枯草芽孢杆菌的发酵

枯草芽孢杆菌的发酵学院：化工学院专业：生物工程班级：生物10-2：霞摘要枯草芽孢杆菌是我国农业部允许作为饲料添加剂的15种菌种之一 ,其已被越来越多地制成饲用微生态制剂。

因其制剂是无毒、无残留、无污染的“绿色”添加剂，故具有广阔的发展前景，并已在畜牧业、饲料业广泛应用，显示巨大的社会效益和生态效益。

通过摇床培养筛选出较适宜于枯草芽孢杆菌发酵的培养基配方，发酵培养基配方确定后，在摇床条件下，通过对温度、初始ｐＨ值、初始接种量、装液量、摇床转速等发酵条件的摸索，确定最佳发酵条件。

在摇瓶条件下优化发酵培养基和发酵工艺后，采用发酵罐进行发酵培养，对枯草芽孢杆菌在液体发酵过程中的菌体数量、ｐＨ值、总糖含量和总氮含量四个因素随时间的变化进行了观察。

枯草芽孢杆菌，是芽孢杆菌属的一种。

单个细胞 0.7～0.8×2～3微米，着色均匀。

无荚膜，周生鞭毛，能运动。

革兰氏阳性菌，芽孢0.6～0.9×1.0～1.5微米，椭圆到柱状，位于菌体中央或稍偏，芽孢形成后菌体不膨大。

菌落表面粗糙不透明，污白色或微黄色。

枯草芽孢杆菌菌体生长过程中产生的枯草菌素、多粘菌素、制霉菌素、短杆菌肽等活性物质，这些物质对致病菌或源性感染的条件致病菌有明显的抑制作用。

枯草芽孢杆菌迅速消耗环境中的游离氧，造成肠道低氧，促进有益厌氧菌生长，并产生乳酸等有机酸类，降低肠道pH值，间接抑制其它致病菌生长。

枯草芽孢杆菌菌体自身合成α-淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、纤维素酶等酶类，在消化道中与动物体的消化酶类一同发挥作用，能合成维生素B1、B2、B6、烟酸等多种B族维生素，提高动物体干扰素和巨噬细胞的活性，在饲料中应用广泛。

它还可以用来改善水质，应用在污水处理和环境保护中。

和其它微生物混合使用，还可以用于生物肥料和土地改良等关键词：枯草芽孢杆菌生长发酵活菌数第一章材料与方法1.1材料1.1.1 菌种枯草芽孢杆菌1.1.2 培养基（1）LB培养基：蛋白胨10g，酵母膏5g，NaCl10g，蒸馏水1000ml，pH为7，（可溶性淀粉20g）琼脂20g。

（2）筛选用培养基：含有2%可溶性淀粉的LB培养基。

（3）种子培养基：豆饼粉4%，玉米粉3%，Na2HPO40.8%，(NH4)2SO40.4%，NH4Cl0.15%，H2O。

（4）发酵培养基：豆饼粉5.6%，玉米粉7.2%，Na2HPO40.8%，(NH4)2SO40.4%，NH4Cl0.13%，CaCl20.13%，α—淀粉酶50g。

1.1.3 主要试剂蔗糖、葡萄糖、淀粉、玉米淀粉、麦芽糖、酵母浸出物、胰蛋白胨、牛肉膏、尿素、氯化铵、硫酸锰、硫酸镁、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、硫酸亚铁、氯化钠和氯化钙。

1.1.4 仪器设备控温摇床、高压蒸气灭菌锅、电子天平、pH测定仪、无菌操作台和紫外分光光度计。

1.2方法1.2.1 培养基的制备(1)称量按培养基配比依次准确地称取酵母膏、NaCl、蛋白胨放入烧杯中，并在烧杯中加入少量蒸馏水。

注：酵母膏常用玻棒挑取，放在小烧杯或表面皿中称量，用热水溶化后倒入烧杯，也可放在称量纸上，称量后直接放入水中，这时如稍微加热，酵母膏便会与称量纸分离，然后立即取出纸片。

(2)溶化可溶性淀粉溶液的配制方法：将所需克数的可溶性淀粉放入一个小烧杯中，加入少量蒸馏水，搅拌成糊状，然后将糊状溶液均匀倒入少于培养基总体积的沸水中，一边搅拌一边加热，待其溶化成透明状后继续在电炉上加热5分即制成可溶性淀粉溶液。

