳｂｊｃｔ:测序序列ꎮＮｏｔｅ:Ｑｕｅｒｙ:ＷＴｓｅｑｕｅｎｃｅꎻＳｂｊｃｔ:Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇｓｅｑｕｅｎｃｅ.２.６㊀Ｆ２代纯合突变体的筛选本文选择缺失了１４个碱基的Ａｓｂ１１￣Ｆ１￣１ꎬ插入了１个和２个碱基的Ａｓｂ１１￣Ｆ１￣２㊁Ａｓｂ１１￣Ｆ１￣３这３种Ｆ１代突变体建立稳定遗传的纯合敲除品系ꎮ已经筛选到缺失了１４个碱基的雄性和雌性Ｆ１代斑马鱼突变体ꎬ二者杂交后获得大量胚胎ꎬ在适宜条件下培养胚胎至３个月左右性成熟ꎬ剪尾提取基因组鉴定ꎮ通过两对检测引物进行ＰＣＲ扩增后的电泳结果及测序检测分析(图１０所示)ꎬ已经获得Ｆ２代雄性纯合突变体ꎮＡｓｂ１１￣Ｆ２￣Ｓ和Ａｓｂ１１￣Ｆ２￣ＡＳＰＣＲ扩增的条带大小为１８１ｂｐꎬ在Ａｓｂ１１￣Ｅｘｏｎ１￣Ｓ及Ａｓｂ１１￣Ｅｘｏｎ１￣ＡＳ为引物进行ＰＣＲ扩增有大小为３８７ｂｐ的条带的情况下ꎬ若第二对引物ＰＣＲ扩增无条带ꎬ则表明为纯合子(如图１１)ꎮ图１０㊀ＰＣＲ产物电泳结果Ｆｉｇ.１０㊀ＴｈｅｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓｒｅｓｕｌｔｓｏｆＰＣＲｐｒｏｄｕｃｔＭ:ＤＮＡｍａｒｋｅｒꎻ１￣１５:Ｆ２代个体ꎻ８:ＷＴ(野生型对照组)Ｍ:ＤＮＡｍａｒｋｅｒꎻ１￣１５:Ｆ２ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｆｉｓｈꎻ８:ＷＴ(ｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐ)㊀㊀目前已对１５２条Ｆ２代进行了突变体的筛选ꎬ得到了２４条纯合突变体ꎬ均为雄性ꎬ尚未获得雌性纯合突变体ꎮ还有大量Ｆ２代小鱼及胚胎正在培育中ꎬ将继续筛查ꎮ３㊀讨论ＣＲＩＳＰＲ/Ｃａｓ９基因编辑技术是继ＺＦＮ㊁ＥＳ细胞打靶和ＴＡＬＥＮ打靶等传统技术后出现的第四种可７５２第３期㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀尹丽阳等:利用ＣＲＩＳＰＲ/Ｃａｓ９技术建立斑马鱼Ａｓｂ１１基因敲除品系㊀㊀㊀图１１㊀Ｆ２代纯合突变体测序比对结果Ｆｉｇ.１１㊀ＴｈｅｂｌａｓｔｏｆｓｅｑｕｅｎｃｅｒｅｓｕｌｔｓｏｆｈｏｍｏｚｙｇｏｕｓＦ２ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｍｕｔａｎｔ应用于定点构建基因敲除大㊁小鼠动物模型的方法ꎮ它设计简单ꎬ制作成本低ꎻ效率高㊁速度快ꎻ能特异性识别任意序列ꎬ无物种限制ꎻ毒性低且脱靶情况少ꎬ因而广泛应用于基因定点修饰ꎬ在动物模型构建的应用上前景十分广阔ꎬ目前已广泛应用于生命科学领域的研究[１１￣１７]ꎮ本文用ＣＲＩＳＰＲ/Ｃａｓ９基因编辑技术ꎬ也在斑马鱼胚胎的整体水平敲除了Ａｓｂ１１基因ꎬ成功地构建斑马鱼Ａｓｂ１１基因敲除稳定遗传系ꎮ本实验室的前期研究结果显示Ａｓｂ１１基因在心肌和骨骼肌中特异性表达ꎮＡｓｂ１１基因在骨骼肌中的作用已经得到了很好的诠释ꎮ已有的研究表明Ａｓｂ１１的表达是肌肉祖细胞扩增所必须的ꎬ而其表达下调标志终末分化的开始[３ꎬ４]ꎬ该基因还是成体肌肉再生的主要调节者[５]ꎮ但是Ａｓｂ１１基因在心脏发育中的功能尚不清楚ꎮ为此ꎬ本文用ＣＲＩＳＰＲ/Ｃａｓ９基因编辑的新技术构建斑马鱼Ａｓｂ１１基因敲除品系ꎬ通过ＰＣＲ测序检测分析已经成功获得了可以稳定遗传的Ｆ２代突变体系ꎮ这一工作为深入探究该基因在心脏发育中的作用奠定了基础ꎮ在对Ｆ２代突变体的筛选中ꎬ本次研究仅获得了