EMS诱变技术及其在创造玉米新种质中的应用

合集下载

EMS诱变技术研究进展

于糖苷键断裂造成脱嘌呤，原来鸟嘌呤的位置成了一个空位，ＤＮＡ分子在进一步复制时，４种碱基都有可能进入其互补位置上，从而造成ＤＮＡ的突
３ＥＭＳ诱变子技术
２ＥＭＳ诱变育种的关键技术
ＥＭＳ诱变具有操作简单、突变频率高、突变专
一
性与多效性等优点。ＥＭＳ诱变育种成败的关键
技术有：（１）采取适当的诱变剂量＿３ｊ。ＥＭＳ处理材料时采用适宜的诱变剂量以便达到较多的变异，减少植株的损伤。通常在诱变过程中使用对材料造成半
生高密度的系列等位基因点突变。在当前种质资源
库新基因极为缺乏，遗传资源日益枯竭的状况下，
采用ＥＭＳ诱发突变技术创造有用基因具有重要意
义［１】ｃ
致死效应的剂量作为诱变的最适剂量，还可设置诱变剂浓度梯度和时间梯度来筛选出最佳组合。（２）对突变体库采取适当的技术筛选。目前通常多采用利用表型鉴定筛选、生物技术＿４（如定向诱导基因
是发生转换型的突变。烷化的鸟嘌呤不再与胞
嘧啶配对而与胸腺嘧啶配对，从而造成ＧＣ碱基
对变为Ａ＝Ｔ碱基对，ＥＭＳ诱变大部分为这种情况；二是发生置换型突变。烷基活化的鸟嘌呤，由
湖南农业科学２０１３，（０５）：７￣９，１３

玉米EMS诱变后代变化趋势的研究

ＴｅｆｃｓｏＭＳｏｅｄｕｒｉｎｏｔｎｆｅｅｎｔｅｍｅｄｄｆｒｎａｉｕａｅｉｓ『ｏｃｕｉｎｅｅｅｔｆｎｕｉｇｍａｚｈｆｔｆｅｅＥｎｓｅｓｔｔａｃｎｅｔｗｒｏｂａｄａｉｅｅｔｎｖｒｓｖｒｔ。Ｃｎｌｓｏ１ｆｃｏｄｃｎｉｅｎｉｏｌｏＭ３ｎｆｉｏｉｅｈＴｆｉ
维普资讯
安徽农业科学，ｕａｏＡｈｉ。ｃ２０，５２）８４— １４ＪｒｌｆｎｕＡＳｉ０７３（６：１３８４ｏｎ。
责任编辑张杨林责任校对王淼
玉米ＥＭＳ诱变后代变化趋势的研究
焦杨，陈志斌沈农大农院辽沈１６０１
摘要『目的１了研究玉米ＥＳ诱变后代的变化趋势，为Ｍ以期得到有益变异和创造新的玉米种质。法］取５种玉米自交系（４、【方选３０２４、１、３、００为供试诱变亲本，Ｅ一蜡油溶液为诱变剂，接对花粉诱变得到诱变后代，究Ｍ、２的农艺性状与３５Ｋ２１６９１）以ＭＳ石直研Ｍ代Ｍ代种子的品质性状，分析诱变后代的变化趋势。结果１【各品种畸变率随ＥＳＭ浓度增加而变大。代的出苗率和成株率明显低于对Ｍ。照，，百粒重明显低于对照，Ｍ代出苗率和成株率比Ｍ代高，比对照低。Ｍ但ＥＳ对Ｍ代种子营养含量的影响是非定向的，品种的对各影响不同。结论１Ｅ诱变玉米花粉效果显著，于诱变后代的生理损伤和遗传性状的改变很大，是不同材料对于ＥＳ的敏感『用ＭＳ对但Ｍ

EMS在作物育种应用中的研究进展

EMS在作物育种应用中的研究进展甲基磺酸乙酯(简称EMS), 是一种改变DNA 结构烷化剂, 对生物系统作用的重点主要是核酸, 对修复酶的钝化也有一定的作用,它与DNA 中的磷酸嘌呤、嘧啶作用, 使之突变。

烷化剂甲基磺酸乙酯为植物最有效的化学诱变剂之一 , 自从1953年, KLMARK首次报告了EMS 对突变诱导的有效性以来,目前已被广泛应用于农作物诱变育种, 现已育成了2 250 个品种, 主要有水稻、小麦、大麦和大豆.二、水稻类病斑突变体的初步研究根据类病斑出现的生长阶段,通常将类病斑突变体分为全生育期型、营养生长阶段起始型和生殖生长阶段起始型3种。

四、水稻斑点叶变异研究进展可遗传的变异是水稻进化的基础,通过变异水稻发生一系列肉眼可见或不可见的变化。

水稻斑点叶( spottedleaf) 属于肉眼可见的叶片形态变异,发生变异的叶片上产生色泽、形状和大小不同的斑点,在有些突变体中斑点还会出现在叶鞘、枝梗和谷壳。

这种斑点的发生是在没有明显逆境、机械和农药损伤或者病原菌侵染的条件下,由植物体自发形成的,大多数情况下与无毒病原菌侵染时产生的病斑相似。

由于斑点的颜色多为褐色,类似于水稻胡麻斑病和稻瘟病,许多学者又称之为类病变或类病斑(lesion mimic , lesion simulating disease) 。

之所以划分为起始型和扩散型两类,是因为认为植物中存在激发和抑制程序性细胞死亡(programmed cell death , PCD) 两种途径。

很多时候斑点叶突变体又被称为类病斑突变体(lesion mimic mutant) ,因为他们共同的特征是斑点部位的细胞坏死,这种坏死斑与植物过敏性反应( hy per sensitive response , HR) 形成的病斑非常相似。

有些突变体的斑点受到温度和光照等环境因子的影响,例如,水稻突变体s pl7的斑点在高温和太阳光下表达,而Oslsd1 在低温和短日照条件下表达。

利用花粉化学诱变创造玉米自交系的研究

利用花粉化学诱变创造玉米自交系的研究薛守旺周洪生 (中国农业科学院作物育种栽培研究所　北京　100081)收稿日期:1998-09-22 提要　本研究以甲基磺酸乙酯(EMS )作诱变剂,用轻质石蜡油作载体,诱变6个稳定自交系的成熟花粉,结果得到中自01浅黄粒突变体、母株发芽突变体和粒顶凹陷突变体;CN 15粉质高赖氨酸突变体;多黄22显性核不育突变体和近等基因系su 1su 1型甜玉米。