如果配制固体培养基时，将已准备好的可溶性淀粉溶液倒入烧杯中，将称好的琼脂放入已溶的药品中，再加热溶化，补水到所需的总体积。

在制备用三角瓶盛固体培养基时，一般也可先将一定量的液体培养基分装于三角瓶中，然后按2%的量将琼脂直接分别加入各三角瓶中，不必加热溶化，而是灭菌和加热溶化同步进行，节省时间。

在琼脂溶化过程中，应控制火力，以免培养基因沸腾而溢出容器。

同时，需不断搅拌，以防琼脂糊底烧焦。

配制培养基时，不能用铜或铁锅加热溶化，以免离子进入培养基中，影响细菌生长。

(3)调pH培养基配好以后，先用精密pH试纸测量培养基的原始pH，如果偏酸，用滴管向培养基中逐滴加1mol/LNaOH，边加边搅拌，并随时用pH试纸测其pH，直到pH达7为止；反之，用1mol/LHCl进行调节。

对于有些要求pH较精细的微生物，其pH的调节可用酸度计进行。

注意：pH不要调过头，以避免回调而影响培养基各离子的浓度，配制pH低的琼脂培养基时，若预先调好pH并在高压蒸汽下灭菌，则琼脂因水解不能凝固，因此应将培养基的成分和琼脂分开灭菌后再混合，或在中性pH条件下灭菌，再调整pH。

(4)分装按照实验要求，可将配置的培养基分装入试管或三角瓶中。

液体分装：分装的高度以试管高度的1/4左右为宜；分装三角瓶的量则根据需要而定，一般以不超过三角瓶的一半为宜。

固体分装：分装于试管中的应不超过试管的1/5，灭菌后制成斜面；分装三角瓶的量以不超过一半为宜。

(5)加塞培养基分装完毕后，在试管口上塞上棉塞，以阻止外界微生物进入培养基而造成污染，并保证有良好的通气性能。

(6)包扎加塞后，将全部试管用麻绳捆好，再在棉塞外包一层牛皮纸，以防止灭菌时冷凝水润湿棉塞，外边再用一道麻绳扎好。

用记号笔注明培养基名称，组别，配制日期。

三角瓶加塞后，外包牛皮纸，用麻绳以活结扎好，使用时容易解开，同样注明。

(7)灭菌将配置好且包扎完毕的固体、液体培养基及本实验涉及的试管、三角瓶等及400ml 纯水于高压灭菌器中以0.14Mpa ，121℃条件下高压蒸汽灭菌20分钟。

(8)斜面搁置将培养基冷却至50℃左右时放置斜面，斜面在试管的1/2处为宜，待斜面凝固后，放置于冰箱中待用。

1.2.2菌种的筛选与保藏(1)倒平板将实验配制好的培养基加热溶化，待冷却至55—60℃时，倒平板9皿。

(2)稀释用接种环取菌种，放入盛90ml 无菌水的三角瓶中，振摇。

用一支1ml 无菌吸管吸取1ml 菌液加入盛有9ml 无菌水的大试管中充分混匀，然后用无菌吸管从此试管中吸取1ml 加入另一盛有9ml 无菌水的试管中，混合均匀，以此类推制成101-、102-、103-、104-、105-、106-不同稀释度的菌液。

(3)划线将平板底面分别用记号笔写上104-、105-、106-三种稀释度（共三组）然后用接种环分别沾取浓度为104-、105-、106-稀释液并对号在相应平板上划线，室温下静止5—10min ，使菌液吸附进培养基。

(4)培养将培养基平板倒置于37℃的培养箱中，培养2—3天，观察淀粉圈。

对有淀粉圈的菌落，测量淀粉圈的直径D ，菌落直径ϕ，计算ϕD 的比值，可进行拍照，选择淀粉圈较大的菌落作为后续实验的菌种。

(5)接种接种到斜面培养基中，标注上日期等信息。

放入恒温培养箱中培养作为一级种子。

(6)保藏斜面置于37℃的培养箱中，培养2—3天，观察菌种长势好坏，若菌种长势好则将其放入冰箱中保藏，若长势不好则需多次斜面转接。

1.2.3枯草芽孢杆菌生长曲线测定(1)取12支无菌大试管，用记号笔分别标明培养时间即12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22和23h。