该基因缺失１４ｂｐ的雄性纯合突变体ꎬ并未筛选到雌性纯合突变体ꎮ斑马鱼早期是雌雄同体ꎬ卵巢的发育是受精后１０￣２０ｄ期间ꎬ随后卵巢细胞开始凋亡ꎬ精巢开始发育ꎬ其性别分化被确定[１８]ꎮ斑马鱼的性成熟需要３个月左右ꎬ在其胚胎发育阶段ꎬ存在多个决定其性腺发育的基因ꎻ有研究显示ꎬ斑马鱼的性别决定也是由多个基因协同调控芳香化酶基因的表达ꎬ使其活性降低或缺失ꎬ从而影响雌激素的分泌ꎬ导致卵巢的程序性死亡ꎻ而在这种情况下ꎬ睾丸细胞开始分化ꎬ斑马鱼的性别逐渐由雌性向雄性转变[１９ꎬ２０]ꎮ对于本次研究中Ｆ２代纯合突变体仅出现雄性的现象ꎬ较为合理的解释有四种:１)实验样本基数过少ꎮ本研究已完成性别鉴定的斑马鱼１５２条ꎬ但纯合子突变体只有２４条ꎬ实验基数还不够大ꎬ须在后期的研究中增大Ｆ２代个体筛选的数目ꎬ以完全排除筛选基数少导致这种现象的可能性ꎮ２)在斑马鱼的养殖过程中ꎬ本文作者发现斑马鱼的养殖密度过大也可能会影响到其性别的分化ꎬ使得斑马鱼的性别由雌性向雄性转化ꎮ后期需减小Ｆ２代斑马鱼个体的养殖密度ꎬ应按照合理的饲养密度不大于１Ｔａｉｌ/Ｌ进行Ｆ２代斑马鱼的饲养ꎬ排除养殖密度对性别分化的影响ꎮ３)众所周知ꎬＣＲＩＳＰＲ/Ｃａｓ９打靶技术仍然存在一定的脱靶率ꎬ所以在Ａｓｂ１１基因被敲除的情况下ꎬ也可能出现其他与斑马鱼性别决定相关的基因被敲除ꎮ因此ꎬ需对斑马鱼性别决定的相关基因进行鉴定㊁筛查或者进行全基因组测序ꎬ确定其他基因是否发生了移码突变ꎬ从而影响了其性别的分化ꎮ４)Ａｓｂ１１基因可能参与了斑马鱼的性别发育ꎬ８５２㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀激㊀光㊀生㊀物㊀学㊀报㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀第２７卷且在性别转化过程中该基因是不可或缺的ꎬ即在斑马鱼性别分化过程中Ａｓｂ１１基因发挥着关键作用ꎬ正常表达的Ａｓｂ１１基因会保持斑马鱼性别转化的稳定性ꎬ使后代雌雄比例保持相对稳定的状态ꎮ一旦Ａｓｂ１１基因缺失ꎬ斑马鱼的性别分化机制可能发生紊乱ꎬ这种紊乱可能为斑马鱼雌性发育过程被阻断ꎬ促使斑马鱼在性别分化过程中只能向雄性转化ꎮ也可能为Ａｓｂ１１基因敲除后ꎬ启动了卵巢细胞的凋亡机制ꎬ加速了卵巢细胞的凋亡进程ꎬ在此过程中精巢细胞发育过程不受影响ꎬ使得Ａｓｂ１１基因敲除后的Ｆ２代纯合突变体均为雄性ꎮ只有确定Ｆ２代纯合突变体的性别决定是否受其他因素的影响ꎬ才能进行进一步有关Ａｓｂ１１基因是否是斑马鱼性别决定相关基因的具体情况分析研究ꎮ参考文献[１]㊀ＨＩＬＴＯＮＤＪꎬＲＩＣＨＡＲＤＳＯＮＲＴꎬＡＬＥＸＡＮＤＥＲＷＳꎬｅｔａｌ.ＴｗｅｎｔｙｐｒｏｔｅｉｎｓｃｏｎｔａｉｎｉｎｇａＣ￣ｔｅｒｍｉｎａｌＳＯＣＳｂｏｘｆｏｒｍｆｉｖｅｓｔｒｕｃｔｕｒａｌｃｌａｓｓｅｓ[Ｊ].ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡꎬ１９９８ꎬ９５(１):１１４￣１１９.[２]㊀ＤＩＫＳＳＨꎬＳＡＲＴＯＲＩＤＡＳＩＬＶＡＭＡꎬＨＩＬＬＥＢＲＡＮＤＳＪＬꎬｅｔａｌ.ｄ￣Ａｓｂ１１ｉｓａｎｅｓｓｅｎｔｉａｌｍｅｄｉａｔｏｒｏｆｃａｎｏｎｉｃａｌＤｅｌｔａ￣Ｎｏｔｃｈｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ[Ｊ].ＮａｔｕｒｅＣｅｌｌＢｉｏｌｏｇｙꎬ２００８ꎬ１０(１０):１１９０￣１１９８.[３]㊀ＳＡＲＴＯＲＩＤＡＳＩＬＶＡＭＡꎬＴＥＥＪＭꎬＰＡＲＩＤＡＥＮＪꎬｅｔａｌ.