研究表明,用EM S-石蜡油诱变成熟的玉米花粉能产生较高频率的突变。

该方法操作简便、经济实用,是创造特用玉米的重要手段。

关键词　玉米花粉;化学诱变;EM S 作物化学诱变育种是利用化学诱变剂诱发作物发生突变,再通过多世代选择和鉴定,直接或间接地培育生产上能利用的农作物新品种。

用化学诱变剂处理作物不同器官有不同的诱变效果。

在化学诱变育种中常用种子作处理对象,因为处理种子比较简便。

但种子是多细胞组织,在突变发生过程中容易产生细胞间的竞争,使突变细胞受到抑制或消亡,并且产生的突变性状以嵌合体的形式出现,很难获得稳定的突变个体。

处理花药、合子或配子不仅能排除突变细胞被淘汰的可能性,而且它们对化学诱变剂较敏感,诱变频率高。

但直接用药剂处理,剂量太大,花粉难成活。

以水溶液处理花粉,花粉吸水胀破死亡。

Co e(1966)[1]发现成熟玉米花粉能在液体石蜡油中保存几个小时仍有授精能力。

Neuffer (1968)[2]将此发现加以引伸,把石蜡油作为化学诱变剂的载体处理玉米花粉,获得成功。

在众多的化诱剂中,EM S 被认为是目前最好的诱变剂[4],它直接作用于DNA 鸟嘌呤部分引起点突变及染色体损伤(Scaler a,1971)。

Neuffer (1978)利用EM S-石蜡油处理玉米花粉,获得种种突变。

并且诱变效果远远高于电离辐射和自发突变[3]。

因此,该技术是目前公认的最有效的诱变方法[5]。

具有特殊性状和特殊用途的特用玉米如糯玉米、甜玉米、高直链淀粉玉米等具有较高的经济价值、营养价值和加工利用价值。

EMS_诱变创制水稻抗乙酰辅酶A_羧化酶抑制剂类除草剂种质

江苏农业学报(ＪｉａｎｇｓｕＪ.ｏｆＡｇｒ.Ｓｃｉ.)ꎬ２０２３ꎬ３９(２):３０５￣３１２ｈｔｔｐ://ｊｓｎｙｘｂ.ｊａａｓ.ａｃ.ｃｎ江㊀群ꎬ凌溪铁ꎬ唐兆成ꎬ等.ＥＭＳ诱变创制水稻抗乙酰辅酶Ａ羧化酶抑制剂类除草剂种质[Ｊ].江苏农业学报ꎬ２０２３ꎬ３９(２):３０５￣３１２.ｄｏｉ:１０.３９６９/ｊ.ｉｓｓｎ.１０００￣４４４０.２０２３.０２.００１ＥＭＳ诱变创制水稻抗乙酰辅酶Ａ羧化酶抑制剂类除草剂种质江㊀群１ꎬ㊀凌溪铁２ꎬ㊀唐兆成２ꎬ㊀周珍珍２ꎬ㊀张保龙１ꎬ２(１.海南大学热带作物学院/三亚南繁研究院ꎬ海南海口５７０２２８ꎻ２.江苏省农业科学院种质资源与生物技术研究所/江苏省农业生物学重点实验室ꎬ江苏南京２１００１４)收稿日期:２０２２￣１１￣２５基金项目:江苏省农业科技自主创新基金项目[ＣＸ(２１)２０４１]作者简介:江㊀群(１９９８－)ꎬ女ꎬ四川宜宾人ꎬ硕士研究生ꎬ主要从事水稻抗除草剂育种研究ꎮ(Ｅ￣ｍａｉｌ)１６９２５７９２６４＠ｑｑ.ｃｏｍ通讯作者:张保龙ꎬ(Ｅ￣ｍａｉｌ)ｚｈｂｌ２２４８＠ｈｏｔｍａｉｌ.ｃｏｍꎻ周珍珍ꎬ(Ｅ￣ｍａｉｌ)ｚｈｅｎｚｈｅｎｚｈｏｕｎｊ＠１６３.ｃｏｍ㊀㊀摘要:㊀创制非转基因抗除草剂水稻种质资源对于稻田杂草防控具有重要价值ꎮ本研究以甲基磺酸乙酯(ＥＭＳ)水溶液诱变镇糯１９水稻种子ꎬ获得１株能稳定遗传的可耐受乙酰辅酶Ａ羧化酶(ＡＣＣａｓｅ)抑制剂类除草剂高效盖草能的Ｍ３代水稻幼苗(突变体)ꎮ分别扩增镇糯１９野生型和突变体的基因组ＤＮＡ并进行测序和序列比对ꎬ发现突变体ＡＣＣａｓｅ基因的开放阅读框(ＯＲＦ)的第５３７４位碱基发生了点突变ꎬ导致编码的第１７９２位氨基酸由异亮氨酸突变为亮氨酸ꎮ镇糯１９野生型和突变体分蘖盛期大田喷施３种田间推荐剂量的ＡＣＣａｓｅ抑制剂类除草剂后农艺性状调查结果表明突变体对高效盖草能㊁精喹禾灵和唑啉草酯抗性明显高于野生型ꎮ本研究获得了能稳定遗传的非转基因抗ＡＣ￣Ｃａｓｅ抑制剂类水稻新种质ꎬ具有一定的应用价值ꎬ为抗除草剂水稻育种提供了种质资源ꎮ关键词:㊀水稻ꎻ抗除草剂种质ꎻ甲基磺酸乙酯(ＥＭＳ)ꎻ乙酰辅酶Ａ羧化酶中图分类号:㊀Ｓ３３５.３㊀㊀㊀文献标识码:㊀Ａ㊀㊀㊀文章编号:㊀１０００￣４４４０(２０２３)０２￣０３０５￣０８ＥＭＳｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓｔｏｃｒｅａｔｅｒｉｃｅａｎｔｉ￣ａｃｅｔｙｌ￣ＣｏＡｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅｉｎｈｉｂｉｔｏｒ￣ｈｅｒ￣ｂｉｃｉｄｅｇｅｒｍｐｌａｓｍＪＩＡＮＧＱｕｎ１ꎬ㊀ＬＩＮＧＸｉ￣ｔｉｅ２ꎬ㊀ＴＡＮＧＺｈａｏ￣ｃｈｅｎｇ２ꎬ㊀ＺＨＯＵＺｈｅｎ￣ｚｈｅｎ２ꎬ㊀ＺＨＡＮＧＢａｏ￣ｌｏｎｇ１ꎬ２(１.ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＴｒｏｐｉｃａｌＣｒｏｐｓ/ＳａｎｙａＮａｎｆａｎＲｅｓｅａｒｃｈＩｎｓｔｉｔｕｔｅꎬＨａｉｎａｎＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬＨａｉｋｏｕ５７０２２８ꎬＣｈｉｎａꎻ２.ＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＧｅｒｍｐｌａｓｍＲｅｓｏｕｒｃｅｓａｎｄＢｉｏ￣ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ/ＰｒｏｖｉｎｃｉａｌＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＡｇｒｏｂｉｏｌｏｇｙꎬＪｉａｎｇｓｕＡｃａｄｅｍｙｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅｓꎬＮａｎｊｉｎｇ２１００１４ꎬＣｈｉｎａ)㊀㊀Ａｂｓｔｒａｃｔ:㊀Ｃｕｌｔｉｖａｔｉｎｇｎｏｎ￣ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｈｅｒｂｉｃｉｄｅ￣ｒｅｓｉｓｔａｎｔｒｉｃｅｇｅｒｍｐｌａｓｍｒｅｓｏｕｒｃｅｓｉｓｏｆｇｒｅａｔｖａｌｕｅｆｏｒｗｅｅｄｃｏｎｔｒｏｌｉｎｒｉｃｅｆｉｅｌｄｓ.ＩｎｔｈｉｓｓｔｕｄｙꎬＺｈｅｎｎｕｏ１９ｒｉｃｅｓｅｅｄｓｗｅｒｅｍｕｔａｇｅｎｉｚｅｄｂｙｅｔｈｙｌｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｏｎａｔｅ(ＥＭＳ)ｓｏｌｕｔｉｏｎꎬａｎｄａＭ３ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｏｆｒｉｃｅｓｅｅｄｌｉｎｇｓｗｉｔｈｓｔａｂｌｅｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅａｎｄｔｏｌｅｒａｎｃｅｔｏａｃｅｔｙｌ￣ＣｏＡｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ(ＡＣＣａｓｅ)ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｈｅｒｂｉｃｉｄｅｓｗｅｒｅｏｂｔａｉｎｅｄ.ＴｈｅｇｅｎｏｍｉｃＤＮＡｓｏｆｗｉｌｄ￣ｔｙｐｅａｎｄｔｈｅｍｕｔａｎｔｗｅｒｅａｍｐｌｉｆｉｅｄａｎｄｓｅｑｕｅｎｃｅｄｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ.Ｉｔｗａｓｆｏｕｎｄｔｈａｔｔｈｅｒｅｗａｓａｐｏｉｎｔｍｕｔａｔｉｏｎａｔｔｈｅ５３７４ｔｈｂａｓｅｏｆｔｈｅｏｐｅｎｒｅａｄｉｎｇｆｒａｍｅｏｆｔｈｅｒｅｓｉｓｔａｎｔｒｉｃｅＡＣＣａｓｅｇｅｎｅꎬｒｅｓｕｌｔｉｎｇｉｎａｍｕｔａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｅｎｃｏｄｅｄ１７９２ｔｈａｍｉｎｏａｃｉｄｆｒｏｍｉｓｏｌｅｕｃｉｎｅｔｏｌｅｕｃｉｎｅ.ＴｈｒｅｅｋｉｎｄｓｏｆＡＣＣａｓｅｉｎｈｉｂｉｔｏｒｈｅｒｂｉｃｉｄｅｓｗｅｒｅｓｐｒａｙｅｄｉｎｔｈｅｆｉｅｌｄａｎｄｔｈｅａｇｒｏｎｏｍｉｃｔｒａｉｔｓｗｅｒｅａｎａｌｙｚｅｄ.Ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｏｆｔｈｅｍｕｔａｎｔｔｏｈａｌｏｘｙ￣ｆｏｐ￣Ｒ￣ｍｅｔｈｙｌꎬｑｕｉｚａｌｏｆｏｐ￣Ｐ￣ｅｔｈｙｌａｎｄｐｉｎｏｘａｄｅｎｗａｓｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｈｉｇｈｅｒｔｈａｎｔｈａｔｏｆｗｉｌｄｔｙｐｅ.Ｉｎｔｈｉｓｓｔｕｄｙꎬａｎｅｗｎｏｎ￣ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｒｉｃｅｇｅｒｍｐｌａｓｍｗｉｔｈＡＣＣａｓｅｉｎｈｉｂｉｔｏｒｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｗａｓｏｂｔａｉｎｅｄꎬｗｈｉｃｈｈａｄｃｅｒｔａｉｎａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｖａｌｕｅａｎｄｃｏｕｌｄｐｒｏｖｉｄｅｇｅｒｍｐｌａｓｍｒｅｓｏｕｒｃｅｓｆｏｒｈｅｒｂｉｃｉｄｅ￣ｒｅｓｉｓｔａｎｔｒｉｃｅｂｒｅｅｄｉｎｇ.Ｋｅｙｗｏｒｄｓ:㊀ｒｉｃｅꎻｈｅｒｂｉｃｉｄｅ￣ｒｅｓｉｓｔａｎｔｇｅｒｍｐｌａｓｍꎻｅｔｈｙｌｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｏｎａｔｅ(ＥＭＳ)ꎻａｃｅｔｙｌＣｏＡｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ５０３㊀㊀水稻是中国三大粮食作物之一ꎬ培育高产稳产的优质水稻是解决粮食问题的关键ꎮ稻田杂草严重影响水稻的产量和品质ꎬ杂草导致中国稻谷每年亏损率超过１５％ꎬ部分地区甚至超过５０％[１]ꎮ化学除草是当今世界使用最多的稻田除草方法ꎮ然而ꎬ过度使用除草剂不仅会导致杂草对除草剂产生抗性ꎬ还会对作物产生药害㊁降低水稻产量和品质ꎬ严重时甚至造成水稻颗粒无收[２]ꎮ因此ꎬ培育抗除草剂的水稻品种可以经济有效地解决稻田的杂草防除问题ꎮ乙酰辅酶Ａ羧化酶(ＡＣＣａｓｅ)是植物初级代谢中脂肪酸合成的关键酶之一ꎬ其主要功能是将乙酰辅酶Ａ羧化为丙二酰辅酶Ａꎮ该反应是脂肪酸合成的第一步ꎬ也是限速的关键步骤[３]ꎮ脂肪酸不仅是功能物质甘油三脂的组成成分ꎬ还能转化为作为细胞膜组成成分的磷脂[４]ꎮ自１９５８年发现乙酰辅酶Ａ羧化酶可作为除草剂的作用靶标后ꎬ针对该靶标已开发了三大类除草剂并商品化应用ꎬ分别是芳氧苯氧基丙酸酯类(ＡＰＰ)[５]㊁环己烯酮类(ＣＨＤ)[６]和新苯基吡唑啉类(ＤＥＮ)[７￣８]ꎮ其中ꎬＡＰＰ类除草剂包括高效氟吡甲禾灵(Ｈａｌｏｘｙｆｏｐ￣Ｒ￣ｍｅｔｈｙｌꎬ又称高效盖草能)㊁精喹禾灵(Ｑｕｉｚａｌｏｆｏｐ￣Ｐ￣ｅｔｈｙｌ)㊁精恶唑禾草灵(Ｆｅｎｏｘａｐｒｏｐ￣Ｐ￣ｅｔｈｙｌꎬ又称骠马)㊁恶唑酰草胺(Ｍｅｔａｍｉｆｏｐ)和氰氟草酯(Ｃｙｈａｌｏｆｏｐ￣ｂｕｔｙｌ)等ꎮＣＨＤ类除草剂包括烯禾啶(Ｓｅｔｈｏｘｙｄｉｍ)㊁噻草酮(Ｃｙ￣ｃｌｏｘｙｄｉｍ)和环苯草酮(Ｐｒｏｆｏｘｙｄｉｍ)等ꎻＤＥＮ类除草剂有唑啉草酯(Ｐｉｎｏｘａｄｅｎ)ꎮ乙酰辅酶Ａ羧化酶抑制剂类除草剂主要被用于控制禾本科杂草ꎬ具有高效㊁低毒㊁对后茬作物安全等特点[９]ꎮ目前ꎬ水稻生产中登记并许可使用的乙酰辅酶Ａ羧化酶抑制剂类除草剂仅有氰氟草酯㊁恶唑酰草胺和环苯草酮ꎬ这极大限制了水稻生产中杂草的防治ꎮ因此培育抗乙酰辅酶Ａ羧化酶抑制剂类除草剂水稻ꎬ不仅可以拓宽稻田除草剂的选择和使用范围ꎬ还可有效控制稻田杂草的发生与危害ꎮ化学诱变是培育和筛选抗性除草剂作物种质资源的重要方法ꎮＥＭＳ是非常有效且负面影响小的化学诱变剂ꎬ被广泛应用于构建优良性状的水稻突变体[１０￣１２]ꎮ顾佳清等利用ＥＭＳ处理粳稻品种中花１１ꎬ从诱变的水稻群体中筛选出高产的突变体ꎬ经过后代的纯化ꎬ得到了一个可以直接推广应用的水稻突变新品系申化一号[１３]ꎮ陈忠明等通过ＥＭＳ处理籼稻９３１１ꎬ筛选出了大粒的突变体Ｍ３１６和长穗突变体９３１１ｅＲ[１４￣１５]ꎮ本课题组用ＥＭＳ诱变处理包括９３１１在内的多个水稻品种ꎬ成功筛选到多个抗咪唑啉酮类除草剂的突变体ꎬ进一步鉴定结果表明突变均发生在编码乙酰乳酸合成酶(ＡＬＳ)靶标基因上[１６]ꎮ本研究通过ＥＭＳ诱变糯稻品种镇糯１９构建突变群体ꎬ用ＡＰＰ类除草剂高效盖草能去筛选诱变处理后的Ｍ２代幼苗ꎬ获得能稳定遗传的抗性植株ꎬ并对抗性植株的ＡＣＣａｓｅ基因位点突变㊁氨基酸序列变异进行鉴定ꎬ最后就３种不同ＡＣＣａｓｅ抑制剂类除草剂对获得的抗除草剂材料农艺性状影响进行分析ꎬ旨在为水稻抗除草剂育种提供依据和材料ꎮ１㊀材料与方法１.１㊀材料与试剂供试水稻材料镇糯１９由江苏丘陵地区镇江农业科学研究所提供ꎮ试验所用除草剂的种类及相关信息见表１ꎮ表１㊀本试验所用除草剂Ｔａｂｌｅ１㊀Ｈｅｒｂｉｃｉｄｅｓｕｓｅｄｉｎｔｈｉｓｓｔｕｄｙ名称㊀类别来源推荐田间施用剂量(ｇ/ｈｍ２ꎬａ.ｉ.)高效盖草能ＡＰＰ江苏中旗科技股份有限公司６４.８精喹禾灵ＡＰＰ天津中农立华农用化学品有限公司６０.０唑啉草酯ＤＥＮ瑞士先正达作物保护有限公司４５.