枯草芽孢杆菌

内生菌在植物体内定殖的研究现状

摘要：检测内生菌在植物体内的定殖动态变化最常规的方法是抗药性标记法，通过目标细菌的自发突变或诱变，筛选出抗高浓度抗生素的突变体，再以此标记株进行回收检测。常用的抗生素有利福平、链霉素等。除了抗药性标记法外，还有免疫学方法，如酶联免疫吸附法(ELISA)、荧光抗体技术、Western印迹法、基因标记法、特异性寡核苷酸片段标记法等也在植物内生菌的检测中广泛应用。

关键词：内生菌定殖荧光标记法绿色荧光蛋白（GFP）

1 内生菌定殖简介

1.1内生菌的概念

内生菌(Plant endophyte)是指在其生活史的一定阶段或全部阶段生活于健康植物的各种组织和器官的细胞间隙或细胞内，不引起植物组织明显症状改变的微生物，这些微生物有细菌、真菌、放线菌等[1]。可通过组织学方法或从严格表面消毒的植物组织中分离或从植物组织内直接产生扩增出微生物DNA的方法来证明其内生[2]。

植物内生细菌已成为国内外的研究热点，目前已从植物中分离得到植物内生细菌，其中有的对宿主植物起到有利作用，而有的则具有潜在的致病性。研究人员利用多种方法对植物内生细菌的内生定殖进行研究，发现了内生细菌在植物体内的定殖规律，随着研究的不断深入，认识的持续提高，植物内生细菌在生态型农业中的应用前景将十分广阔。

1.2内生菌定殖接种方式

接种枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)或其它内生菌等，根据定殖的情况,采用伤根、灌根和叶腋接种法,研究内生菌在植物体内、根表和根际土壤中的定殖动态[3]。内生细菌一般在植物细胞间隙或在植物细胞壁围城的空间内定殖[4]。

内生细菌进入宿主植物体内包括三个阶段．即其对植物的吸附、侵入和定殖。内生细菌对宿主的选择存在一定的专一性,植物内生细菌源于根际土壤，当其在

植物根表附着后就开始侵染宿主并定殖。内生细菌首先进入根皮层，利用某些酶类或物理作用通过皮层间隙纵深进入，在内皮层细胞壁未加厚的位置侵入中柱，之后进入木质部导管，细菌随着植物的生长借助蒸腾作用运送到植物上部营养器官或繁殖器官中,从而定殖于宿主植物体内。

1.3内生菌定殖的应用

在农业生产上，由于植物内生菌与病原菌具有相同的生态位，在植物体内相互竞争空间、营养，使病原菌得不到正常的营养供给而消亡，从而增强宿主抵御病害的能力[5,6]，通过植病生物防治( biological control of plant disease)通过一种或多种生物或其代谢产物来降低植物病原菌的数量或抑制其致病能力而减轻植物病害，为未来生态型农业发展提供了一条重要思路，并且对于替代或减少化肥和农药的使用，改善农业生态系统，保持植物微生态系统的生物多样性，以及维护农田生态平衡实现农业可持续性发展将起到重要作用。

在医药上，植物内生菌代谢产物有抗肿瘤、抗菌，抗病毒的作用等[7]。我国药用植物资源丰富，目前已经从药用植物中分离出多种内生菌，从众多的药用植物内生菌资源中寻找抗肿瘤活性成分已成为当今研究的热点。内生菌代谢产物研究结果发现，药用植物内生菌既可以产生与宿主植物相同的活性成分，也可以产生许多新型的化合物，这为我们筛选抗肿瘤药物提供了一条新的途径。目前，药用植物内生菌代谢产物的抗肿瘤研究才刚刚起步，尚有许多问题有待解决，特别是应加强对药用植物与内生菌互相作用、内生菌改造、代谢调节以及活性成分的化学结构测定等方面的研究。

2 内生菌在植物体内定殖的检测方法

2.1内生菌定殖的检测方法分类

随着对内生细菌的研究深入及分子生物学的发展，在研究植物内生菌在植物体内生长动态研究过程中运用了现代分子生物学技术基因标记法，将标记好的内生菌接种到其宿主植物体内，可以直观的观察到内生细菌是否进入植物体，不同内生细菌的侵染特性、从什么部位进入、在寄主中的定殖部位及其在植物的整个生活史的动态变化等，目前内生菌定殖的检测方法主要有抗生素标记法，免疫学方法，基因标记法等[8]。基因标记法通过转入外源基因，表达后可与环境中其他微生物相区别，如绿色荧光蛋白基因标记法[9]。