Ｅｓｓｅｎｔｉａｌｒｏｌｅｆｏｒｔｈｅｄ￣Ａｓｂ１１ꎬｃｕｌ５ꎬｂｏｘｄｏｍａｉｎｆｏｒｐｒｏｐｅｒｎｏｔｃｈｓｉｇｎａｌｉｎｇａｎｄｎｅｕｒａｌｃｅｌｌｆａｔｅｄｅｃｉｓｉｏｎｓꎬｉｎｖｉｖｏ[Ｊ].ＰｌｏｓＯｎｅꎬ２０１０ꎬ５(１１):ｅ１４０２３.[４]㊀ＤＩＫＳＳＨꎬＢＩＮＫＲＪꎬＷＡＴＥＲＳＶＤꎬｅｔａｌ.ＴｈｅｎｏｖｅｌｇｅｎｅＡｓｂ１１:ａｒｅｇｕｌａｔｏｒｏｆｔｈｅｓｉｚｅｏｆｔｈｅｎｅｕｒａｌｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｃｏｍｐａｒｔ￣ｍｅｎｔ[Ｊ].ＪｏｕｒｎａｌｏｆＣｅｌｌＢｉｏｌｏｇｙꎬ２００６ꎬ１７４(４):５８１￣５９２. [５]㊀ＴＥＥＪＭꎬＭＡＳＤＳꎬＲＹＧＩＥＬＡＭꎬｅｔａｌ.Ａｓｂ１１ｉｓａｒｅｇｕｌａｔｏｒｏｆｅｍｂｒｙｏｎｉｃａｎｄａｄｕｌｔｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅｍｙｏｇｅｎｅｓｉｓ[Ｊ].ＳｔｅｍＣｅｌｌｓ＆Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔꎬ２０１２ꎬ２１(１７):３０９１￣３１０３. [６]㊀杨建华.人类Ａｓｂ１１基因在肌细胞分化中的调控作用[Ｄ].湖南师范大学ꎬ２０１０.ＹＡＮＧＪｉａｎｈｕａ.ＲｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆｈｕｍａｎＡｓｂ１１ｇｅｎｅｉｎｍｕｓｃｌｅｃｅｌｌｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ[Ｄ].ＨｕｎａｎＮｏｒｍａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬ２０１０. [７]㊀ＱＩＬＳꎬＬＡＲＳＯＮＭＨꎬＧＩＬＤＥＲＴＬＡꎬｅｔａｌ.ＲｅｐｕｒｐｏｓｉｎｇＣＲＩＳＰＲａｓａｌｌＲＮＡｇｕｉｄｅｄｐｌＴＭＰＡｏｒｍｆｏｒｓｅｑｕｅｎｃｅ￣ｓｐｅｃｉｆｉｃｃｏｎｔｒｏｌｏｆｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ[Ｊ].Ｃｅｌｌꎬ２０１３ꎬ１５２:１１７３￣１１８３. [８]㊀ＨＯＲＶＡＴＨＰꎬＢＡＲＲＡＮＧＯＵＲ.ＣＲＩＳＰＲ/Ｃａｓꎬｔｈｅｉｍｍｕｎｅｓｙｓｔｅｍｏｆｂａｃｔｅｒｉａａｎｄａｒｃｈａｅａ[Ｊ].Ｓｃｉｅｎｃｅꎬ２０１０ꎬ３２７(５９６２):１６７￣１７０.[９]㊀ＩＳＨＩＮＯＹꎬＳＨＩＮＡＧＡＷＡＨꎬＭＡＫＩＮＯＫꎬｅｔａｌ.ＮｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓｅｑｕｅｎｃｅｏｆｔｈｅｉａｐｇｅｎｅꎬｒｅｓｐｏｎｓｉｂｌｅｆｏｒａｌｋａｌｉｎｅｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅｉｓｏｚｙｍｅｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎｉｎＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉꎬａｎｄｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｇｅｎｅｐｒｏｄｕｃｔ[Ｊ].ＪＢａｃｔｅｒｉｏｌꎬ１９８７ꎬ１６９(１２):５４２９￣５４３３. [１０]㊀ＧＲＩＳＳＡＩꎬＶＥＲＧＮＡＵＤＧꎬＰＯＵＲＣＥＬＣ.