０㊀㊀生物试剂甲基磺酸乙酯(ＥＭＳ)购自美国Ｓｉｇｍａ￣Ａｌｄｒｉｃｈ公司ꎬ２ˑＲａｐｉｄＴａｑＭａｓｔｅｒＭｉｘ㊁ＰｈａｎｔａＭａｘＳｕｐｅｒ￣ＦｉｄｅｌｉｔｙＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ聚合酶购自南京诺唯赞生物科技有限公司ꎬＣＴＡＢ购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司ꎮ１.２㊀镇糯１９水稻种子的ＥＭＳ诱变及抗ＡＣＣａｓｅ抑制剂类除草剂突变体的筛选㊀㊀镇糯１９种子(Ｍ１代)清水浸泡２ｈ后ꎬ用质量浓度５０ｍｇ/ｍｌ的ＥＭＳ水溶液浸种处理１４ｈꎬ硫代硫酸钠中和３０ｍｉｎ后ꎬ将种子捞出并用清水冲洗５~６遍ꎮ将诱变处理后的种子播种于大田ꎬＭ１代植株成熟后ꎬ种子混收(Ｍ２代)作为突变群体库ꎮ从突变群体库中取Ｍ２代种子播种于大棚苗床ꎬ待水稻幼苗长至３~４叶期时喷施６４８ｇ/ｈｍ２ꎬａ.ｉ.高效盖草６０３江苏农业学报㊀２０２３年第３９卷第２期能ꎬ施药后２１ｄ观察记录水稻表型并将正常生长的水稻苗移栽至盆钵内ꎬ单株收获种子得到突变体种子(Ｍ３代)ꎬＭ３代种子播种后得到Ｍ３代幼苗ꎮ１.３㊀抗除草剂突变体ＡＣＣａｓｅ基因的ＰＣＲ鉴定和碱基序列分析㊀㊀从国家水稻数据中心数据库(ｈｔｔｐｓ://ｗｗｗ.ｒｉｃｅ￣ｄａｔａ.ｃｎ/)获得水稻ＡＣＣａｓｅ基因(ＯｓＡＣＣꎬ序列号为ＬＯＣ＿Ｏｓ０５ｇ２２９４０)的碱基序列ꎮ根据ＯｓＡＣＣ基因的保守序列使用ＳｎａｐＧｅｎｅ６.０.２软件进行特异性引物设计ꎬ共设计了８对引物ꎬ分别是ＯｓＡＣＣ￣Ｆ１~Ｏｓ￣ＡＣＣ￣Ｆ８和ＯｓＡＣＣ￣Ｒ１~ＯｓＡＣＣ￣Ｒ８(表２)ꎮ表２㊀本试验所用引物Ｔａｂｌｅ２㊀Ｐｒｉｍｅｒｓｕｓｅｄｉｎｔｈｉｓｓｔｕｄｙ引物名称㊀序列(５ᶄң３ᶄ)ＰＣＲ产物长度(ｂｐ)ＯｓＡＣＣ￣Ｆ１ＧＴＣＡＧＡＴＴＴＣＡＣＡＣＡＴＣＴＧＧＧ１４２２ＯｓＡＣＣ￣Ｒ１ＣＡＧＧＧＧＣＡＣＡＡＡＴＡＡＴＧＴＡＣＴＯｓＡＣＣ￣Ｆ２ＡＡＡＡＡＧＣＴＧＣＧＴＧＡＡＧＴＡＴＧＣ１６１４ＯｓＡＣＣ￣Ｒ２ＴＣＴＣＧＡＣＴＧＴＧＡＡＧＴＧＣＴＧＣＯｓＡＣＣ￣Ｆ３ＣＣＣＴＡＴＴＧＡＡＧＡＣＡＴＣＣＴＧＡＴＴＧ１５９７ＯｓＡＣＣ￣Ｒ３ＡＡＣＡＧＡＡＡＴＧＧＣＡＴＧＡＴＧＧＡＯｓＡＣＣ￣Ｆ４ＣＡＡＡＣＧＴＡＧＡＣＴＡＣＡＣＡＧＴＴＧＡＣ１６４１ＯｓＡＣＣ￣Ｒ４ＴＧＴＴＴＧＧＣＡＣＣＡＴＴＡＴＧＡＧＡＡＯｓＡＣＣ￣Ｆ５ＴＴＧＡＣＡＡＧＧＴＡＡＡＣＡＴＣＡＴＧＴＣＣ１６３５ＯｓＡＣＣ￣Ｒ５ＡＡＡＡＧＧＴＣＡＴＴＧＡＡＡＡＡＴＴＣＡＣＧＯｓＡＣＣ￣Ｆ６ＴＣＴＡＴＣＣＡＡＡＴＣＣＴＧＣＴＧＣＣ１６３１ＯｓＡＣＣ￣Ｒ６ＡＡＴＧＧＣＣＡＧＴＴＣＴＡＡＴＴＧＣＧＯｓＡＣＣ￣Ｆ７ＡＧＴＴＴＴＣＴＴＣＧＧＧＣＣＡＧＡＴＴ１６３４ＯｓＡＣＣ￣Ｒ７ＧＧＣＴＧＧＴＣＡＡＧＡＣＧＣＴＧＴＡＴＯｓＡＣＣ￣Ｆ８ＣＡＴＧＧＡＡＧＴＧＣＴＧＣＴＡＴＴＧＣＣＡＧ１８６６ＯｓＡＣＣ￣Ｒ８ＣＡＧＡＣＴＴＧＣＡＣＴＴＴＣＡＴＣＴＧＧＣＡ㊀㊀采用ＣＴＡＢ法[１４]提取水稻的基因组ＤＮＡꎬ取Ｍ３代三叶一心期的叶片０５ｇ放在带有１颗小钢珠的２ｍｌ离心管中ꎬ放到液氮中冷冻至叶片组织变脆ꎬ再将离心管放到频率为６０Ｈｚ的组织研磨机研磨２ｍｉｎꎬ然后加入４００μｌＣＴＡＢ提取液ꎬ离心管６５ħ水浴３０ｍｉｎ后ꎬ在通风橱中加入４００μｌ氯仿ꎬ充分混匀至提取液呈乳绿色ꎬ１２０００ｒ/ｍｉｎ离心１０ｍｉｎꎬ在离心期间标记好管号ꎬ将６００μｌ无水乙醇加入到已经标记好的１５ｍｌ离心管中ꎬ移液枪吸取上清液３００μｌ加到已经准备好的离心管中ꎬ上下颠倒混匀再沉淀１ｈ以上ꎬ１２０００ｒ/ｍｉｎ离心１０ｍｉｎꎬ倒掉上清液ꎬ开盖ꎬ室温下风干１２ｈ至离心管底部有明显的白色ＤＮＡ沉淀ꎬ风干后加入灭菌蒸馏水２００μｌꎬ于－２０ħ保存ꎮ以Ｍ３代的基因组ＤＮＡ为模板ꎬ采用２ˑＲａｐｉｄＴａｑＭａｓｔｅｒＭｉｘ或ＰｈａｎｔａＭａｘＳｕｐｅｒ￣ＦｉｄｅｌｉｔｙＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ聚合酶扩增ＯｓＡＣＣ基因的８个片段ꎮ用１％琼脂糖凝胶进行电泳检测ꎮ将条带大小正确的ＰＣＲ产物送南京擎科生物科技有限公司进行测序ꎻ使用ＳｎａｐＧｅｎｅ６.０.２软件分析测序结果ꎬ明确野生型和突变体的ＯｓＡＣＣ基因碱基序列差异性ꎮ１.４㊀喷施除草剂后水稻农艺性状调查２０２２年在江苏省农业科学院试验基地进行镇糯１９野生型和突变株系对３种乙酰辅酶Ａ羧化酶抑制剂类除草剂耐受性试验ꎮ５月中旬播种ꎬ６月中旬插秧ꎮ试验设分别喷施高效盖草能㊁精喹禾灵㊁唑啉草酯及清水对照４个处理ꎬ每处理２.５ｍˑ４０ｍꎮ移栽行距为０２５ｍꎬ株距为０１５ｍꎮ按照常规大田生产进行浇水和施肥等田间管理ꎮ镇糯１９野生型和突变体幼苗移栽大田２７ｄ后ꎬ进行高效盖草能㊁精喹禾灵㊁唑啉草酯及清水(ＣＫ)的喷施处理ꎮ除草剂的用量见表１ꎮ各处理选择连续的２０株ꎬ在水稻喷施除草剂前以及喷施除草剂后３０ｄ㊁９０ｄ进行茎蘖数㊁株高㊁主茎旗叶长度等农艺性状调查ꎮ其中ꎬ喷药后９０ｄꎬ水稻已进入成熟期ꎬ统计的茎蘖数为成穗数ꎮ１.５㊀数据处理与统计分析采用ＭｉｃｒｏｓｏｆｔＥｘｃｅｌ２０１９进行数据处理ꎬ用ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ８.０.１软件进行统计分析ꎮ２㊀结果与分析２.１㊀抗除草剂突变体筛选高效盖草能是一种内吸传导型除草剂ꎬＥＭＳ诱变的镇糯１９Ｍ２代水稻幼苗在３~４叶期喷施高效盖草能７ｄ后ꎬ绝大部分水稻幼苗叶片颜色变成浅绿ꎻ喷施高效盖草能２１ｄ后ꎬ敏感植株叶片几乎完全失去绿色㊁部分已经枯死ꎻ具有抗性的植株能继续正常生长ꎮ经大量筛选后ꎬ最终获得１株具有高效盖草能抗性的Ｍ２单株(图１)ꎬ成熟后收获单株种子ꎬ得到Ｍ３代抗性突变体ꎮ２.２㊀ＯｓＡＣＣ突变位点已知高效盖草能的作用靶标是ＡＣＣａｓｅꎬ植物对７０３江㊀群等:ＥＭＳ诱变创制水稻抗乙酰辅酶Ａ羧化酶抑制剂类除草剂种质图１㊀喷施高效盖草能后筛选到的Ｍ２代抗性水稻植株Ｆｉｇ.１㊀Ｍ２ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｒｅｓｉｓｔａｎｔｒｉｃｅｐｌａｎｔｓｃｒｅｅｎｅｄａｆｔｅｒｓｐｒａ￣ｙｉｎｇｗｉｔｈ６４.８ｇａ.ｉ./ｈｍ２ｈａｌｏｘｙｆｏｐ￣Ｒ￣ｍｅｔｈｙｌ高效盖草能的抗性主要源于ＡＣＣａｓｅ基因的突变[１７￣１９]ꎮ为了确定突变体中靶标基因是否发生突变ꎬ我们用了８对引物对野生型(镇糯１９￣ＷＴ)和抗性Ｍ３单株(镇糯１９￣１７９２)的基因进行扩增ꎬ全部都获得了与预期大小相符合的条带(图２)ꎮ㊀㊀上述ＰＣＲ扩增的产物经测序和碱基序列比对ꎬ发现相对于野生型ＯｓＡＣＣ的ＯＲＦꎬ突变体ＯｓＡＣＣ基因中存在一个点突变ꎬ其开放阅读框(ＯＲＦ)的第５３７４位碱基由Ａ突变成Ｔꎬ从而引起编码的第１７９２位氨基酸由异亮氨酸(Ｉｌｅ)突变为亮氨酸(Ｌｅｕ)(图３Ａ)ꎮＯｓＡＣＣ蛋白的全长有２３２７个氨基酸ꎬ将Ｏｓ￣ＡＣＣ蛋白全长氨基酸序列在ＮＣＢＩ的ＣｏｎｓｅｒｖｅｄＤｏ￣ｍａｉｎ数据库(ｈｔｔｐｓ://ｗｗｗ.ｎｃｂｉ.ｎｌｍ.ｎｉｈ.ｇｏｖ/Ｓｔｒｕｃ￣ｔｕｒｅ/ｃｄｄ/ｗｒｐｓｂ.ｃｇｉ)进行保守结构域分析ꎬ发现其包含了４个结构域(Ｄｏｍａｉｎ):生物素羧化酶(ＢＣ)㊁生物素羧基载体蛋白(ＢＣＣＰ)㊁乙酰辅酶Ａ羧化酶中心(ＡＣＣｃｅｎｔｒａｌ)和羧基转移酶(ＣＴ)(图３Ｂ)ꎮ进一步的氨基酸序列分析结果表明ꎬ突变体中第１７９２位氨基酸的突变位于ＣＴ结构域ꎬ该突变类型与已报道的大穗看麦娘(Ａｌｏｐｅｃｕｒｕｓｍｙｏｓｕｒｏｉｄｅｓ)的抗性位点突变类型是一致的ꎬ对应于其ＡＣＣａｓｅ氨基酸序列第１７８１位点ꎻ突变类型也相同ꎬ均由Ｉｌｅ突变为Ｌｅｕ(图３Ｂ和３Ｃ)[１７]ꎮ因此ꎬ突变体抗除草剂功能的获得是由ＯｓＡＣＣ氨基酸序列第１７９２位氨基酸由异亮氨酸突变为亮氨酸引起的ꎮ２.３㊀突变体的农艺性状在分别喷施高效盖草能㊁精喹禾灵和唑啉草酯１４ｄ后ꎬ野生型植株生长均受到了显著影响ꎬ大部分植株叶片出现枯黄症状ꎮ突变体植株在分别喷施以上３种除草剂后ꎬ叶片仍然是绿色且可以正常生长ꎬ表明突变体对这３种除草剂均具有抗性(图４)ꎮ㊀㊀分蘖期分别喷施３种不同除草剂后ꎬ野生型和突变体株高㊁分蘖数及旗叶长度的变化如图５所示ꎮ结果显示ꎬ在喷施清水处理的情况下ꎬ野生型和突变体植株的株高在处理前(０ｄꎬ即幼苗移栽到大田２７ｄ)基本没有差异ꎬ但在处理后３０ｄ和９０ｄꎬ突变体的株高显著低于野生型的株高(图５Ａ)ꎻ两者在处理前㊁后的单株茎蘖数均无明显差异(图５Ｅ)ꎮ在分别喷施３种不同除草剂前(０ｄ)ꎬ野生型和突变体植株的株高和单株分蘖数都没有明显差异ꎬ但是在喷施处理后ꎬ两者受除草剂的影响表现出明显差异(图５Ｂ~图５Ｄ㊁图５Ｆ~图５Ｈ)ꎮ其中ꎬ在喷施高效盖草能３０ｄ和９０ｄ后ꎬ突变体的株高均显著高于野生型(图５Ｂ)ꎬ单株茎蘖数也显著多于野生型(图５Ｆ)ꎮ野生型对精喹禾灵和唑啉草酯都非常敏感ꎬ喷施田间推荐剂量后水稻植株均死亡ꎬ因此未统计喷药后的株高和分蘖数ꎬ而突变体对这两种除草剂表现出较强的抗性ꎬ所有植株存活且能正常生长ꎬ株高随时间逐渐增加(图５Ｃ和５Ｄ)ꎮ突变体的单株茎蘖数在精喹禾灵处理后随时间呈先增后减趋势ꎬ但经唑啉草酯处理后变化不明显ꎬ未出现明显增加现象(图５Ｇ和５Ｈ)ꎮ喷施清水处理的突变体旗叶长度显著短于野生型ꎻ高效盖草能处理后ꎬ突变体的旗叶长度显著长于野生型(图５Ｉ)ꎮ由于野生型在喷施田间推荐剂量的精喹禾灵和唑啉草酯后植株已经枯死ꎬ因此未能进行旗叶长度统计ꎮ综合以上结果ꎬ在田间推荐剂量下ꎬ突变体对高效盖草能㊁精喹禾灵和唑啉草酯的抗性水平均高于野生型ꎮ３㊀讨论植物对除草剂的抗性机制包括非靶标和靶标抗性两大类ꎮ其中ꎬ非靶标抗性是由靶标基因以外的突变引起的ꎬ使植物对除草剂的吸收或转运率降低㊁螯合或代谢作用增强ꎻ靶标抗性是由除草剂的靶标基因发生突变引起的[２０]ꎮ现在已发现的大部分植物抗ＡＣＣａｓｅ抑制剂类除草剂的抗性机制是由于ＡＣＣａｓｅ基因碱基突变引起氨基酸位点发生变异ꎬ这也是导致杂草抗药性产生的主要原因[２１￣２２]ꎮ截止８０３江苏农业学报㊀２０２３年第３９卷第２期Ｍ表示ＤＮＡｍａｒｋｅｒꎻ泳道１表示野生型ꎻ泳道２表示突变体ꎮＦ１~Ｆ８㊁Ｒ１~Ｒ８为引物ꎬ见表２ꎮ图２㊀镇糯１９野生型和突变体中ＯｓＡＣＣ基因的ＰＣＲ扩增结果Ｆｉｇ.２㊀ＰＣＲａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＯｓＡＣＣｉｎＺｈｅｎｎｕｏ１９ｗｉｌｄ￣ｔｙｐｅａｎｄｍｕｔａｎｔＡ:突变体(镇糯１９￣１７９２)中ＯｓＡＣＣ基因的Ｓａｎｇｅｒ测序色谱图ꎻＢ:ＯｓＡＣＣ蛋白结构域示意图ꎻＣ:野生型(镇糯１９￣ＷＴ)和突变体(镇糯１９￣１７９２)的羧基转移酶(ＣＴ)结构域氨基酸序列比对ꎮ图３㊀镇糯１９突变体中突变基因ＯｓＡＣＣ及其编码氨基酸序列分析Ｆｉｇ.３㊀ＡｎａｌｙｓｉｓｏｆｍｕｔａｎｔｇｅｎｅＯｓＡＣＣａｎｄｉｔｓｅｎｃｏｄｅｄａｍｉｎｏａｃｉｄｓｅｑｕｅｎｃｅｉｎＺｈｅｎｎｕｏ１９ｍｕｔａｎｔ９０３江㊀群等:ＥＭＳ诱变创制水稻抗乙酰辅酶Ａ羧化酶抑制剂类除草剂种质镇糯１９￣ＷＴ㊁镇糯１９￣１７９２分别表示镇糯１９野生型和突变体ꎻＧＣＮ㊁ＪＫ㊁ＺＬ和Ｈ２Ｏ分别表示喷施高效盖草能㊁精喹禾灵㊁唑啉草酯及清水处理ꎮ图４㊀镇糯１９野生型和突变体田间喷施不同除草剂后的表型Ｆｉｇ.４㊀ＰｈｅｎｏｔｙｐｅｓｏｆＺｈｅｎｎｕｏ１９ｗｉｌｄ￣ｔｙｐｅａｎｄｍｕｔａｎｔａｆｔｅｒｓｐｒａｙｉｎｇｗｉｔｈｄｉｆｆｅｒｅｎｔｈｅｒｂｉｃｉｄｅｓｉｎｔｈｅｆｉｅｌｄ目前ꎬ杂草中已报道了十几种ＡＣＣａｓｅ氨基酸置换与其抗药性相关ꎬ分别对应于大穗看麦娘ＡＣＣａｓｅ的７个氨基酸位点(均位于ＣＴ结构域内):第１７８１位㊁第１９９９位㊁第２０２７位㊁第２０４１位㊁第２０７８位㊁第２０８８位和第２０９６位[２２￣２５]ꎮ在以上这些突变中ꎬ以第１７８１位氨基酸由Ｌｅｕ突变成Ｉｌｅ最为普遍ꎬ对三大类不同的ＡＣＣａｓｅ抑制剂类除草剂都表现出高抗性ꎬ却没有适合度代价(Ｆｉｔｎｅｓｓｃｏｓｔ)[２６￣２８]ꎮ本研究通过筛选ＥＭＳ诱变的镇糯１９水稻突变体ꎬ鉴定到了１个能稳定遗传的抗除草剂突变体ꎮ对突变体进行了基因鉴定ꎬ确定其编码靶标蛋白ＯｓＡＣＣ的第１７９２位氨基酸由Ｌｅｕ突变成Ｉｌｅꎮ该突变类型与已报道的突变类型一致ꎬ对应于大穗看麦娘ＡＣＣａｓｅ第１７８１位氨基酸突变ꎮ这是该突变类型使水稻获得多种ＡＣＣａｓｅ抑制剂类除草剂抗性的首次报道ꎮＥＭＳ是最常见的化学诱变剂ꎬ在植物的诱变育种中被广泛应用[２９]ꎮ本试验通过ＥＭＳ诱变镇糯１９种子ꎬ筛选到了抗ＡＣＣａｓｅ抑制剂类除草剂的水稻植株ꎬ突变体能耐受田间推荐剂量的高效盖草能㊁精喹禾灵和唑啉草酯ꎮ其中ꎬ喷施了田间推荐剂量的唑啉草酯后ꎬ镇糯１９野生型植株在处理３０ｄ后几乎全部死亡ꎻ喷施了田间推荐剂量的精喹禾灵后ꎬ野生型的植株在喷施３０ｄ后全部死亡ꎻ而突变体在分别喷施３种除草剂后ꎬ均未出现死亡现象ꎬ基本可以正常生长ꎮ所获得的抗性突变体对高效盖草能㊁精喹禾灵㊁唑啉草酯的抗性水平均明显强于野生型ꎮ突变体和野生型的最小致死剂量或５０％抑制浓度(ＧＲ５０)㊁ＯｓＡＣＣ酶活性的差异尚有待进一步明确ꎮ大豆㊁棉花和玉米等转基因作物已在全球范围内进行了商品化生产ꎬ产生了巨大的社会效益和经济效益ꎮ目前为止ꎬ中国虽然有多种转基因作物已经被正式批准商品化生产ꎬ但进行大面积种植的仅０１３江苏农业学报㊀２０２３年第３９卷第２期Ｈ２Ｏ㊁ＧＣＮ㊁ＪＫ㊁ＺＬ分别表示喷施清水㊁高效盖草能㊁精喹禾灵㊁ꎬ∗∗表示在０.０１水平上极显著ꎮＮＤ表示没有数据ꎬｎｓ表示没有显著差异ꎮ图５㊀不同除草剂处理下的水稻株高㊁分蘖数和旗叶长度Ｆｉｇ.