(2)接种用1ml无菌吸管吸取2ml枯草芽孢杆菌培养液（培养10—12h）转入盛有100mlLB 液的三角瓶，混合均匀。

(3)培养将已接种的三角瓶放置37℃振荡培养（振荡频率为100r/min）分别在培养12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22和23h时，用无菌吸管吸取1ml菌液放入标有相应时间的无菌试管中，立即放入冰箱中储存，最后一同比浊测定光密度值。

(4)比浊测定用无菌水作空白对照，选用660nm波长进行光电比浊测定，从早取出的培养液开始依次测定，对细胞密度大的培养液用无菌水适当稀释后，使其光密度值在0.1—0.65之的生长情况。

菌体进入对数生长期即可作为二级种子液用于分批培养发酵实验。

（测定PH值前，将待测定的培养液震荡，使细胞均匀分布）。

PH值测定结果1.2.4菌种摇瓶培养（1）称量根据需要量计算并依此称取豆饼粉、玉米粉、Na2HPO4、(NH4)2SO4、NH4Cl放入三角瓶中，配成200ml溶液。

（2）加塞包装。

（3）灭菌 0.14Mpa，121℃,20min。

（4）接种接种前一级种子需先放在恒温培养箱活化（37℃、12h），冷却后接种。

（5）培养放入气浴恒温振荡器中37℃,100r/min培养13h后，镜检，观察菌的生长情况。

菌体进入对数生长期即可作为二级种子液用于分批培养发酵实验。

1.2.5产α—淀粉酶枯草芽孢杆菌分批培养发酵（1）称量根据需要量计算并依次称量豆饼粉、玉米粉、Na2HPO4、(NH4)2SO4、NH4Cl、CaCl2、α—淀粉酶，放入发酵罐中加入蒸馏水配制2.5L发酵液。

（2）灭菌 0.14Mpa，121℃,20min。

（3）接种（4）启动发酵罐，调节发酵系数，开始发酵。

发酵参数：温度 37℃转速 200r/min通气量 1.33VVm（0—12h）2.67VVm（12h—发酵结束）pH值 6.5（5）测PH值，绘制生长曲线，并进行镜检，观察菌体生长状况。

（6）发酵结束，放罐。

第二章结果与分析2.1菌种筛选及保藏由于实验要筛选的菌种已经很纯了，所以此次实验所提到的“筛选”，是要筛选出有活力的、生长状态良好的纯种枯草芽孢杆菌。

通过加入少量的可溶性淀粉酶，可以使菌种进行选择性培养，这样筛选出来的菌株可以更好地产α—淀粉酶。

筛选出来的菌种要进行保藏，此实验的保藏方法是放在冰箱中保藏。

2.2扩大培养此次实验采用一次扩大培养，方法是摇瓶培养。

扩大培养用的培养基与发酵培养基相似。

在气浴恒温振荡器中，发现摇瓶中变浑浊，而且表面有很多气泡，这说明菌体开始生长了。

培养特定时间后，生长出来的菌种就可以用于发酵了。

2.3发酵发酵采用的方式是分批培养发酵，在一切做好准备后，进行无菌操作，把菌体放入发酵罐中进行发酵。

整个过程都是需要时刻进行调节的，主要的调节项目为温度、pH值，因为菌体在生长的各个阶段，温度和pH都有所变化，而想要生产出产品，就要控制好这两个参数。

温度控制主要通过加冷却水来进行，但要注意适量，不能太过。

pH值的控制主要通过加氨水来调节，因为随着菌体生长和产物产生，环境pH值会不断下降呈酸性，所以要不断加氨水来控制。

第三章结论枯草芽孢杆菌在培养过程中，由于培养条件掌握不好，常出现活菌数量低，芽孢形成率低等问题。

本研究通过一系列单因素实验,确定了枯草芽孢杆菌的最佳发酵条件。

通过对枯草芽孢杆菌进行筛选、扩大培养和发酵的控制，很好的了解了生物产品生产的中游部分的各个步骤，初步学习了这几部分的主要注意事项，尤其对发酵有了一个初步的认识，学会了控制发酵的相关参数。