2.2绿色荧光蛋白基因标记法

荧光标记法（Fluorescent Labeling ）利用GFP 融合蛋白技术来进行活细胞定位研究，是目前较为通行的一种方法，主要利用荧光蛋白或荧光蛋白基因作为标志物对研究对象进行标记分析[10]。

绿色荧光蛋白（GFP ）常用的是来源于发光水母的一种功能独特的蛋白质，在光镜下进行研究，不需要制样，没有非特异性标记的影响。GFP 经激光扫描共聚集显微镜激光照射后，可产生一种绿色荧光（如图1）。利用GFP 做为目标蛋白[11]，通过转基因技术将其构建到载体上，可跟踪和判断生物细胞的分子变化，从而对蛋白质进行精确定位。该法大致分为三个步骤：一，真核表达载体的构建；二，转染真核细胞；三，激光扫描共聚焦显微镜观察[12]。

绿色荧光蛋白（GFP ）是目前应用最广的蛋白质之一，GFP 有如下的优点： 检测方便， 只需激发光源，不需任何底物或辅助因子； 材料可活体观测， 无需预处理； 植物本身无绿色荧光， 不会有假阳性。因此，它目前在动物、 植物、 微生物的研究中已得到广泛的应用。

3 内生菌定值的发展近况及未来趋势

3.1植物内生菌的动力学研究

植物内生菌的动力学主要指内生菌在植物体内的定殖、分布和运动[13,14]。植物内生菌具有一定的运动性，运动不仅有利于定殖作用，而且可以使内生菌及时避开来自于外环境的生存压力。内生菌一旦进入植物体内就寻找适合自已生存的组织定殖下来，而不是在各组织间到处扩散，

有些学者认为植物内生细菌主要定图1 绿色荧光蛋白照射后产生的绿色荧光

殖在细胞间隙[15]。植物内生菌可以定殖于植物的根毛、叶片、细胞间隙等。

研究表明，植物内生细菌对不同宿主的亲和能力也不一样，内生细菌在植物体内的定殖发生在植物发育的早期，也能发生在成熟的植株中，定殖在同种植物不同组织中的定殖细菌可以在组织之间流动，在植物生长旺盛的分生组织中内生细菌的含量会比较高。

3.2植物内生菌研究方法进展

检测内生菌在植物体内的定殖动态变化最常规的方法是抗药性标记法[16]，通过目标细菌的自发突变或诱变，筛选出抗高浓度抗生素的突变体，再以此标记株进行回收检测。常用的抗生素有利福平、链霉素等。除了抗药性标记法外，还有免疫学方法[17]，如酶联免疫吸附法(ELISA)、荧光抗体技术、Western印迹法、基因标记法、特异性寡核苷酸片段标记法等也在植物内生菌的检测中广泛应用。近年来尤其是GFP（绿色荧光蛋白）的应用，使植物内生菌的检测更加快捷，由于宿主植物生活环境多样性以及内生菌与宿主植物关系的复杂性，有关内生菌在植物内定殖和分布的情况目前都是采用多种研究技术同时分析。

4 结语

植物内生细菌在各领域都有广泛的应用价值,如促进植物生长、抗病虫害、生物固氮、降解有毒害化合物等。在深入研究植物内生细菌几十年中，发现内生菌具有多种生物学功能，能生产多种生物活性物质。对防治细菌病害、病毒病害等都有一定的作用[18,19]，开发应用其资源菌不仅能解决农药带来的坏境问题，并且有的内生菌还可以降解环境污染物[20]。因此，植物内生菌定殖的应用发展前景非常广阔，利用植物内生细菌定殖[21]等研究，结合实际生产情况，进行一项经济、有效、可持续的绿色无污染技术。

参考文献：

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[4] 杨海莲, 孙晓璐, 宋未. 水稻内生阴沟肠杆菌的定殖研究[J]. 自然科学进展, 1999, (01): 92~93.

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