５㊀Ｐｌａｎｔｈｅｉｇｈｔꎬｔｉｌｌｅｒｎｕｍｂｅｒａｎｄｆｌａｇｌｅａｆｌｅｎｇｔｈｏｆｒｉｃｅｕｎｄｅｒｄｉｆｆｅｒｅｎｔｈｅｒｂｉｃｉｄｅｔｒｅａｔｍｅｎｔｓ有番木瓜和棉花ꎮ２００９年ꎬ农业部颁发了中国拥有自主知识产权的转Ｂｔ基因抗虫水稻生产应用安全证书ꎬ但目前中国尚未批准转基因水稻的商业化生产ꎮ因此ꎬ培育非转基因的抗除草剂水稻品种具有重要价值ꎮ上世纪９０年代晚期ꎬ美国路易斯安那州州立大学稻米研究中心通过ＥＭＳ诱变技术育成了一系列耐咪唑啉酮类除草剂(ＡＬＳ抑制剂类除草剂)的非转基因水稻品种ꎮ２００２年ꎬ巴斯夫公司开发了非转基因抗咪唑啉酮类除草剂的水稻品种Ｃｌｅａｒｆ￣ｉｅｌｄ在美国进行了商业化推广ꎬ解决了水稻种植的杂草稻危害问题[３０]ꎮ２０１８年ꎬ巴斯夫又在美国上市了非转基因水稻品种Ｐｒｏｖｉｓｉａꎬ可以抗精喹禾灵ꎬ拟与抗咪唑啉酮类除草剂水稻品种Ｃｌｅａｒｆｉｅｌｄ进行轮作并交替使用两种不同作用机理的除草剂ꎬ实现对杂草稻和其他一年生杂草的可持续性防控[３１]ꎮ本研究通过ＥＭＳ诱变筛选到的抗ＡＣＣａｓｅ抑制剂类除草剂突变体ꎬ具有与抗除草剂精喹禾灵水稻品种Ｐｒｏｖｉｓｉａ类似的抗除草剂性状ꎬ可为中国非转基因抗除草剂水稻育种提供重要材料ꎮ４㊀结论本研究通过ＥＭＳ诱变筛选获得了可稳定遗传的抗ＡＣＣａｓｅ抑制剂类除草剂的水稻突变体材料ꎬ可耐受３种不同田间推荐剂量的除草剂ꎬ具有一定的生产应用价值ꎮ野生型在喷施田间推荐剂量的高效盖草能㊁精喹禾灵㊁唑啉草酯后ꎬ株高和分蘖均受到严重抑制甚至死亡ꎬ但突变体基本能正常生长ꎮ突变体中ＯｓＡＣＣ突变基因编码蛋白质的第１７９２位氨基酸由Ｉｌｅ变成Ｌｅｕꎬ使其对ＡＣＣａｓｅ抑制剂类除草剂的耐受性显著提高ꎮ在当前中国转基因水稻尚未放开㊁公众对转基因作物品种存在疑虑的大背景下ꎬ本研究获得的非转基因抗除草剂材料具有良好的应用前景ꎮ１１３江㊀群等:ＥＭＳ诱变创制水稻抗乙酰辅酶Ａ羧化酶抑制剂类除草剂种质参考文献:[１]㊀董立尧ꎬ高㊀原ꎬ房加鹏ꎬ等.我国水稻田杂草抗药性研究进展[Ｊ].植物保护ꎬ２０１８ꎬ４４(５):６９￣７６.[２]㊀程艳勤.浅析除草剂对水稻的危害及治理[Ｊ].农技服务ꎬ２０１６ꎬ３３(６):１０９￣１１４.[３]㊀ＫＯＮＩＳＨＩＴＫＵＪꎬＳＨＩＮＯＨＡＲＡＫꎬＹＡＭＡＤＡＫꎬｅｔａｌ.Ａｃｅｔｙｌ￣ＣｏＡｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅｉｎｈｉｇｈｅｒｐｌａｎｔｓ:ｍｏｓｔｐｌａｎｔｓｏｔｈｅｒｔｈａｎｇｒａｍｉｎｅａｅｈａｖｅｂｏｔｈｔｈｅｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃａｎｄｔｈｅｅｕｋａｒｙｏｔｉｃｆｏｒｍｓｏｆｔｈｉｓｅｎｚｙｍｅ[Ｊ].ＰｌａｎｔａｎｄＣｅｌｌＰｈｙｓｉｏｌｏｇｙꎬ１９９６ꎬ３７(２):１１７￣１２２. [４]㊀王㊀爽ꎬ张荣全ꎬ叶㊀非.乙酰辅酶Ａ羧化酶抑制剂的研究进展[Ｊ].农药科学与管理ꎬ２００３(１０):２６￣３２.[５]㊀蔡靖萱.扬州市小麦田菵草对ＡＣＣａｓｅ抑制剂的抗性研究[Ｄ].扬州:扬州大学ꎬ２０２０.[６]㊀ＲＥＮＤＩＮＡＡＲꎬＦＥＬＴＳＪＭ.ＣｙｃｌｏｈｅｘａｎｅｄｉｏｎｅＨｅｒｂｉｃｉｄｅｓａｒｅｓｅ￣ｌｅｃｔｉｖｅａｎｄｐｏｔｅｎｔｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓｏｆａｃｅｔｙｌ￣ＣｏＡｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅｆｒｏｍｇｒａｓｓｅｓ[Ｊ].ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌꎬ１９８８ꎬ８６(４):９８３￣９８６.[７]㊀袁国徽ꎬ王恒智ꎬ赵㊀宁ꎬ等.耿氏硬草对乙酰辅酶Ａ羧化酶类除草剂抗性水平及分子机制初探[Ｊ].农药学学报ꎬ２０１６ꎬ１８(３):３０４￣３１０.[８]㊀董元海.新苯基吡唑啉类除草剂唑啉草酯的合成[Ｄ].武汉:武汉工程大学ꎬ２０１７.[９]㊀刘博宏ꎬ叶㊀非.芳氧苯氧基丙酸酯类除草剂的应用进展[Ｊ].农药科学与管理ꎬ２０１１ꎬ３２(２):２０￣２５.[１０]吕㊀军ꎬ刘㊀军ꎬ姜秀英ꎬ等.ＥＭＳ诱导水稻辽星１号ᶄ突变体的筛选与鉴定[Ｊ].分子植物育种ꎬ２０２２ꎬ２０(１２):４０３８￣４０４３. [１１]董颖苹ꎬ连㊀勇ꎬ何庆才ꎬ等.植物化学诱变技术在育种中的运用及进展Ⅱ.突变体的筛选及分子检测[Ｊ].种子ꎬ２００５ꎬ２４(８):５４￣５８.[１２]黄㊀静.水稻ＥＭＳ诱变效率和品种内遗传多态性分析[Ｄ].福州:福建农林大学ꎬ２０１５.[１３]顾佳清ꎬ张智奇ꎬ周㊀音ꎬ等.ＥＭＳ诱导水稻中花１１突变体的筛选和鉴定[Ｊ].上海农业学报ꎬ２００５ꎬ２１(１):７￣１１.[１４]陈忠明ꎬ王秀娥.水稻强优势恢复系９３１１粒重的诱变改良[Ｊ].分子植物育种ꎬ２００５ꎬ３(３):３５３￣３５６.[１５]陈忠明ꎬ王秀娥ꎬ胡兴雨ꎬ等.水稻长穗颈恢复系９３１１ｅＲ的诱变选育[Ｊ].江苏农业科学ꎬ２００５(４):９￣１１.[１６]陈天子ꎬ余㊀月ꎬ凌溪铁ꎬ等.ＥＭＳ诱变水稻创制抗咪唑啉酮除草剂种质[Ｊ].核农学报ꎬ２０２１ꎬ３５(２):２５３￣２６１.[１７]ＤÉＬＹＥＣꎬＣＡＬＭÈＳÉꎬＭＡＴÉＪＩＣＥＫＡ.ＳＮＰｍａｒｋｅｒｓｆｏｒｂｌａｃｋ￣ｇｒａｓｓ(ＡｌｏｐｅｃｕｒｕｓｍｙｏｓｕｒｏｉｄｅｓＨｕｄｓ.)ｇｅｎｏｔｙｐｅｓｒｅｓｉｓｔａｎｔｔｏａｃｅｔｙｌＣｏＡ￣ｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇｈｅｒｂｉｃｉｄｅｓ[Ｊ].ＴｈｅｏｒｅｔｉｃａｌａｎｄＡｐｐｌｉｅｄＧｅｎｅｔｉｃｓꎬ２００２ꎬ１０４(６):１１１４￣１１２０.[１８]ＤÉＬＹＥＣꎬＺＨＡＮＧＸꎬＣＨＡＬＯＰＩＮＣꎬｅｔａｌ.Ａｎｉｓｏｌｅｕｃｉｎｅｒｅｓｉ￣ｄｕｅｗｉｔｈｉｎｔｈｅｃａｒｂｏｘｙｌ￣ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅｄｏｍａｉｎｏｆｍｕｌｔｉｄｏｍａｉｎａｃｅｔｙｌ￣ｃｏｅｎｚｙｍｅＡｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅｉｓａｍａｊｏｒｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔｏｆｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙｔｏａｒｙ￣ｌｏｘｙｐｈｅｎｏｘｙｐｒｏｐｉｏｎａｔｅｂｕｔｎｏｔｔｏｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅｄｉｏｎｅｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ[Ｊ].ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌｏｇｙꎬ２００３ꎬ１３２(３):１７１６￣１７２３.[１９]ＤÉＬＹＥＣꎬＺＨＡＮＧＸꎬＭＩＣＨＥＬＳꎬｅｔａｌ.Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｂａｓｅｓｆｏｒｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙｔｏａｃｅｔｙｌ￣ｃｏｅｎｚｙｍｅＡｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓｉｎｂｌａｃｋ￣ｇｒａｓｓ[Ｊ].ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌｏｇｙꎬ２００５ꎬ１３７(３):７９４￣８０６.[２０]ＰＯＷＬＥＳＳＢꎬＹＵＱ.ＥｖｏｌｕｔｉｏｎｉｎＡｃｔｉｏｎ:ｐｌａｎｔｓｒｅｓｉｓｔａｎｔｔｏｈｅｒ￣ｂｉｃｉｄｅｓ[Ｊ].ＡｎｎｕａｌＲｅｖｉｅｗｏｆＰｌａｎｔＢｉｏｌｏｇｙꎬ２０１０ꎬ６１(１):３１７￣３４７.[２１]袁国徽ꎬ田志慧ꎬ高㊀原ꎬ等.上海市水稻田千金子对３种乙酰辅酶Ａ羧化酶抑制剂的抗性现状及酶突变机制[Ｊ].农药学学报ꎬ２０２２ꎬ２４(３):４９２￣５００.[２２]ＢＥＣＫＩＥＨＪꎬＴＡＲＤＩＦＦＪ.Ｈｅｒｂｉｃｉｄｅｃｒｏｓｓｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｉｎｗｅｅｄｓ[Ｊ].ＣｒｏｐＰｒｏｔｅｃｔｉｏｎꎬ２０１２ꎬ３５:１５￣２８.[２３]ＤＥＮＧＷꎬＣＡＩＪꎬＺＨＡＮＧＪꎬｅｔａｌ.ＭｏｌｅｃｕｌａｒｂａｓｉｓｏｆｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｔｏＡＣＣａｓｅ￣ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇｈｅｒｂｉｃｉｄｅｃｙｈａｌｏｆｏｐ￣ｂｕｔｙｌｉｎＣｈｉｎｅｓｅｓｐｒａｎ￣ｇｌｅｔｏｐ(Ｌｅｐｔｏｃｈｌｏａｃｈｉｎｅｎｓｉｓ(Ｌ.)Ｎｅｅｓ)ｆｒｏｍＣｈｉｎａ[Ｊ].ＰｅｓｔｉｃＢｉｏｃｈｅｍＰｈｙｓｉｏｌꎬ２０１９ꎬ１５８:１４３￣１４８.[２４]ＰＥＮＧＹꎬＰＡＮＬꎬＬＩＵＤꎬｅｔａｌ.Ｃｏｎｆｉｒｍａｔｉｏｎａｎｄｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆｃｙｈａｌｏｆｏｐ￣ｂｕｔｙｌ￣ｒｅｓｉｓｔａｎｔＣｈｉｎｅｓｅｓｐｒａｎｇｌｅｔｏｐ(Ｌｅｐｔｏｃｈｌｏａｃｈｉｎｅｎｓｉｓ)ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓｆｒｏｍＣｈｉｎａ[Ｊ].ＷｅｅｄＳｃｉｅｎｃｅꎬ２０２０ꎬ６８(３):２５３￣２５９.[２５]张㊀怡ꎬ陈丽萍ꎬ徐笔奇ꎬ等.浙江稻区千金子对氰氟草酯和噁唑酰草胺的抗药性及其分子机制研究[Ｊ].农药学学报ꎬ２０２０ꎬ２２(３):４４７￣４５３.[２６]ＶＩＬＡＡＩＵＢＭＭꎬＮＥＶＥＰꎬＰＯＷＬＥＳＳＢ.ＲｅｓｉｓｔａｎｃｅｃｏｓｔｏｆａｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅＰ４５０ｈｅｒｂｉｃｉｄｅｍｅｔａｂｏｌｉｓｍｍｅｃｈａｎｉｓｍｂｕｔｎｏｔａｎＡＣ￣ＣａｓｅｔａｒｇｅｔｓｉｔｅｍｕｔａｔｉｏｎｉｎａｍｕｌｔｉｐｌｅｒｅｓｉｓｔａｎｔＬｏｌｉｕｍｒｉｇｉｄｕｍｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ[Ｊ].ＮｅｗＰｈｙｔｏｌｏｇｉｓｔꎬ２００５ꎬ１６７(３):７８７￣７９６. [２７]ＭＥＮＣＨＡＲＩＹꎬＣＨＡＵＶＥＬＢꎬＤＡＲＭＥＮＣＹＨꎬｅｔａｌ.Ｆｉｔｎｅｓｓｃｏｓｔｓａｓｓｏｃｉａｔｅｄｗｉｔｈｔｈｒｅｅｍｕｔａｎｔａｃｅｔｙｌ￣ｃｏｅｎｚｙｍｅＡｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅａｌｌｅｌｅｓｅｎｄｏｗｉｎｇｈｅｒｂｉｃｉｄｅｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｉｎｂｌａｃｋ￣ｇｒａｓｓＡｌｏｐｅｃｕｒｕｓｍｙ￣ｏｓｕｒｏｉｄｅｓ[Ｊ].ＪｏｕｒｎａｌｏｆＡｐｐｌｉｅｄＥｃｏｌｏｇｙꎬ２００８ꎬ４５(３):９３９￣９４７. [２８]ＷＡＮＧＴꎬＰＩＣＡＲＤＪＣꎬＴＩＡＮＸꎬｅｔａｌ.Ａｈｅｒｂｉｃｉｄｅ￣ｒｅｓｉｓｔａｎｔＡＣＣａｓｅ１７８１ｓｅｔａｒｉａｍｕｔａｎｔｓｈｏｗｓｈｉｇｈｅｒｆｉｔｎｅｓｓｔｈａｎｗｉｌｄｔｙｐｅ[Ｊ].Ｈｅｒｅｄｉｔｙ(Ｅｄｉｎｂ)ꎬ２０１０ꎬ１０５(４):３９４￣４００.[２９]ＳＥＲＲＡＴＸꎬＥＳＴＥＢＡＮＲꎬＧＵＩＢＯＵＲＴＮꎬｅｔａｌ.ＥＭＳｍｕｔａｇｅｎｅ￣ｓｉｓｉｎｍａｔｕｒｅｓｅｅｄ￣ｄｅｒｉｖｅｄｒｉｃｅｃａｌｌｉａｓａｎｅｗｍｅｔｈｏｄｆｏｒｒａｐｉｄｌｙｏｂｔａｉｎｉｎｇＴＩＬＬＩＮＧｍｕｔａｎｔｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ[Ｊ].ＰｌａｎｔＭｅｔｈｏｄｓꎬ２０１４ꎬ１０(１):５.[３０]ＳＨＡＸＹꎬＬＩＮＳＣＯＭＢＥＳＤꎬＧＲＯＴＨＤＥ.Ｆｉｅｌｄｅｖａｌｕａｔｉｏｎｏｆｉｍｉｄａｚｏｌｉｎｏｎｅ￣ｔｏｌｅｒａｎｔＣｌｅａｒｆｉｅｌｄｒｉｃｅ(ＯｒｙｚａｓａｔｉｖａＬ.)ａｔｎｉｎｅＬｏｕｉｓｉａｎａｌｏｃａｔｉｏｎｓ[Ｊ].ＣｒｏｐＳｃｉｅｎｃｅꎬ２００７ꎬ４７(３):１１７７￣１１８５. [３１]ＣＡＭＡＣＨＯＪＲꎬＬＩＮＳＣＯＭＢＥＳＤꎬＳＡＮＡＢＲＩＡＹꎬｅｔａｌ.Ｉｎｈｅｒｉｔ￣ａｎｃｅｏｆＰｒｏｖｉｓｉａｒｉｃｅｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｔｏｑｕｉｚａｌｏｆｏｐ￣ｐ￣ｅｔｈｙｌｕｎｄｅｒｌａｂｏｒａ￣ｔｏｒｙａｎｄｇｒｅｅｎｈｏｕｓｅｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔｓ[Ｊ].Ｅｕｐｈｙｔｉｃａꎬ２０１９ꎬ２１５(４):８３.(责任编辑:石春林)２１３江苏农业学报㊀２０２３年第３９卷第２期。