ＴｈｅＣＲＩＳＰＲｄｂｄａ￣ｔａｂａｓｅａｎｄｔｏｏｌｓｔｏｄｉｓｐｌａｙＣＲＩＳＰＲｓａｎｄｔｏｇｅｎｅｒａｔｅｄｉｃｔｉｏｎａｒｉｅｓｏｆｓｐａｃｅｒｓａｎｄｒｅｐｅａｔｓ[Ｊ].ＢＭＣＢｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓꎬ２００７ꎬ８:１７２.[１１]㊀ＣＯＮＧＬꎬＲＡＮＦＡꎬＣＯＸＤꎬｅｔａｌ.Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｇｅｎｏｍｅｅｎｇｉ￣ｎｅｅｒｉｎｇｕｓｉｎｇＣＲＩＳＰＲ/Ｃａｓｓｙｓｔｅｍｓ[Ｊ].Ｓｃｉｅｎｃｅꎬ２０１３ꎬ３３９:８１９￣８２３.[１２]㊀ＫＯＮＥＲＭＡＮＮＳꎬＢＲＩＧＨＡＭＭＤꎬＴＲＥＶＩＮＯＡＥꎬｅｔａｌ.Ｇｅ￣ｎｏｍｅ￣ｓｃａｌｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌａｃｔｉｖａｔｉｏｎｂｙａｎｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄＣＲＩＳＰＲ￣Ｃａｓ９ｃｏｍｐｌｅｘ[Ｊ].Ｎａｔｕｒｅꎬ２０１４ꎬ５１２(７５１５):４４１￣４４４. [１３]㊀ＹＡＮＱꎬＺＨＡＮＧＱꎬＹＡＮＧＨꎬｅｔａｌ.Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｏｆｍｕｌｔｉ￣ｇｅｎｅｋｎｏｃｋｏｕｔｒａｂｂｉｔｓｕｓｉｎｇｔｈｅＣａｓ９/ｇＲＮＡｓｙｓｔｅｍ[Ｊ].ＣｅｌｌＲｅ￣ｇｅｎꎬ２０１４ꎬ３(１):１２.[１４]㊀ＢＡＳＳＥＴＴＡＲꎬＬＩＵＪＬ.ＣＲＩＳＰＲ/Ｃａｓ９ａｎｄｇｅｎｏｍｅｅｄｉｔｉｎｇｉｎＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ[Ｊ].ＪＧｅｎｅｔＧｅｎｏｍｉｃｓꎬ２０１４ꎬ４１(１):７￣１９. [１５]㊀ＣｈＡＮＧＮＮꎬＳＵＮＣＨꎬＧＡＯＬꎬｅｔａｌ.ＧｅｎｏｍｅｅｄｉｔｉｎｇｗｉｔｈＲＮＡ￣ｇｕｉｄｅｄＣａｓ９ｎｕｃｌｅａｓｅｉｎｚｅｂｒａｆｉｓｈｅｍｂｒｙｏｓ[Ｊ].ＥｄｉｔｉｎｇＣｅｌｌＲｅｓꎬ２０１３ꎬ２３(４):４６５￣４７２.[１６]㊀ＨＲＵＳＣＨＡＡꎬＳＣＨＭＩＤＢ.ＧｅｎｅｒａｔｉｏｎｏｆｚｅｂｒａｆｉｓｈｍｏｄｅｌｓｂｙＣＲＩＳＰＲ/Ｃａｓ９ｇｅｎｏｍｅｅｄｉｔｉｎｇ[Ｊ].ＭｅｔｈｏｄｓＭｏｌＢｉｏｌꎬ２０１５ꎬ１２５４:３４１￣３５０.[１７]㊀ＧＩＬＢＥＲＴＬＡꎬＬＡＲＳＯＮＭＨꎬＭＯＲＳＵＴＬꎬｅｔａｌ.ＣＲＩＳＰＲ￣ｍｅｄｉａｔｅｄｍｏｄｕｌａｒＲＮＡ￣ｇｕｉｄｅｄｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｉｎｅｕ￣ｋａｒｙｏｔｅｓ[Ｊ].Ｃｅｌｌꎬ２０１３ꎬ１５４:４４２￣４５１.[１８]㊀ＵＣＨＩＤＡＤꎬＹＡＭＡＳＨＩＴＡＭꎬＫＩＴＡＮＯＴꎬｅｔａｌ.Ｏｏｃｙｔｅａｐ￣ｏｐｔｏｓｉｓｄｕｒｉｎｇｔｈｅｔｒａｎｓｉｔｉｏｎｆｒｏｍｏｖａｒｙ￣ｌｉｋｅｔｉｓｓｕｅｔｏｔｅｓｔｅｓｄｕｒ￣ｉｎｇｓｅｘｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｏｆｊｕｖｅｎｉｌｅｚｅｂｒａｆｉｓｈ[Ｊ].ＪｏｕｒｎａｌｏｆＥｘ￣ｐｅｒｉｍｅｎｔａｌＢｉｏｌｏｇｙꎬ２００２ꎬ２０５(６):７１１￣７１８.[１９]㊀ＣＨＩＡＮＧＥꎬＹＡＮＹꎬＧＵＩＧＵＥＮＹꎬｅｔａｌ.