利用EMS诱变创制抗除草剂粳稻新种质

河南农业科学,2021,50(4):8-16Journal of Henan Agricultural Sciencesdoi :10.15933/ki.1004-3268.2021.04.002收稿日期:2021-01-18基金项目:国家重点研发计划项目(2017YFD0100400,2016YFD0100101)作者简介:王付华(1966-),男,湖南祁阳人,副研究员,博士,主要从事水稻分子育种工作㊂E -mail:wangfuhuahunan@ 通信作者:尹海庆(1965-),男,河南南阳人,研究员,主要从事水稻分子育种工作㊂E -mail:yinhq98@利用EMS 诱变创制抗除草剂粳稻新种质王付华1,李自超2,王㊀亚1,付㊀景1,杨文博1,尹海庆1,王生轩1,王越涛1,白㊀涛1,张㊀珍3(1.河南省农业科学院粮食作物研究所,河南郑州450002;2.中国农业大学农学院,北京100193;3.河南省农业科学技术展览馆,河南郑州450000)摘要:为了创制抗除草剂水稻新种质,用EMS (甲基磺酸乙酯)溶液浸泡郑稻19干种子,在M 2幼苗三叶期分别喷施112.5g /hm 2的甲咪唑烟酸和60g /hm 2的烟嘧磺隆,14d 后筛选抗除草剂突变体,并对突变体ALS (Acetolactate synthase )基因序列进行分析,找出ALS 基因突变位点㊂结果表明,喷施甲咪唑烟酸14d 后,抗除草剂植株生长正常㊁叶色偏绿,敏感植株黄化㊁生长受抑制;喷施烟嘧磺隆14d 后,抗除草剂植株表现前期受抑制,但能缓慢恢复㊂用甲咪唑烟酸筛选63000份M 2家系,获得抗除草剂突变体6份(HF1 HF6),包括2种ALS 氨基酸突变类型:Ser -627-Asn 和Gly -628-Glu ㊂用烟嘧磺隆筛选M 2家系30000份,获得抗除草剂突变体2份(HF7 HF8),包括2种ALS 氨基酸突变类型:Pro -171-Ser 和Ala -179-Val ㊂在M 2筛选到1个特定ALS 碱基突变平均需23250份M 2家系㊂筛选到的抗甲咪唑烟酸突变体HF1(Gly -628-Glu )和HF2(Ser -627-Asn )在1倍大田常规除草剂剂量(112.5g /hm 2)下鲜质量减退率分别为13.09%和20.03%,显著小于郑稻19(P <0.05);在8倍大田常规除草剂剂量(900g /hm 2)下突变体仍能正常生长,表现强的甲咪唑烟酸抗性㊂对HF1㊁HF2分别喷施30g /hm 2和60g /hm 2烟嘧磺隆,其鲜质量减退率分别为24.81%㊁13.13%和34.13%㊁28.01%,显著小于郑稻19(P <0.05),表现一定的烟嘧磺隆抗性㊂综上,筛选到8份抗除草剂突变体材料,2份抗烟嘧磺隆,6份抗甲咪唑烟酸,其中2份抗甲咪唑烟酸突变体兼具烟嘧磺隆抗性,创制的抗除草剂材料可用于选育非转基因抗除草剂品种,也可作为创制ALS 多位点突变种质的基础材料,进一步增强突变体对除草剂的抗性㊂关键词:粳稻;抗烟嘧磺隆;抗甲咪唑烟酸;抗除草剂;EMS 诱变;种质创建中图分类号:S511㊀㊀文献标志码:A㊀㊀文章编号:1004-3268(2021)04-0008-09New Herbicide-Resistant Japonica Rice GermplasmsCreated by EMS MutagenesisWANG Fuhua 1,LI Zichao 2,WANG Ya 1,FU Jing 1,YANG Wenbo 1,YIN Haiqing 1,WANG Shengxuan 1,WANG Yuetao 1,BAI Tao 1,ZHANG Zhen 3(1.Institute of Cereal Crops,Henan Academy of Agricultural Sciences,Zhengzhou 450002,China;2.Agricultural College,China Agricultural University,Beijing 100193,China;3.Henan Agricultural Science and Technology Exhibition Hall,Zhengzhou 450000,China)Abstract :In order to create new herbicide-resistant rice germplasms,the dry seeds of Zhengdao 19were soaked in ethylmethane sulfonate (EMS )solution.At three-leaf stage,M 2seedlings were sprayed with imazapic(112.5g /ha)and nicosulfuron(60g /ha).The herbicide-resistant mutants were screened after 14days.The ALS (acetolactate synthase )gene sequences of mutants were analyzed to find out the mutation sites.The results showed that the herbicide-resistant plants grew normally after spraying imazapic,the leaf kept green,while the leaves of sensitive lines yellowed,and their growth were inhibited;after spraying nicosulfuron,the growth of herbicide-resistant plants were inhibited in the early stage,but㊀第4期王付华等:利用EMS诱变创制抗除草剂粳稻新种质could recover slowly.A total of63000M2lines were screened with imazapic,and6imazapic-resistant mutants(HF1 HF6)were obtained,including two types of ALS mutations,Ser-627-Asn and Gly-628-Glu.A total of30000M2lines were screened with nicosulfuron,and2herbicide-resistant mutants (HF7 HF8)were obtained,including two types of ALS mutations,Pro-171-Ser and Ala-179-Val.To obtain a specific ALS nucleotide mutation,an average of23250M2lines were needed to screen.The fresh weight reduction rates of imazapic-resistant mutants HF1(Gly-628-Glu)and HF2(Ser-627-Asn)were 13.09%and20.03%respectively after spraying1time the conventional herbicide dose(112.5g/ha), which were significantly less than that of Zhengdao19(P<0.05);the mutants could still grow normally after spraying8times the conventional herbicide dose in the field,showing strong resistance to imazapic herbicides.The fresh weight reduction rates of mutants HF1and HF2were24.81%and13.13%after spraying30g/ha nicosulfuron,and were34.13%and28.01%after spraying60g/ha nicosulfuron, respectively,which were significantly less than those of Zhengdao19(P<0.05),showing certain nicosulfuron resistance.In summary,8herbicide-resistant mutant lines were obtained,2lines were resistant to nicosulfuron,6lines were resistant to imazapic,and two of the imazapic-resistant mutants exhibited nicotinsulfuron resistance.The screened herbicide-resistant mutants could be used to breed non-GMO herbicide-resistant varieties,and also be used as a basic germplasm for the multi-site mutation of ALS,so as to further strengthen the herbicide resistance of mutants.Key words:Japonica rice;Resistance to nicosulfuron;Resistance to imazapic;Resistance to herbicide; EMS mutagenesis;Germplasm innovation㊀㊀水稻是我国主要粮食作物㊂当前,农业劳动力价格飙涨,水稻种植方式轻简化趋势明显,水稻直播省工省力,推广面积越来越大[1]㊂与传统移栽相比,直播稻田杂草种子和水稻种子生长同步,杂草生长快㊁种类多㊁密度大,容易滋生杂草稻[2],杂草控制是制约水稻直播生产的关键㊂培育抗除草剂作物,便于大田杂草控制[3]㊂当前,转基因抗除草剂作物已大面积生产应用,主要有转基因抗除草剂玉米㊁棉花㊁油菜和大豆等饲料㊁油料作物[4],而转基因水稻尚未在我国批准商业使用㊂因此,培育非转基因抗除草剂水稻十分必要㊂国外非转基因抗除草剂作物已有成功先例,如20世纪末选育成功的抗三氮苯的油菜㊁抗咪唑啉酮的玉米等[5-6]㊂非转基因抗除草剂作物所抗除草剂主要包括咪唑啉酮类㊁环己烯酮类㊁磺酰脲类㊁均三氮苯类㊁有机磷类和激素类等[7]㊂乙酰乳酸合成酶(Acetolactate synthase,ALS)是亮氨酸㊁异亮氨酸和缬氨酸等支链氨基酸合成中的关键酶,是多种除草剂的作用靶标,包括咪唑啉酮类(Imidazolinones,IMIs)㊁磺酰脲类(Sulfonylureas, SUs)㊁嘧啶硫代苯甲酸脂类(Pyrimidinylthio-benzoates, PTBs)㊁三唑并嘧啶类(Triazolopyrimidines,TPs)和磺酰胺羰基三唑啉酮类(Sulfonylamino-carbonyltriazolinones, SCTs)[8-9]㊂ALS抑制剂类除草剂与植物体内的ALS 结合形成复合物,阻断底物进入酶活性位点通路,抑制ALS活性,使支链氨基酸合成受阻,破坏植物细胞正常生长,导致植物死亡[10-12]㊂ALS基因某些位点的突变会减弱ALS与除草剂的结合力,产生除草剂抗性㊂对以ALS为靶标的抗性杂草进行研究发现,ALS的突变主要发生在8个氨基酸位点[12];在拟南芥中研究发现,ALS蛋白中有20多个位点的氨基酸替换会产生除草剂抗性[10-14]㊂目前,水稻中已公开报道了多个抗除草剂ALS 氨基酸突变位点㊂1993年,路易斯安娜州立大学农业中心通过EMS(甲基磺酸乙酯)诱变筛选到抗咪唑啉酮类除草剂的水稻种质AS3510,其ALS氨基酸突变为Gly-628-Glu(第628位氨基酸由甘氨酸突变为谷氨酸),利用AS3510选育出商业品种121CL㊁141CL[15]㊂利用EMS诱变丰产性品种Cypress,筛选到抗咪唑啉酮除草剂种质PWC16,其ALS氨基酸突变为Ser-627-Asn,利用PWC16选育出商业品种CL161㊁141CL[16-17],2002年美国的抗除草剂水稻实现商业生产,有效控制了当地杂草稻的危害㊂阿根廷学者用EMS诱变当地水稻品种IRGA417也筛选到抗咪唑啉酮类除草剂材料,选育出抗咪唑啉酮品种PUTA INTA CL,其ALS氨基酸突变为Ala-96-Thr[18]㊂OKUZAKI等[19]以双草醚(嘧啶水杨酸类除草剂)筛选水稻品种台中65的花药培养愈伤组织,获得1个抗磺酰脲类除草剂的突变体,ALS氨基酸突变为Gly-95-Ala㊂近年来,我国多个研究单位筛选到ALS突变抗除草剂材料,深圳兴旺生物种业有限公司用EMS诱变黄华占和黄丝占,以咪唑啉酮类除草剂筛选,获得3个抗性突变体(Tyr-548-Me/ Cyst㊁Ala-96-Val/Thr㊁Ser-627-An)[20]㊂赵炳然等[21]以咪唑乙烟酸筛选EMS诱变的籼稻品种华航9河南农业科学第50卷31,获得4个抗性突变体,ALS氨基酸突变为Ala-179-Val㊁Ser-627-Asn㊁Gly-628-Glu㊁Val-643-Met㊂江苏省农业科学院利用甲咪唑烟酸筛选经EMS诱变的多个粳稻㊁籼稻品种,获得多个抗除草剂突变体,ALS氨基酸突变包括Gly-136-Thr㊁Pro-171-His㊁Ala-179-Val㊁Ser-627-Asn㊁Gly-628-Glu 等[22-25]㊂用除草剂筛选品种资源,王芳权等[26]从7000多份水稻种质资源中筛选到1份抗咪唑啉酮除草剂的材料,ALS氨基酸突变为Ser-627-Asn;毕俊国等[27]以咪唑乙烟酸筛选30000份水稻种质,同样获得1份ALS氨基酸突变为Ser-627-Asn的抗性材料㊂综上可见,以往的抗除草剂水稻材料筛选以抗咪唑啉酮类除草剂为主㊂烟嘧磺隆是磺酰脲类除草剂,高效㊁低毒㊁便宜,能杀灭大田主要禾本科杂草和部分阔叶杂草,即禾阔双杀 ,是玉米田前期主要除草剂,但水稻易受伤害㊂如果能通过诱变筛选到抗烟嘧磺隆的水稻新材料,创制抗除草剂新品种,对现实生产意义重大,但目前尚未见相关报道㊂为此,以自育直播粳稻品种郑稻19为材料,采用EMS进行诱变,然后用甲咪唑烟酸和烟嘧磺隆筛选抗除草剂水稻新种质,为选育非转基因抗除草剂水稻品种奠定基础㊂1㊀材料和方法1.1㊀试验材料供试水稻材料为粳稻品种郑稻19(Zhengdao 19),由河南省农业科学院粮食作物研究所选育㊂EMS购自Sigma-Aldrich公司㊂甲咪唑烟酸铵盐水剂(240g/L)购自登封市金博农药化工有限公司,三叶期杂草常规用量为300~450mL/hm2㊂烟嘧磺隆可分散油悬浮剂(40g/L)购自江苏长青生物科技有限公司,三叶期杂草常规用量为750~1500 mL/hm2㊂1.2㊀EMS诱变处理干种子EMS处理方法参照WU等[28]和TILL 等[29]的方法稍有改动㊂干种子于室温浸种16h,滤干水,分别用0.4%㊁0.6%㊁0.8%㊁1.0%㊁1.2%㊁1.6%EMS溶液(EMS溶液用0.1mol/L磷酸缓冲液配制,pH值7.2)于26ħ恒温摇床(60r/min)中浸泡8h(每个剂量处理200粒种子),然后在28ħ发芽箱中催芽36~48h,调查发芽率,确定半致死浓度,然后以该浓度对干种子进行处理(同上),在28ħ发芽箱中催芽36~48h,之后播种㊂采用常规湿润育秧,常规单本插植,M1成熟时每株收获一穗,不脱粒,晒干㊂1.3㊀抗除草剂突变体筛选M2幼苗三叶期时,喷施112.5g/hm2的24%甲咪唑烟酸筛选抗除草剂突变体,喷施60g/hm2烟嘧磺隆筛选抗烟嘧磺隆突变体,处理14d筛选抗除草剂的M2家系,筛选标准:相比绝大部分敏感株系能正常生长,株高接近正常,叶色偏绿㊂2017㊁2018㊁2019年连续3a用甲咪唑烟酸筛选M2家系,2017年筛选3000份,2018㊁2019年各筛选30000份M2家系;2019年以烟嘧磺隆筛选30000份M2家系㊂M2抗除草剂突变体家系加代时用除草剂筛选,筛选方法同上,选择幼苗生长正常无死苗的家系留种㊂1.4㊀抗除草剂突变体ALS基因克隆和序列分析根据NCBI网站日本晴(Nipponbare)ALS基因序列(Os02g30630)设计扩增ALS基因全长的引物ALS-F(5ᶄ-GACCCACCTGTCATCCTCATCC-3ᶄ)和ALS-R(5ᶄ-ACATACAAACATCATAGGCATACCACT-3ᶄ)㊂以M3抗除草剂突变体纯合家系及郑稻19基因组DNA为模板,采用TaKaRa PrimeSTAR Max DNA Polymerase扩增ALS基因㊂25μL反应体系: 2ˑPrimeSTAR MaxPremix12.5μL,10μmol/L上㊁下游引物各1.0μL,基因组DNA2.0μL,补加ddH2O至25μL㊂PCR扩增程序:98ħ10s,62ħ15s,68ħ2.5min,30个循环;68ħ5min㊂取5μL PCR产物,用1%琼脂糖凝胶电泳检测,DNA 片段大小符合预期时,剩余PCR产物送宝生物工程(大连)有限公司进行克隆并测序㊂根据测序结果,采用DNAStar-MegAlign软件分析野生型和突变体ALS基因的DNA序列差异,确定抗除草剂突变体的ALS基因突变位点㊂1.5㊀突变体后代家系抗除草剂性能鉴定用营养钵(17cmˑ10cmˑ10cm)装过筛细土,将M3纯合家系种子和郑稻19种子播于土表,每钵播种子100粒,播后盖细土,厚约1cm,营养钵放置于整理箱中(保持水深3cm),整理箱置于人工气候室中,光强10000lx,光12h/暗12h,温度25~ 28ħ,相对湿度70%~85%㊂一叶期时间苗,每营养钵留生长一致的幼苗30株㊂三叶期时,分别喷施56.25㊁112.5㊁225㊁450㊁900g/hm2甲咪唑烟酸,15㊁30㊁60㊁120㊁240g/hm2的烟嘧磺隆,以喷水为对照; 14d后调查秧苗的生长情况,称取6株秧苗鲜质量, 3次重复,计算各处理的鲜质量减退率,计算公式为:鲜质量减退率=(对照组每株鲜质量-处理组每株鲜质量)/对照组每株鲜质量ˑ100%㊂01㊀第4期王付华等:利用EMS诱变创制抗除草剂粳稻新种质2㊀结果与分析2.1㊀郑稻19干种子EMS诱变剂量的确定由表1可知,随EMS用量增加,郑稻19种子发芽率下降,0.8%㊁1.0%㊁1.2%EMS处理下发芽率分别为60.2%㊁51.3%㊁39.0%,1.0%为半致死剂量㊂因此,确定以1.0%EMS进行诱变处理㊂表1㊀郑稻19干种子径不同体积分数EMS处理后的发芽率Tab.1㊀Germination rate of dry Zhengdao19seeds after treated by different concentrations of EMS%指标IndexEMS体积分数/%EMS concentration00.40.60.8 1.0 1.2 1.4 1.6发芽率Germination rate94.277.571.160.251.339.014.00.02.2㊀水稻抗除草剂突变体的筛选M2幼苗三叶期,喷施甲咪唑烟酸,喷施后14d,敏感植株叶片黄化㊁生长明显受抑制;抗除草剂植株能正常生长,株高明显高于敏感植株,叶色偏绿(图1A F)㊂2017 2019年用甲咪唑烟酸共筛选63000份M2家系,获得抗除草剂突变体6份,其中2017年1份(HF1,图1A)㊁2018年2份(HF2㊁HF3,图1B㊁C)㊁2019年3份(HF4㊁HF5㊁HF6)(图1D㊁E㊁F)㊂综上,甲咪唑烟酸处理后,HF1HF2㊁HF3㊁HF4㊁HF5和HF6生长正常,说明这些突变体具有良好的抗甲咪唑烟酸性㊂2019年用烟嘧磺隆筛选M2家系30000份,三叶期喷施烟嘧磺隆,喷施后14d,敏感植株叶片枯黄㊁植株矮小,停止生长,逐渐死亡;抗性植株生长受抑制,再过7d慢慢恢复正常生长,共筛选获得抗除草剂突变体2份(HF7和HF8)(图1G㊁H)㊂综上,烟嘧磺隆处理后,HF7和HF8表现受害症状,但能逐渐恢复正常生长,说明这些突变体具有抗烟嘧磺隆能力㊂A F:抗甲咪唑烟酸突变体;G H:抗烟嘧磺隆突变体㊂A:HF1;B:HF2;C:HF3;D:HF4;E:HF5;F:HF6;G:HF7;H:HF8A F:Imazapic-risistant mutants;G H:Nicosulfuron-risistant mutants.A:HF1;B:HF2;C:HF3;D:HF4;E:HF5;F:HF6;G:HF7;H:HF8图1㊀水稻M2抗除草剂突变体筛选Fig.1㊀Screening of herbcide-resisitant rice mutants in M22.3㊀水稻抗除草剂突变体ALS基因序列分析ALS是咪唑啉酮类和磺酰脲类除草剂的靶标,为鉴定突变体ALS基因突变位点,对M3抗除草剂突变体和郑稻19全长ALS基因序列进行分析,发现抗除草剂突变体及郑稻19的ALS基因ORF(Openreading frame)全长均为1935bp,没有内含子,编码644个氨基酸㊂比对抗除草剂突变体㊁郑稻19和日本晴的ALS基因编码序列(图2),发现郑稻19与日本晴ALS基因序列相同㊂HF2和HF5的ALS基因第1880位碱基由G突变为A,使得ALS第627位氨基酸由丝氨酸突变成了天冬酰胺(Ser-627-Asn);HF1㊁HF3㊁HF4和HF6的ALS基因第1883位碱基由G突变为A,使得ALS第628位氨基酸由甘氨酸突变为谷氨酸(Gly-628-Glu)(图2)㊂突变体ALS基因的碱基突变导致其编码蛋白质关键位点氨基酸突变,使得突变体获得抗甲咪唑烟酸能力㊂HF7的ALS基因第511位碱基由C突变为T,使得ALS第171位氨基酸由脯氨酸突变为丝氨酸(Pro-171-11河南农业科学第50卷Ser);HF8的ALS 基因第536位碱基由C 突变为T,使得ALS 第179位氨基酸由丙氨酸突变为缬氨酸(Ala -179-Val)(图2)㊂这2个位点的突变使HF7㊁HF8获得抗烟嘧磺隆能力㊂红框为ALS 蛋白171位㊁179位和628位差异氨基酸,黄框为627位差异氨基酸,下划红线㊁黄线分别为相应的DNA 差异碱基The red boxes indicate the mutated amino acids at sites 171,179and 628of the ALS protein,the yellow box indicates themutated amino acids at site 627,and the underlined red or yellow lines indicate the corresponding discrepant DNA bases图2㊀水稻抗除草剂突变体HF1 HF8与郑稻19㊁日本晴ALS 基因序列及编码氨基酸序列比对(只显示差异部分序列)Fig.2㊀Alignment of ALS gene sequence and encoded amino acid sequence of herbcide-resisitant rice mutants HF1 HF8,Zhengdao 19and Nipponbare (only showing the discrepant sequence )2.4㊀M 2家系抗除草剂突变体出现频率3a 用甲咪唑烟酸筛选63000份M 2家系,获得ALS 氨基酸突变为Ser -627-Asn 的材料2份㊁Gly -628-Glu 的材料4份,突变频率分别为0.0032%㊁0.0063%,相当于获得单碱基突变所致抗除草剂突变体分别需M 2家系31500㊁15750份(表2)㊂用烟嘧磺隆筛选30000份M 2家系,获得2份抗性突变体材料,单个碱基位点突变频率为0.0033%(表2)㊂特定位点抗除草剂突变频率平均为0.0040%,即筛选到ALS 特定单碱基突变需M 2家系23250份(表2),预示筛选30000份M 2家系能获得所希望的抗除草剂单碱基突变㊂2.5㊀抗咪唑啉酮类和磺酰脲类除草剂突变体的抗性鉴定选择纯合HF1(Gly -628-Glu)㊁HF2(Ser -627-Asn)M 3家系,三叶期分别喷施56.25㊁112.5㊁225㊁450㊁900g /hm 2甲咪唑烟酸和15㊁30㊁60㊁120㊁240g /hm 2烟嘧磺隆㊂14d 后,随着喷施剂量增加,喷施甲21㊀第4期王付华等:利用EMS 诱变创制抗除草剂粳稻新种质咪唑烟酸处理的郑稻19生长明显受抑制,生长逐渐停止,缓慢死亡,鲜质量减退率分别为36.91%㊁47.81%㊁47.87%㊁51.80%㊁58.71%㊂在1倍大田常规除草剂用量(112.5g /hm 2)下,突变体HF1㊁HF2鲜质量减退率分别为13.09%㊁20.03%,显著小于郑稻19(P <0.05,图3 4);HF1㊁HF2在900g /hm 2剂量(8倍大田常规除草剂用量)下生长仍正常,郑稻19在4倍大田常规除草剂用量(450g /hm 2)下已死亡(图3E )㊂说明突变体具有强的甲咪唑烟酸抗性㊂表2㊀M 2家系ALS 抗除草剂位点突变频率Tab.2㊀Mutation frequency of herbicide-resistant sites of ALS in M 2lines指标Index突变氨基酸位点Mutation siteSer -627Gly -628Pro -171Ala -179平均AverageM 2家系份数M 2lines number 63000630003000030000突变体份数Mutant number2411突变频率/%Mutation frequency0.00320.00630.00330.00330.0040ALS 单碱基突变需M 2家系份数M 2lines number needed for mutation of single base in ALS3150015750300003000023250A F:甲咪唑烟酸剂量分别为0㊁56.25㊁112.5㊁225㊁450㊁900g /hm 2A F:Imazapic doses are 0,56.25,112.5,225,450,900g /ha respectively图3㊀突变体HF1和HF2在不同剂量甲咪唑烟酸下的抗性鉴定Fig.3㊀Resistance identification of HF1and HF2mutants under different doses of imazapic㊀㊀喷施烟嘧磺隆处理的郑稻19生长停滞,逐渐死亡,鲜质量减退率分别为52.48%㊁54.77%㊁60.19%㊁60.20%㊁61.48%(图5 6)㊂在30g /hm 2和60g /hm 2烟嘧磺隆下,突变体HF1㊁HF2鲜质量减退率分别为24.81%㊁13.13%和34.13%㊁28.01%,显著小于郑稻19(P <0.05),超过60g /hm 2突变体HF1㊁HF2鲜质量减退率与郑稻19差异变小,说明突变体具有一定烟嘧磺隆抗性㊂HF2鲜质量减退率始终低于HF1,说明HF2突变体比HF1突变体有更强的烟嘧磺隆抗性㊂图4㊀突变体HF1和HF2在不同剂量甲咪唑烟酸下的鲜质量减退率Fig.4㊀The fresh weight reduction rate of HF1and HF2mutants under different doses of imazapic31河南农业科学第50卷A F:烟嘧磺隆剂量分别为0㊁15㊁30㊁60㊁120㊁240g /hm 2A F:Nicosulfuron doses are 0,15,30,60,120,240g /ha respectively图5㊀突变体HF1和HF2在不同剂量烟嘧磺隆下的抗性鉴定Fig.5㊀Resistance identification of HF1and HF2mutants under different doses ofnicosulfuron图6㊀突变体HF1和HF2在不同剂量烟嘧磺隆下的鲜质量减退率Fig.6㊀The fresh weight reduction rate of HF1and HF2mutants under different doses of nicosulfuron3㊀结论与讨论3.1㊀抗除草剂突变体筛选利用EMS 诱变群体筛选抗除草剂突变体,一般在M 2 M 4进行[28-30],早代选择能减少加代次数,减轻工作量,M 2是变异最大的世代,在M 2进行抗性筛选是有利的㊂从M 1植株上收获M 2种子时可以选择混收[31],也可按家系收㊂本研究每个M 2家系收1个单穗,2017年筛选3000M 2家系,分株系(单穗)常规密度(8.6穗/m 2)播种,占用秧田面积达350m 2,筛选到抗性突变体1份;2018㊁2019年单穗高密度种植(45穗/m 2),分别筛选30000㊁60000份M 2家系,每30000份材料播种面积控制在700m 2,极大地压缩了筛选用秧田面积,2018㊁2019年分别筛选到抗性突变体2㊁5份,说明高密度稻穗直接播种筛选苗期抗除草剂突变体可行,大幅减轻了工作量㊂另外,M 2单穗分株系播种,抗除草剂突变体以家系整体出现,易于鉴别,也减轻了后期突变体鉴定工作量(混收混种时同一M 2抗性突变体家系幼苗随机分布大田,多个突变单株可能来自同一个M 2株系,增加鉴别难度,也增加后期突变体抗性鉴定㊁基因克隆等工作)㊂3.2㊀抗除草剂突变体的出现频率大剂量EMS 处理,突变频率高,容易获得足量的点突变,广泛用于构建饱和突变体库,如用于TILLING [28-30,32]㊂WU 等[28]估计较大剂量(0.8%~1.0%)EMS 诱变水稻,每个M 2家系平均有100个以上的突变位点㊂TILL 等[29]以1.5%EMS 处理粳稻品种日本晴,发现每294kb DNA 片段有1个碱基突变㊂MARTÍN 等[30]利用高剂量EMS 处理获得拟南芥突变体库,通过TILLING 检测14个基因的突变事件,发现每个基因平均有16个错义突变,即每89kb DNA 片段有1个碱基突变㊂本研究中,以半致死剂量(1.0%)EMS 处理水稻干种子,用甲咪唑烟酸筛选63000份M 2家系,得到6份抗性突变体材料,包括2个突变位点,即Ser -627-Asn㊁Gly -628-Glu,突变频率分别为0.0032%㊁0.0063%,相当于获得单碱基突变所致抗除草剂突变体分别需M 2家系31500㊁15750份㊂以烟嘧磺隆筛选30000份41㊀第4期王付华等:利用EMS诱变创制抗除草剂粳稻新种质M2家系,获得2份抗性突变体材料(Pro-171-Ser㊁Ala-179-Val),单个位点突变频率为0.0033%㊂特定位点抗除草剂突变频率平均为0.0040%,即筛选到ALS特定单碱基突变需M2家系23250份㊂这为EMS诱变时M2群体规模的控制和筛选家系数量的确定提供了参考㊂3.3㊀ALS基因突变及对除草剂的靶标抗性杂草对ALS抑制剂类除草剂的抗性包括非靶标抗性和靶标抗性,靶标抗性主要指由于靶标酶基因突变,靶标酶与除草剂结合受阻,或靶标酶增强表达而产生抗性;非靶标抗性是指通过减少除草剂的吸收传导㊁提高除草剂的代谢及屏蔽隔离除草剂等方式产生抗性[14]㊂ALS基因突变导致编码蛋白质序列关键位点出现氨基酸替换,改变酶与除草剂结合能力,除草剂除草能力降低或丧失[10-11]㊂对以ALS为靶标的抗性杂草研究发现,ALS的突变主要发生在8个氨基酸位点:Ala-122㊁Pro-197㊁Ala-205㊁Asp-376㊁Arg-377㊁Trp-574㊁Ser-653和Gly-654[12];在拟南芥中研究发现,ALS蛋白中有20多个位点的氨基酸替换会产生除草剂抗性,不同位点突变所抗除草剂种类有差异[13-14]㊂水稻中已公开报道的ALS抗除草剂突变位点至少有Gly-95㊁Ala-96㊁Gly-136㊁Pro-171㊁Ala-179㊁Trp-548㊁Ser-627㊁Gly-628㊁Val-643等[15-27]㊂本研究通过用除草剂筛选EMS诱变的郑稻19M2家系,获得8份抗除草剂突变体材料,包括4种突变类型㊂Ser-627-Asn和Gly-628-Glu突变类型材料主要抗咪唑啉酮类[14],本研究中HF1㊁HF2在喷施8倍大田常规除草剂剂量的甲咪唑烟酸(900g/hm2)后仍能正常生长,表现强的除草剂抗性,是优良抗除草剂材料,可作为抗性基因供体用于抗除草剂品种选育㊂研究报道,用咪唑啉酮类除草剂筛选到的ALS基因突变抗性水稻系AS3510(Gly-628-Glu),还对多种磺酰脲类除草剂产生抗性[33]㊂本研究发现,对抗甲咪唑烟酸突变体HF1㊁HF2分别喷施1倍(30g/hm2)㊁2倍(60g/hm2)大田常规除草剂剂量的烟嘧磺隆,鲜质量减退率显著小于郑稻19,说明HF1㊁HF2兼具一定烟嘧磺隆抗性㊂本研究筛选的2个抗烟嘧磺隆突变体HF7(Pro-171-Ser)和HF8(Ala-179-Val),在喷施60g/hm2烟嘧磺隆后表现前期受抑制,但能缓慢恢复,说明有一定抗性㊂这与前期报道的拟南芥中ALS氨基酸Ala-205 (水稻Ala-179)㊁Pro-197(水稻Pro-171)位点突变产生磺酰脲类除草剂抗性[14]一致㊂研究证明,在1个材料中使ALS基因2个或2个以上抗性位点同时突变,能增强除草剂抗性[34-35],是创制强抗除草剂材料的有效途径㊂设想未来利用获得的抗性突变体进行二次诱变,筛选多位点突变抗除草剂材料,以增强抗性,获得能应用于生产的抗烟嘧磺隆种质;或通过基因编辑创制多位点突变的强抗烟嘧磺隆材料㊂参考文献:[1]㊀肖国樱,肖友伦,李锦江,等.高效是当前水稻育种的主导目标[J].中国水稻科学,2019,33(4):287-292.XIAO G Y,XIAO Y L,LI J J,et al.High efficiency is adominant target for current rice breeding[J].ChineseJournal of Rice Science,2019,33(4):287-292. [2]㊀陈雷,金曼,张维乐,等.杂草稻的特性及其危害与防治研究进展[J].作物学报,2020,46(7):969-977.CHEN L,JIN M,ZHANG W L,et al.Research advanceson characteristics,damage and control measures of weedyrice[J].Acta Agronomic Sinica,2020,46(7):969-977.[3]㊀FARTYAL D,AGARWAL A,JAMES D,et al.Developingdual herbicide tolerant transgenic rice plants forsustainable weed management[J].Scientific Reports,2018,8(1):1-12.[4]㊀International Service for the Acquisition of Agri-biotechApplications.Global status of commercialized biotech/GMcrops in2018[EB/OL].[2021-02-19].https://www./resources/publications/briefs/54/default.asp.[5]㊀NEWHOUSE K,SINGH B,SHANER D,et al.Mutationsin corn(Zea mays L.)conferring resistance toimidazolinone herbicides[J].Theoretical and AppliedGenetics,1991,83(1):65-70.[6]㊀SWANSON E B,HERRGESELL M J,ARNOLDO M,etal.Microspore mutagenesis and selection:Canola plantswith field tolerance to the imidazolinones[J].Theoreticaland Applied Genetics,1989,78(4):525-530. [7]㊀GARCIA M D,NOUWENS A,LONHIENNE T G,et al.Comprehensive understanding of acetohydroxyacidsynthase inhibition by different herbicide families[J].Proceedings of the National Academy of Sciences of theUnited States of America,2017,114(7):E1091-E1100.[8]㊀SHOBA D,RAVEENDRANM,MANONMANI S,et al.Development and genetic characterization of a novelherbicide(imazethapyr)tolerant mutant in rice(Oryzasativa L.)[J].Rice,2017,10(1):10.[9]㊀张云月,卢宗志,李洪鑫,等.杂草对乙酰乳酸合成酶抑制剂类除草剂抗药性的研究进展[J].杂草科学,2013,31(2):1-5.ZHANG Y Y,LU Z Z,LI H X,et al.Research progress onweed resistance to acetolactate synthase inhibitors[J].Weed Science,2013,31(2):1-5.[10]㊀DUGGLEBY R G,PANG S S.Acetohydroxyacid synthase[J].BMB Reports,2000,33(1):1-36. [11]㊀DUGGLEBY R G,MCCOURT J A,GUDDAT L W.Structure and mechanism of inhibition of plantacetohydroxyacid synthase[J].Plant Physiology andBiochemistry,2008,46:309-324.[12]㊀YU Q,HAN H P,VILA-AIUB M M,et al.AHASherbicide resistance endowing mutations:Effect on51河南农业科学第50卷AHAS functionality and plant growth[J].Journal ofExperimental Botany,2010,61(14):3925-3934. [13]㊀HEAP I.International survey of herbicide resistant weeds[EB/OL].(2021-02-05)[2021-02-19].http://www..[14]㊀YU Q,POWLES S B.Resistance to AHAS inhibitorherbicides:Current understanding[J].Pest ManageScience,2014,70(9):1340-1350.[15]㊀SUDIANTO E,BENG-KAH S,TING-XIANG N,et al.Clearfield rice:Its development,success,and keychallenges on a global perspective[J].Crop Protection,2013,49:40-51.[16]㊀SHA X Y,LINSCOMBE S D,GROTH D E.Fieldevaluation of imidazolinone-tolerant Clearfield rice(Oryza sativa L.)at nine louisiana locations[J].CropScience,2007,47(3):1177-1185.[17]㊀TAN S,EVANS R R,DAHMER M L,et al.Imidazolinone-tolerant crops:History,current status andfuture[J].Pest Management Science,2005,61(3):246-257.[18]㊀GOULART I C G R,MATZENBACHER F O,MEROTTOA J R.Differential germination pattern of rice cultivarsresistant to midazolinone herbicides carrying differentacetolactate synthase gene mutations[J].WeedResearch,2012,52(3):224-232.[19]㊀OKUZAKI A,SHIMIZU T,KAKU K,et al.A novelmutated acetolactate synthase gene conferring specificresistance to pyrimidinyl carboxy herbicides in rice[J].Plant Molecular Biology,2007,64:219-224. [20]㊀陈竹锋,王承旭,柳威,等.水稻抗除草剂蛋白及其在植物育种中的应用:CN201210037789.9[P].2013-04-17.CHEN Z F,WANG C X,LIU W,et al.Rice herbicideresistant protein and its application in plant breeding:CN201210037789.9[P].2013-04-17. [21]㊀赵炳然,袁定阳,韶也,等.一种水稻抗除草剂蛋白与基因及其应用:CN106867977A[P].2017-06-20.ZHAO B R,YUAN D Y,SHAO Y,et al.Application ofrice herbicide-resistant protein and gene:CN106867977A[P].2017-06-20.[22]㊀张保龙,陈天子,王金彦,等.粳稻的ALS突变型基因及其蛋白和应用:CN106868028A[P]:2017-06-20.ZHANG B L,CHEN T Z,WANG J Y,et al.Applicationof japonica rice ALS mutant gene and its protein:CN106868028A[P]:2017-06-20.[23]㊀张保龙,陈天子,王金彦,等.粳稻ALS突变型基因及其蛋白在抗除草剂方面的应用:CN106868027A[P].2017-06-20.ZHANG B L,CHEN T Z,WANG J Y,et al.Applicationof japonica rice ALS mutantgene and its protein inherbicide resistance:CN106868027A[P].2017-06-20.[24]㊀张保龙,凌溪铁,王金彦,等.使植物具有除草剂抗性的水稻ALS突变型蛋白㊁基因及其应用:CN107090447A[P].2017-08-25.ZHANG B L,LING X T,WANG J Y,et al.Rice ALSmutant protein,gene and application that making plantshave herbicide resistance:CN107090447A[P].2017-08-25.[25]㊀张保龙,王金彦,凌溪铁,等.使植物具有除草剂抗性的水稻ALS突变型蛋白及其应用:CN108004224A[P].2018-05-08.ZHANG B L,WANG J Y,LING X T,et al.Rice ALSmutant protein and application that making plants haveherbicide resistance:CN108004224A[P].2018-05-08.[26]㊀王芳权,杨杰,范方军,等.水稻抗咪唑啉酮类除草剂基因ALS功能标记的开发与应用[J].作物学报,2018,44(3):324-331.WANG F Q,YANG J,FAN F J,et al.Development andapplication of the functional marker for imidazolinoneherbicides resistant ALS gene in rice[J].ActaAgronomica Sinica,2018,44(3):324-331. [27]㊀毕俊国,谭金松,刘毅,等.抗咪唑啉酮类除草剂水稻种质的筛选鉴定[J].植物遗传资源学报,2020,21(4):804-808.BI J G,TAN J S,LIU Y,et al.Screening and identificationof rice germplasm resistant to imidazolinone herbicide[J].Journal of Plant Genetic Resources,2020,21(4):804-808.[28]㊀WU J L,WU C,LEI C,et al.Chemical-and irradiation-induced mutants of indica rice IR64for forward andreverse genetics[J].Plant Molecular Biology,2005,59:85-97.[29]㊀TILL B J,COOPER J,TAI T H,et al.Discovery ofchemically induced mutations in rice by TILLING[J].BMC Plant Biology,2007,7:19.[30]㊀MARTÍN B,RAMIRO M,MARTÍNEZ-ZAPATER J M,et al.High-density collection of EMS-induced mutationsfor TILLING in Landsberg erecta genetic background ofArabidopsis[J].BMC Plant Biology,2009,9:147. [31]㊀陈天子,余月,凌溪铁,等.EMS诱变水稻创制抗咪唑啉酮除草剂种质[J].核农学报,2021,35(2):253-261.CHEN T Z,YU Y,LING X T,et al.Screening ofimidazolinone-resistant rice from EMS-mutated populations[J].Journal of Nuclear Agricultural Sciences,2021,35(2):253-261.[32]㊀KUROWSKA M,DASZKOWSKA-GOLEC A,GRUSZKAD,et al.TILLING:A shortcut in functional genomics[J].Journal of Applied Genetics,2011,52(4):371-390.[33]㊀WEBSTER E P,MASSON J A.Acetolactate synthase-inhibiting herbicides on imidazolinone-tolerant rice[J].Weed Science,2001,49(5):652-657.[34]㊀BUFFON G,LAMB T I,LOPES M C B,et al.Push it tothe limit:Identification of novel amino acid changes onthe acetolactate synthase enzyme of rice that putativelyconfer high level of tolerance to different imidazolinones[J].Frontiers in Bioengineering and Biotechnology,2020,8:73.[35]㊀OSAKABE K,ENDO M,KAWAI K,et al.The mutantform of acetolactate synthase genomic DNA from rice isan efficient selectable marker for genetic transformation[J].Molecular Breeding,2005,16(4):313-320.61。