ＴｗｏＣｙｐ１９(Ｐ４５０ａｒｏｍａｔａｓｅ)ｇｅｎｅｓｏｎｄｕｐｌｉｃａｔｅｄｚｅｂｒａｆｉｓｈｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓａｒｅｅｘ￣ｐｒｅｓｓｅｄｉｎｏｖａｒｙｏｒｂｒａｉｎ[Ｊ].ＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙａｎｄＥｖｏｌｕｔｉｏｎꎬ２００１ꎬ１８(４):５４２￣５５０.[２０]㊀ＶＯＮＨＯＦＳＴＥＮＪꎬＬＳＳＯＮＰ.Ｚｅｂｒａｆｉｓｈｓｅｘｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎａｎｄｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ:ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔｏｆＦＴＺ￣Ｆ１ｇｅｎｅｓ[Ｊ].Ｒｅｐｒｏｄｕｃ￣ｔｉｖｅＢｉｏｌｏｇｙａｎｄＥｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙꎬ２００５ꎬ３(１):１￣１１.９５２第３期㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀尹丽阳等:利用ＣＲＩＳＰＲ/Ｃａｓ９技术建立斑马鱼Ａｓｂ１１基因敲除品系㊀㊀㊀。
CRISPRCas9基因敲入试验步骤(三)donor载体构建载体构建
CRISPRCas9基因敲入试验步骤（三）donor载体构建载体构建1、质粒骨架的选择CRISPR/Cas9质粒按编辑细胞类型可分为八种，Mammalian 、Bacteria 、Drosophila 、Plant、C. elegans 、Yeast 、Zebrafish 、Xenopus，根据质粒所携带的编辑基因的不同，可分为野生型的cas9、突变型的cas9、cpf1、C2c2（可剪切RNA）。
当然，还有一些筛选标记，如puro、GFP、RFP、mcherry、潮霉素等等，我们可以根据自己的需求选择自己合适的质粒。
这里故意还掉了一种，最具有争议的Ngago，本楼主也重复过这个试验，也和大多数重复的人一样，GFP验证试验时，看到荧光显著减弱（本人还特意构建了一种Ngago载体，效果比韩老师的效果好很多），但是当时没有验证这个减弱是切割还是敲低，非常遗憾自己想法太简单，以先入为主认为是切割而没有去验证；最终结果是刘东老师使用Ngago发现了有表型（斑马鱼的眼睛上有缺陷），这个就是很强的提示，需要去做下一步，尽管基因组上没有被切割，有表型，那势必会去看该基因表达的数据，最后才有这篇文章。
刘东老师运气也很好，knock down 有表型，如果没表型，估计也会放弃。
这里就说到这，有不懂的可以留言询问。
具体分类在addgene上有，网址/。
2、酶切位点的选择插入sgRNA的酶切位点，质粒基本为这两种，BsmbI和Bbsi，具体可以参见该质粒的protocol，后续的连接、转化、验证protocol里面有，我就不啰嗦了。
哦还忘了一件事，使用snapgene这个软件可以很好地看质粒图谱，非常方便，强烈推荐！！以慢病毒载体V2为例具体说明3、同源臂的设计同源臂我们一般都是在切割位点的两端各选一段，长度大约1kb-2kb，效率还可以。
当然了，有人也用40-100bp做了也做成功了，但基本原则是越长效率越高。
1kb-2kb效率已经很高，所以这个最合适。
cas9基因敲除细胞流程