高粱种子EMS诱变处理的研究

[11] 冯鹏，温定英，孙启忠．种植密度对玉米产量及青贮品质的影响[J]．草业科学，2011，28（12）：2203-2208[12] 李向拓，吴权明，毛建昌．饲用玉米育种要求性状特征及研究进展[J]．西北农业学报，2003，12（2）：36-40[13] 郭莹，覃鸿妮，蔡一林．密度对不同株型玉米产量及主要农艺性状的影响[J]．西南师范大学学报：自然科学版，2012，37（6）：57-61 [14] 杨耿斌．不同种植密度对早熟玉米品种克单12号产量及构成因素的影响[J]．农业科技通讯，2008（12）：35-36[15] 李宁，翟志席，李建民，等．密度对不同株型的玉米农艺、根系性状及产量的影响[J]．玉米科学，2008，16（5）98-102[16] 杨耿斌，谭福忠，王新江，等．不同密度对青贮玉米产量与品质的影响[J]．玉米科学，2006，14（5）：115-117[17] 薛吉全，梁宗锁，马国胜，等．玉米不同株型耐密性的群体生理指标研究[J]．应用生态学报，2002，13（1）：55-59[18] 马国胜，薛吉全，路海东，等．不同类型饲用玉米群体光合生理特性的研究[J]．西北植物学报，2005，25（3）：536-540[19] 左淑珍，王光申，汤金涛，等．种植密度对青贮玉米主要农艺性状及产量的影响[J]．黑龙江农业科学，2013（7）：13-15[20] 孙贵臣，任元，马晓磊，等．不同种植密度对青贮玉米生物产量及主要农艺性状的影响[J]．山西农业科学，2013，41（2）：146-148 [21] 常程，张书萍，刘晶，等．密度对不同株型玉米产量和农艺性状的影响[J]．辽宁农业科学，2008（2）：27-29[22] 曹修才，侯廷荣．玉米空秆的成因及防止对策[J]．玉米科学，1995，3（2）：37-38[23] 张新跃，李元华，张瑞珍，等．“饲用玉米——黑麦草”草地农业系统的研究——不同密度对青贮饲用玉米生产效果的影响[J]．草业科学，2006，23（2）：54-56[24] 张晓艳，董树亭，王空军，等．不同类型饲用作物营养成分的比较研究[J]．作物学报，2005，31（10）：1344-1348[25] 张吉旺，胡昌浩，王空军，等．种植密度对全株玉米饲用营养价值的影响[J]．中国农业科学，2005，38（6）：1126-1131[26] 路海东，薛吉全，郝引川，等．密度对不同类型青贮玉米饲用产量及营养价值的影响[J]．草地学报，2014，22（4）：865-870（收稿日期：2017-12-20）高粱种子EMS诱变处理的研究白鸿雁　杨　伟　武　擘（山西省农业科学院高粱研究所，晋中030600）摘要：为了探明化学诱变剂EMS对高粱种子的诱变处理效果，进行了不同EMS浓度、不同EMS处理时间对R111种子发芽率和成苗率影响的试验，并在适宜浓度和处理时间下，比较了6种基因型的发芽率、发芽势和成苗率。

石蜡油-EMS花粉诱变技术

EMS(EthylMethaneSulfonate,甲基磺酸乙酯)是一种烷化剂,其诱变机理是通过与核苷酸中的嘌呤、嘧啶分子直接反应来诱发突变。

EMS诱发的突变体主要通过两个步骤完成:首先鸟嘌呤的O6位置被烷基化,而后在DNA复制过程中,烷基化的鸟嘌呤与胸腺嘧啶配对,导致碱基交换,即G∶C变为A∶T,形成点突变。

早在60年代,人们就已开始采用EMS水溶液处理植物种子,但诱变效率很低。

自Neuffer 等(1978)将EMS溶于石蜡油中处理玉米花粉获得成功后,石蜡油_EMS处理花粉诱变技术在国外广泛应用起来。

Greaves等(1986)采用含0.667×10-3EMS的石蜡油处理玉米自交系的成熟花粉40min,在M2代施以除草剂的筛选环境,获得抗除草剂Pursuit突变体,该突变体含抗除草剂显性基因。

1987年美国ICI种子公司用EMS处理花粉获得糯质、甜质玉米突变体。

张铭堂(1989)采用该技术获得诱变率为0·2%的糯质基因。

据报道,AllenWright等在M3后代中筛选出10个高赖氨酸突变材料。

中国农业大学等单位开展了特用玉米突变体的筛选研究。

石蜡油_EMS花粉诱变技术,由于诱变剂直接作用于配子,具有诱变率高,诱变范围广,且产生的突变体多为点突变的特点,较传统电离辐射优越。

研究表明,石蜡油_EMS处理花粉,平均每个位点上单个基因的隐性和显性突变率可达千分之一和万分之一以上,可以在较大的诱变后代群体中筛选出目标突变体。

该技术将是改良自交系和进行种质创新的有效工具。

诱变剂：EMS(甲基磺酸乙酯)，德国产。

载体剂：液体石蜡天津产。

诱变处理：参照Neuffer的花粉诱变方法，具体见参考文献31。

(4)诱变材料种植:为了处理方便和工作人员安全,该处理自交系(Mo)行距加宽到75cm,株距按常规种植;(5)Mo预处理:提前根除杂株;在诱变的前一天下午,雌穗剪苞叶,雄穗去掉老花药后分别套袋。

化学诱变剂EMS对胡麻种子的诱变效应

化学诱变剂EMS对胡麻种子的诱变效应作者：王斌赵利侯静静来源：《寒旱农业科学》2022年第10期摘要：EMS诱变是创造突变体，创新种质和品种改良的有效手段。

为探讨化学诱变剂EMS对胡麻种子的诱变效应，设置5个EMS浓度和4个处理时间对5个胡麻品种进行诱变处理。

结果表明，EMS诱变处理对不同胡麻品种农艺性状的影响差异比较大，变异比较丰富。

在不同胡麻品种间，EMS诱变对种子出苗期、成苗数的影响存在差异，在不同籽粒颜色的品种间差异更显著。

胡麻植株表型变异出现了黄化苗、畸形花、花瓣不展开、花瓣颜色变异株、分茎和分枝多，茎扁平、簇头、早熟、不育等类型，这些变异丰富了胡麻突变体库；通过EMS诱变产生的突变体，可为胡麻品种改良和种质创新提供优异资源。

关键词：EMS诱变；胡麻品种；种子出苗；农艺性状中图分类号：S563.2 文献标志码：A 文章编号：2097-2172（2022）01-0073-05doi：10.3969/j.issn.2097-2172.2022.01.014Mutagenic Effects of Chemical Mutagen EMS on Flax SeedWANG Bin， ZHAO Li， HOU Jingjing（Crop Research Institute， Gansu Academy of Agricultural Sciences， Lanzhou Gansu 730070， China）Abstract： EMS mutagenesis is an effective method in mutantcreation， germplasm innovation and improvement. In order to investigate the mutagenic effect of EMS on flax seeds， 5 flax cultivars were mutagenic treated with 5 concentrations of EMS and 4 treatment times. The results showed that the effects of EMS mutagenesis on agronomic traits were different among different flax cultivars，which showed great variations. EMS mutagenesis on seed emergence and seedling number were different among different flax cultivars， and the differences were more significant among cultivars with different seed color. The phenotypic variation of flax plants included etiolated seedlings，deformed flowers， petals not expanded， petal color variation， multiple branches and branches，flat stems， cluster heads， early maturation and sterility， which enriched the mutant library of flax plants. The effects of EMS mutagenesis treatment on agronomic characters of different flax cultivars were different， and the variation was abundant. The mutants produced by EMS provided excellent resources for the improvement of flax cultivars and germplasm innovation.Key words： EMS mutagenesis; Flax variety; Emergence of seed; Agronomic trait胡麻是我國西北和华北重要的油料作物之一。

EMS诱变技术在植物育种中的研究进展

EMS诱变技术在植物育种中的研究进展刘翔【摘要】甲基磺酸乙酯（Ethyl methane sulfonate，EMS）是一种常用的化学诱变剂，能诱发产生高密度的系列等位基因点突变。

在当前种质资源极为匮乏，基因资源日益枯竭的状况下，采用EMS诱发突变技术创造有用基因资源具有极其重要的意义。

本文通过对EMS的诱变原理和技术要领、应用实例、以及该技术在现代分子生物学中的应用前景加以阐述，对EMS诱变技术在农业生产中的应用具有重要作用。

%Ethyl methane sulfonate is a normal chemical mutagen and induce high density of gene mutations.At pres-ent,germplasm and genetic resources are extremely scarce,it is significant to create useful genetic resource by EMS mu-tation.We state here the principles and technical characteristics,examples,and the outlook of its application in modern molecular biology,which is important for applying EMS mutagenesis techniques on agricultural production.【期刊名称】《激光生物学报》【年(卷),期】2014(000)003【总页数】5页(P197-201)【关键词】甲基磺酸乙酯;诱变剂;基因突变【作者】刘翔【作者单位】上海辰山植物园，中国科学院上海辰山植物科学研究中心，上海201602【正文语种】中文【中图分类】Q3190 引言变异是自然界物种进化和选择过程中一个重要的生理现象，是物种进化的原动力，也是保证生物多样性的前提。

EMS诱变技术研究概况及应用进展

92--专论•综述　引用格式：谢玲玲，周火强，弭宝彬，等. EMS 诱变技术研究概况及应用进展[J]. 湖南农业科学，2020（6）：92-95.　DOI:10.16498/ki.hnnykx.2020.006.024EMS （Ethyl Methane Sulfonate ，甲基磺酸乙酯）是一种烷化剂，其诱变机理是通过与核苷酸中的嘌呤、嘧啶分子直接反应来诱发突变。

EMS 诱发形成突变体主要通过两个步骤完成：首先鸟嘌呤的C6位置被烷基化，而后在DNA 复制过程中，烷基化的鸟嘌呤与胸腺嘧啶配对，导致碱基交换，即G ：C 变为A ：T ，形成点突变[1]。

采用EMS 作为诱变剂，具有易操作、成本低、专一性强，产生点突变频率高，出现染色体畸变频率低等优势[2]。

EMS 作为一种高效、稳定的化学诱变剂，是当前构建大规模饱和突变体库的理想诱变方法[3-5]，目前在诱变育种中应用最为广泛，效果也最好。

早在20世纪60年代，人们就已开始采用EMS 水溶液处理植物种子，但诱变效率很低。

自Neuffer 等将EMS 溶于石蜡油中处理玉米花粉获得成功后，石蜡油-EMS 处理花粉诱变技术在国外广泛应用起来[6]。

我国于80年代末期开始进行EMS 诱变研究。

杜连恩等研究发现，平阳霉素（PYM ）后处理能提高甲基磺酸乙醋（EMS ）的诱变效果。

试验结果证明，EMS 处理小麦湿种子附加PYM 后处理的MZ 代植株诱变频率为8.9%~19.2 %，较EMS （5.7%）单独处理的效果提高了1.5~3.0倍。

此为我国有文献报道的最早的EMS 诱变相关的研究，进入21世纪后，我国EMS 诱变研究迅速发展。

1　EMS 诱变材料EMS 诱变可选取的材料十分广泛，除模式作物拟南芥外，几乎涵盖了整个植物界，其中粮食类作物如水稻、玉米、小麦、高粱、荞麦、马铃薯等；经济作物如油菜、大豆、棉花、烟草、木薯、亚麻荠、花生、芝麻、甘蔗、花椒等；蔬菜类如大白菜、冬瓜、黄瓜、苦瓜、茄子、芥菜、番茄、卷心菜、豇豆、山药、紫苏等；水果类如西瓜、猕猴桃、甜橙、草莓、菠萝、越橘等；花卉类如兰花、长春花，蓝花丹等；树木类如杨树等；草类如狗牙根、黄花苜蓿、蒺藜苜蓿、扁蓿豆、红豆草、多枝赖草、高羊茅等，药用植物如党参等；菌类如枯草芽孢杆菌、酵母等；藻类如三角褐指藻、小球藻等；甚至于原生质体也已成为EMS 诱变的材料。

EMS诱变技术及其在小麦研究中的应用进展

EMS 诱变技术及其在小麦研究中的应用进展李雪1,2,裴自友1,2,温辉芹1,2,程天灵1,2,张立生1,2,朱玫1,2,王宏兵1,2（1.山西省农业科学院作物科学研究所，山西太原030031；2.农业部黄土高原作物基因资源与种质创制重点实验室，山西太原030031）摘要:甲基磺酸乙酯（EMS ）是一种常用的化学诱变剂，能诱发产生高频率的基因和染色体突变。

近年来，依托突变体的创建为基础的基因定位、克隆和功能基因研究得以迅速拓展。

从小麦EMS 诱变、最佳处理剂量与表型、生理生化、分子标记鉴定，产量、品质、抗逆、抗感病等关键性状突变体筛选以及小麦异源易位系创制与诱导小麦条锈菌毒性突变、突变库的利用等多方面对我国在EMS 诱变及其在小麦研究中的应用进展进行了综述，并对EMS 技术的发展前景及趋势进行了展望，以期为今后的诱变育种提供研究参考。