cas9基因敲除细胞流程CAS9基因敲除技术是细胞生物学中常用的一种基因编辑技术，可用于精准剪切靶向基因，从而实现对特定基因的敲除或修饰。
本文将介绍CAS9基因敲除细胞流程，包括以下五个步骤。
1.选择合适的敲除靶点首先需要在目标基因中选择一段合适的sgRNA序列，来指导Cas9蛋白靶向至相应的DNA双链断裂位置。
通常情况下，sgRNA序列应包含特定的NGG序列（Crispr引物序列），由于这部分序列在各种生物中存在，可以在相应的网站查询并选择。
2.购买合适的Cas9蛋白为了使用CAS9基因敲除技术，需要购买合适的Cas9蛋白。
Cas9是从Streptococcus pyogenes获得的一种蛋白质，可与传递进入靶向细胞的sgRNA结合，从而实现基因组定点编辑。
目前市面上有多种类型的Cas9产品，一般由公司提供。
3.转染敲除人细胞将Cas9蛋白质和sgRNA引物一起转染进入目标细胞中。
转染可以采用多种方法，如化学法、脂质体转染法、电穿孔法等。
转染后需要对转染后的细胞进行筛选，可通过PCR、Western blot等多种方法进行检测。
4.筛选敲除细胞用各种方法对转染后的细胞进行筛选和鉴定，以确定哪些细胞的目标基因已经被成功敲除。
目前，流行的技术包括PCR鉴定、TIDE分析、Sanger测序、RNA干扰等。
此外，还可以通过克隆并扩增单克隆细胞来检测基因敲除效果。
5.验证敲除效果最后，还需要验证基因敲除效果，以确保目标基因已经成功的被敲除。
这可以通过多种方法实现，如Western blot、免疫印迹、实时荧光聚合酶链反应等。
如果基因敲除效果良好，将有助于揭示目标基因的生理和病理功能，进而为相关疾病的治疗提供参考和指导。
总之，CAS9基因敲除细胞是一种常用的细胞生物学技术，可用于对靶向基因进行高效的基因组编辑。
通过合理的实验设计和筛选方法，可以得到有效的基因敲除和验证，为相关疾病的治疗提供了重要的基础。
CRISPRCas9基因删除操作步骤及详细说明
CRISPRCas9基因删除操作步骤及详细说明1. 简介CRISPR-Cas9是一种革命性的基因编辑技术，可以精确地修改和删除DNA序列。
本文档将详细介绍基因删除操作的步骤和相关说明。
2. 操作步骤步骤一：设计CRISPR引物- 根据目标基因序列设计CRISPR引物，引物应能够与目标基因准确结合，以便Cas9酶与目标基因形成复合物。
- 引物的设计应考虑到目标基因的特异性和目标区域的一致性。
步骤二：合成sgRNA- 合成单导RNA（sgRNA）用于将Cas9酶引导到目标基因上。
sgRNA通常由两部分组成：CRISPR RNA（crRNA）序列和转导RNA（tracrRNA）序列。
- 将两部分RNA序列合成并连接，形成sgRNA。
步骤三：合成Cas9蛋白- 合成Cas9蛋白，可以通过表达Cas9基因或在细胞外进行蛋白表达来获得Cas9蛋白。
- 确保合成的Cas9蛋白具有高活性，以确保其在基因编辑中的有效性。
步骤四：转染CRISPR-Cas9系统- 将合成的sgRNA和Cas9蛋白转染到目标细胞中。
- 转染方法可以根据目标细胞类型选择合适的方法，如细胞病毒转染、电穿孔或化学转染等。
步骤五：靶向基因编辑- Cas9蛋白与sgRNA形成复合物，定位到目标基因的特定位点。
- Cas9蛋白通过识别特定位点上的核酸序列，引导其内部的核酸酶活性，切割目标基因的DNA序列。
- 当DNA序列被切割后，细胞的自修复系统会介入修复切割部位，导致目标基因发生缺失或错义突变。
步骤六：验证基因删除- 使用PCR或DNA测序等方法验证基因删除是否成功。
- 可以设计引物来扩增目标基因的特定区域，然后通过测序检测目标基因序列的变化。
3. 注意事项- 在进行CRISPRCas9基因删除前，需充分了解目标基因的功能和相关影响。
- 确保所有实验操作符合生物安全和伦理要求。
- 结果分析时，注意排除非特异性效应和离靶效应。
以上是CRISPRCas9基因删除的操作步骤及详细说明。
CRISPRCas9系统在斑马鱼基因编辑研究中的应用
CRISPR/Cas9系统在斑马鱼基因编辑研究中的应用随着斑马鱼(Danio rerio)基因组测序工作的完成,研究人员发现斑马鱼与人类(Homo sapiens)基因同源性较高,针对这一特点,研究人员构建了多种人类疾病的斑马鱼模型,用于探究疾病发生机制。
基因编辑技术的应用促进了斑马鱼基因功能研究的发展,先进的基因编辑技术CRISPR/Cas9系统,因其简单高效正广泛被应用。
本研究利用CRISPR/Cas9系统敲除斑马鱼lncRNA基因启动子区以及将dCas9基因敲入斑马鱼基因组。
本文主要的研究内容如下：1、为了研究Nondret002679在斑马鱼胚胎各时期以及成年后各组织中的表达规律,首先收集0 hpf(合子期)、3 hpf(囊胚期)、6 hpf(原肠期)、12hpf(体节期/5-体节)、24hpf(咽囊期)及48hpf(孵化期)的斑马鱼胚胎提取总RNA,逆转录为cDNA,采用荧光定量PCR (RT-qPCR)方法检测Nondmt002679的表达规律。
同时收集成年斑马鱼的心脏、肝脏、睾丸、卵巢、肌肉、尾鳍7组织样,同样采用RT-qPCR方法检测Nondret002679的表达规律。
结果显示,24 h时Nondret002679表达量是O h的457倍(p<0.01),48 h时是O h的1066倍(p<0.01),前4时期Nondret002679的表达无差异(p>0.05)。
Nondret002679在大脑中高表达,是心脏的248倍,(p<0.01),其他组织与心脏相比表达量增加,但差异不显著(p>0.05),因此表现出组织特异性。
这些结果为进一步研究Nondret002679的生物学功能提供依据。
2、利用CRISPR/Cas9系统敲除Nondret002679基因的预测启动子区以沉默其表达。
首先根据预测启动子区上下游序列设计靶向不同位点的向导RNA(guide RNA) gR1、 gR2、 gR3、 gR4、 gR5和：gR6 gRNA。
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1、gRNA模板扩增：（以gRNA质粒为模板，扩增片段大小为100bp多）
40ul体系，利用保真性>= Extaq的酶扩增4管；
可以通过胶回收纯化扩增模板（四管过同一个回收柱子），或通过沉淀纯化（附件1）;
沉淀回收模板前，要进行利用5ul电泳检测是否扩增出目的条带；
以上模板皆用20ul DEPC水回溶(,反复洗柱子两次)。
2、gRNA合成：
10ul
反应温度37
3、gRNA纯化
a.加入1ul DNase I，37℃处理15min；
b.加入1ul 0.5 M EDTA 8.0，65℃处理10min；
c.加入57.5ul DEPC water 和 7.5ul 3M sodium Acetate solution(pH 5.2);
d.加入等体积（即77ul）酚氯仿（1:1 mix）；12000rpm，15min；
e.吸取上部水相到新的PCR-tube，加入等体积氯仿，12000rpm，15min；
f.重复操作e；
g.收集水相到new-PCR-tube，加入2倍体积无水乙醇；-20℃沉淀至少30min；