关键词:小麦；甲基磺酸乙酯（EMS ）；诱变中图分类号:S512.1文献标识码:A文章编号:1002-2481（2019）06-1103-04Research Advances in EMS Mutagenesis Technology and Its Application in WheatLI Xue 1，2，PEI Ziyou 1，2，WEN Huiqin 1，2，CHENG Tianling 1，2，ZHANG Lisheng 1，2，ZHU Mei 1，2，WANG Hongbing 1，2（1.Institute of Crop Sciences ，Shanxi Academy of Agricultural Sciences ，Taiyuan 030031，China ；2.Key Laboratory of Crop Gene Resources and Germplasm Enhancement on Loess Plateau ，Ministry of Agriculture ，Taiyuan 030031，China ）Abstract ：Ethyl methane sulfonate （EMS ）is a common chemical mutagen,which can induce high frequency gene and chromosome mutations.In recent years,gene mapping,cloning and functional gene research based on mutant creation have been rapidly expanded.The progress of EMS mutagenesis and its application in wheat research in China was reviewed from the aspects of EMS mutagenesis,optimal treatment dose and phenotype,physiological and biochemical,molecular marker identification,screening of mutants of key traits such as yield,quality,stress resistance and susceptibility,as well as the creation and induction of wheat heterologous translocation lines,the utilization of toxicity mutation and mutation bank of stripe rust,and so on.The development prospects and trends were forecasted to provide research references for mutation breeding in the future.Key words ：wheat;ethyl methane sulfonate （EMS ）;mutagenesis收稿日期:2018-11-16基金项目:山西省农业科学院作物科学研究所青年基金项目（ZQ1702）；山西省农业科学院有机旱作农业研发专项（YCX2018405）；山西省重点研发计划项目（201803D221018-2，201703D221002-1）；山西省农业科学院育种工程项目（17yzgc081）；国家重点研发计划项目（2017YFD0101002）作者简介:李雪（1986-），女，山西晋中人，助理研究员，硕士，主要从事小麦遗传育种研究工作。

玉米自交系9444的创新选育与应用前景

应用EMS化学诱变育种技术，即利用含有甲基配结合，加速新品种的选育
磺酸乙酯（EMS）的石蜡油溶液（浓度为0.3%）处理成
1998年，用瑞德改良系P97、兰卡斯特改良系
熟花粉，尽量打破不利基因的连锁，使多个基因位点 9906、旅大红骨改良系9324、塘四平头改良系昌7-2
发生突变或重组，经过自交分离和系群内回交、自做母本对7个优良系进行一般配合力（GCA）和特殊
玉米育种应用上的前瞻性。
交系如178、P138、87-1、丹598和齐319等。而濮阳
1 9444选育经过
农科院独辟蹊径，引进含有亚热带血缘的海南农家
1994年，引进亚热带种质——海南农家种在我种选育自交系，对其进行适度地改良，从中选择优良
国北方种植，当时该农家种在温带环境中种植表现自交系，在一定程度上增加了玉米种质遗传的多样
性广的濮单6号，濮单6号是我国唯一同时通过东传基础
华北、黄淮海、西北、西南4大区域审定的玉米品种， 20世纪80年代后期，随着美国先锋公司的玉米
濮单6号的成功选育，与玉米自交系9444.的抗逆性杂交种78599的引入，当时我国许多科研院所利用
和广适性密切相关，再现了热带、亚热带玉米种质在外来种质78599选育出了一批含有热带血缘优良自
玉米自交系9444的创新选育与应用前景
王文娟（河南省濮阳市农业科学院濮阳 457000）
摘要：玉米自交系9444以海南农家种为基础材料，经过化学诱变、自交、系群内回交、一般配合力的测定以及测配结合等技术方法选育而成。在选育技术方法上，注重利用现代科学育种技术（化学诱变）与传统的育种方法相结合，克服了热带、亚热带种质资源的光周期敏感性、生育期晚、营养生长优于生殖生长等缺点；重视玉米异质种质资源的引用，尤其引进和利用我国含有热带、亚热带血缘的地方种质，具有新颖性和前瞻性。玉米自交系9444的突出特点：早熟、抗逆性强、配合力高、品质优良等，与瑞德群、旅大红骨群、塘四平头群测配具有较强的杂种优势，应用前景较好。关键词：玉米自交系；9444；选育；应用前景；新颖性；前瞻性

ems突变原理

ems突变原理
EMS（Ethylmethanesulfonate，乙基甲磺酸酯）突变是一种常用的化学诱变剂，其主要作用是通过烷基化DNA分子上的嘌呤和嘧啶碱基，影响mRNA的转录过程，从而导致蛋白质合成紊乱，进而改变植物的性状。

具体来说，EMS突变原理主要包括以下几个方面：
1. 烷基化作用：EMS作为一种诱变剂，能与DNA分子上的嘌呤和嘧啶碱基发生烷基化反应，形成烷基化的DNA分子。

这种烷基化作用主要发生在DNA链的鸟嘌呤和腺嘌呤碱基上，使DNA分子的结构发生变化。

2. 转录异常：烷基化后的DNA分子在转录过程中，会影响RNA聚合酶的活性，导致mRNA的合成异常。

由于RNA聚合酶在阅读DNA模板时，对烷基化引起的碱基改变较为敏感，因此容易产生突变。

3. 蛋白质合成紊乱：突变后的mRNA进入核糖体翻译过程，由于基因密码子的改变，可能导致蛋白质氨基酸序列的改变。

这种改变可能影响到蛋白质的结构和功能，从而表现出植物性状的变异。

4. 遗传变异：EMS突变是一种随机突变过程，突变频率较高。

在植物育种中，这种突变可以为培育新品种提供丰富的遗传资源。

由于EMS突变对染色体损伤较轻，不易引起染色体畸变，因此具有较高的应用价值。

综上所述，EMS突变原理主要涉及烷基化作用、转录异常、蛋白质合成紊乱和遗传变异等方面。

通过这些作用，EMS突变可以产生大量的遗传变异，为植物育种和遗传研究提供丰富的材料。

诱变育种技术在农业育种中的应用

诱变育种技术在农业育种中的应用彭亚莉 2012.1.3生物必修2第五章遗传与变异中可遗传变异的三种类型：基因突变、基因重组合染色体变异。

其中基因突变的应用----诱变育种在农业上的贡献特别大。

诱变育种是指利用各种理化因素诱发变异，再通过选择而培育新品种的方法，与常规育种方法相比，具有方法简便、育种周期短、效果好等特点，其在改良作物品种和创造新种质方面发挥了巨大作用，已成为世界上普遍应用的先进育种方法之一，尤其是与杂交育种技术的结合，育种效果更为显著。

学生们通过各种媒体查阅，分析资料。

整理资料如下：目前在育种上应用的诱变方法有物理诱变法、化学诱变法和空间诱变法等。

1物理诱变法物理诱变法是指利用一些物理因素处理农作物种子、花粉、器官、植株，引起植物染色体发生畸变，诱发出新的可遗传变异，从中筛选出有利变异性状的后代，育成新的品种。

此方法具有诱变频率高、变异范围大、有利变异性状稳定快等优点。

1．1电离辐射诱变这是最早也是应用最广泛的一种诱变方法。

主要是利用χ射线、γ射线、β射线和中子等进行诱变处理。

其中应用最多的是χ射线和1射线。

这些射线能量高、穿透力强，可以使原子的内层电子激活释放，至使原子呈离子化而与其它原子或分子结合，造成共价键断裂，形成染色体结构变异。

试验证明，辐射诱变具有使突变体产生早熟、矮秆、抗病、株型和育性突变的特点，可结合育种目标加以利用。

1．2离子束注入诱变1986年中国科学院等离子物理研究所率先开展了离子注入生物学效应并将此项技术应用于植物育种。

目前已在诱变机理和育种应用上取得重要进展。

离子注入诱变育种具有损伤轻，突变率高和突变谱广的特点，是人工诱变方法的一个新发展。

离子注入植物，可引起能量传递、质量沉积、动量和电荷的交换。

当能量沉积作用于遗传物质时，造成DNA分子的断裂与重接，进而引起染色体结构的易位、倒位、重复、缺失，最后引起基因突变。

目前，离子束注入法已广泛应用于小麦、水稻、棉花、玉米等作物的诱变育种研究。

EMS玉米花粉诱变及根系突变体筛选

中国农业大学硕士学位论文EMS玉米花粉诱变及根系突变体筛选姓名：库来宝申请学位级别：硕士专业：植物营养学指导教师：陈范骏;米国华20070601中国农业大学硕士学位论文第一章引言１．２突变体研究的现状１．２．１玉米突变体库的建立玉米遗传是禾谷类作物研究的最清楚的，截止１９９７年共发现研究了１３４８个突变基因，其中大部分在染色体上确定了位置（详见ＭａｉｚｅＤａｔａｂａｓｅ）．目前对玉米突变体的研究已有很多，国际上已建立了许多专门的突变体数据库．如：美国的ＭａｉｚｅＧｅｎｅｔｉｃｓＣｏｏｐｅｒａｔｉｏｎＳｔｏｃｋＣｅｎｔｅｒ免费提供大部分突变基因的序列和数据信息。

ＲｅｓｃｕｅＭｕＭ妇ＭｕｔａｎｔＰｈｅｎｏｔｙｐｅＤａｔａｂａｓｅ是一个玉米突变体表型数据库，收集了包括种子和穗（１３２５７个表型），幼苗（５２３０个表型）和成株（３３３２个表型）等三种类型突变的表型特征和分析数据来源。

ＭａｉｚｅＧＤＢ是一个基因组数据库，目前已知的几乎所有的玉米突变基因都有可以查到，且有详细的数据信息，包括基因的表达部位、图谱、序列、表型、描述等。

ＰＭＬ（ＰｈｏｔｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃＭｕｔａｎｔＬｉｂｒａｒｙ）是一个研究玉米叶绿体起源的突变体资源库，截至２００５年共收集了有２５００多种突变体。

非光合（ｎｏｎ－ｐｈｏｔｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ）玉米突变体、相应的ＤＮＡ样本和表型等信息。

ＭｔｍＤＢ（ＭａｉｚｅＴａｒｇｅｔｅｄＭｕｔａｇｅｎｅｓｉｓＤａｔａｂａｓｅ）是一个转座子库，目前收集了４３，７７６个ＤＮＡ样本，详细收集了包括家族、表型、品系和ＤＮＡ序列等各种信息。

另外还有其它一些突变体的数据库如：ＭａｉｚｅＥｎｄｏｓｐｅｒｍＦｕｎｃｔｉｏｎａｌＧｅｎｏｍｉｃｓＣｏｎｓｏｒｔｉｕｍ的ＳｅｅｄＭｕｔａｎｔｓＤａｔａｂａｓｅ和ＣｅｌｌＷａｌｌＤａｔａｂａｓｅ等。

１．２．２根系突变体根系突变体的研究已经取得了一些进展，发现了一些有意义的突变体。

高粱种子EMS诱变处理的研究

玉米诱变育种研究进展

ＡｂｔａｔＴｅｔａｉｏａｔｇｎｓｓｂｅｄｎｔｏｓｏｉｅｓｃｓｉｎｚｎａｉｔｏｎｈｍｉａｔｇｎｓｓｓｒｃ：ｈｒｄｔｎｌｍｕａｅｅｌｒｅｉｇｍｅｈｄｆｍａｚｕｈａｏｉｉｇｒｄａｉｎａｄｃｅｃｌｍｕａｅｅｉｉ
大１８种子胚，研究重离子束辐照玉米种子的诱变效０应。结果表明，所用能量和剂量的重离子ｉＬ和Ｃ对
射线和ｐ射线的应用最多。辐射处理的方法分为
外照射和内照射，我国主要采用外照射法。根据照射时间的长短又分为急性照射和慢性照射。一般采用辐照干种子，玉米自交系干种子辐照剂量在１０～５ｙ５２０Ｇ。由于内照射需要一定的设备和防护措施，且放射性同位素被吸收的剂量不易测定，效果不完全一致，在育种上应用较少。周柱华用Ｃ－ｏ射线辐射玉米自交系，剂
积、动量传递、粒子注入和电荷交换等４个原初反应过
程，这些过程联合作用引起强烈的生物学效应。利用低
能重离子在生物诱变育种中轻损伤、高突变率、突变谱广和安全等特点可进行生物诱变育种，创造新种质资源。罗红兵等用重离子ｉＣ分别辐照玉米品种农Ｌ和”
关键词：玉米；诱变育种；电离辐射；激光辐照；ＥＳ花粉诱变Ｍ
中图分类号：￥１５３
文献标识码：Ａ
文章编号：１０．３２０）０－５－０８１１（０８７０４０６０４
ＲｅｅｒｈＰｒｇｅｓｏｕａｅｅｉｅｄｎｃｎｏｏｙｏａｚｓａｃｏｒｓｎＭｔｇｎｓｓＢｒｅｉｇＴｅｈｌｇｆＭｉｅ

EMS诱变及其在构建花生突变体库中的应用

EMS诱变及其在构建花生突变体库中的应用杨秀丽;杨丽萍;宁东贤;赵玉坤;李楠【摘要】EMS具备的较高突变频率在作物育种上被广泛使用.目前栽培种花生遗传背景相同或相似,遗传变异率低,很难产生优异性状.育种家利用EMS对花生进行化学诱变,从后代中筛选、鉴定出一些优异突变体或目的基因.综述了EMS诱变原理与特点、诱变方法和材料的选择、后代突变体的筛选方法和EMS诱变在构建花生突变体库中的应用前景等4个方面.【期刊名称】《山西农业科学》【年(卷),期】2018(046)009【总页数】4页(P1577-1580)【关键词】EMS;花生;化学诱变;突变体库;应用【作者】杨秀丽;杨丽萍;宁东贤;赵玉坤;李楠【作者单位】山西省农业科学院小麦研究所,山西临汾041000;山西省农业科学院小麦研究所,山西临汾041000;山西省农业科学院小麦研究所,山西临汾041000;山西省农业科学院小麦研究所,山西临汾041000;山西省农业科学院小麦研究所,山西临汾041000【正文语种】中文【中图分类】S565.2花生是我国重要油料作物之一，种植面积近466.7万hm2，占全球的29%，总产居国内五大油料作物之首。

在我国，花生的消费主体是榨油，为了满足市场对花生油的需求、提高花生食品品质、延长货架寿命，选育优质专用型花生成为花生育种的主要方向。

在我国，几乎每年都有一些新育成的花生品种被推向市场，但绝大多数推广品种的亲本是“伏花生”和“狮头企”，或者是含有它们的血缘[1]。

优势新品种的选育决定于作物遗传基因多样性的丰富度，过多使用遗传背景相同或相似的亲本材料，会导致栽培种花生基因的大量流失，其遗传基础日益狭窄、遗传变异率低，使得有性杂交重组中无法创造新的基因变异，优异性状的产生受到限制，无法获得在农艺性状和品质上突出的花生品种[2]。

另外，花生是自花授粉作物，它的四倍体栽培种与其二倍体野生种之间存在的倍性差异以及远缘杂交不亲和性，阻碍了它们之间的基因交流，使得花生选育工作很难有突破性的进展[3]。

EMS

收稿日期：０２ｏ６２０－５０
量最高，果穗中的～些籽粒含油量达到１。这些高油突变体与其它性状的关聪主要表现其０
在白化苗所占频率较高，到突变体总数的４以上，Ｍ１代白化苗的平均频率低于１，达０而０显示出高油与白化性状可能存在某种关系。油突变体中还有一个很特别的紫秆显性突变，高其籽粒为白色，油量在９左右。经Ｍ含２和Ｍ３代选择，油突变体含油量基本稳定，别突变高个体分离出含油量达到１．２的高油籽粒．对照经２次选择含油量仍低于５，明ＥＭＳ花３８而表粉诱变的效果是惊人的，速度是传统方法的数倍。此将可能解决传统群体轮回选择速度慢其由的问题，拓与常规自交系选育二环系相似的由单交种后代创造高油种质的新途径一而迅速开从扩大高油种质来源。同时．用ＥＭＳ花粉诱变处理群体，可能加快群体增油速度，成新的利有形
回选择．助于核磁共振技术（借ＮＭＲ）每轮的选择进展虽可达到０６以上。但如将含油量为，．
４普通玉米群体改造为含油量超过ｌ的高油群体仍需要８年以上，就难以适应育种的２这需要。突破这一技术限制，快种质创新速度，课题组从１９为加本８年开始对利用ＥＳ（９Ｍ甲基磺酸乙酯）粉诱变创造高油种质的可行性进行了研究，在２０花并０１年获得了高油突变体。