h.12000rpm，15min，去除液体，留下白色gRNA沉淀；
i.70%乙醇洗3次（每次12000rpm，6min）；
j.去除70%，自然干燥，10-20ul DEPC water溶解；-80℃保存。
注意：以上为RNA操作，请使用灭菌未开封的tips and tubes，尽量不说话，避免RNA酶污染。
以上合成与纯化过程为KIT说明书翻译得到，如使用与本实验室不同KIT，请阅读相关说明书。
4、Cas9 template 准备（酶切4h，40ul体系）
将zf-cas9-vector 线性化，即XbaI 单酶切；酶切2 tube，2.3或2.5ug/tube；过同一个胶回收柱子；20ul DEPC water 回溶，洗涤柱子两边，-20℃保存。
5、cas9-mRNA 合成
20ul
反应温度37℃，时间4.5h。
纯化：
A．加入1ul DNase I，37℃处理15min；
B．20ul反应体系，加入30ul LiCl；
C．冰浴或-20℃沉淀至少30min；
D．4℃,12000rpm,15min;
E．100ul 70%乙醇洗2次（每次12000rpm，6min）；
F．10ul DEPC water溶解；-80℃保存。
注意：RNA样品根据每次用量的多少分装保存，避免反复冻融，降解。
一般1ul/tube保存。
6、 斑马鱼注射：
利用混合好的cas9与gRNA 样品注射（混合后终浓度分别为300ng/ul 和 20ng/ul, 如果注射效果不佳，可自行提高混合比例再次注射，最好不要超过500ng/ul 和80ng/ul ） 7、 F0注射胚胎检测
准备：50mM NaOH 、1 M Tris-HCl PH8.0；30% PAGE ；5XTBE ；10%APS ； 5X TBE
12% PAGE-gel ：（两块）
说明：其他所需溶液请自行查询《分子克隆》的配方。
8、 基因组提取及PCR
a. 8 embryos/Tube ，加入80ul 50mM NaOH ，95℃，40min ；（可取3-5tubes ）
b. 加入1/10体积 1 M Tris-HCl PH8.0；mix well ，3000rpm ，5min ；
c. 取1ul 作为template ，PCR 扩增包含靶位点的基因片段；
d. 加6xloading buffer ，run 12% PAGE-gel ；、
e. EB 染色，凝胶成像仪拍照看条带结果；
f. 如果条带与WT 存在差异，则说明敲除有效果； 9、 养鱼
将test 有效果的靶位点对应的F0代斑马鱼饲养起来； 10、筛鱼
a.将成熟的F0代斑马鱼与WT mate ，取其发育24h 的胚胎test ，方法同8；
b.将test 有效果的靶位点对应的F1代斑马鱼饲养起来； c ．1个月大的幼鱼，剪尾鳍提基因组逐条test ；（如图）
11、测序
PCR 产物(胶块)直接测序；T-clone 直接菌液测序；前者读峰图获得结果后者与标准序列blast 获得；具体如下例：（在标准序列上找到套峰之前的序列，读出套峰处的碱基，重叠套峰上下写，最后将套峰处标准序列（序列1）找到，其他碱基组合即为序列2；比较后得出碱基缺失情况。
）T-clone sequence 获得单一序列（有野生型sequence 及mutant sequence ，与网上序列blast 后，有碱基缺失的即为突变情况）
12、后续筛鱼及传代（标准程序）
A:F0 X WT F1 B: F1 X WT F2
C:F2 X WT F3 D:F3 X F3 观察表型
注：step 12的传代都是要通过剪尾鳍test传代的。