枯草芽孢杆菌生产工艺
枯草芽孢杆菌发酵工艺2
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201510320760.5(22)申请日 2015.06.11C12N 1/20(2006.01)C12R 1/125(2006.01)(71)申请人山东西王糖业有限公司地址256209 山东省滨州市邹平县韩店镇驻地西王工业园电厂路南侧(72)发明人王棣 王居亮 李伟 杨荣玉唐海静 夏颖颖(74)专利代理机构济南舜源专利事务所有限公司 37205代理人宋玉霞(54)发明名称一种用玉米粗蛋白粉生产枯草芽孢杆菌微生态制剂的方法(57)摘要本发明提供一种以玉米淀粉生产过程中的副产品玉米粗蛋白粉为原料生产枯草芽孢杆菌微生态制剂的生产方法，采用本方法在不添加其它碳源和氮源的条件下，单纯以玉米粗蛋白粉为营养源经过固态培养可以生产出活菌数为3000亿-5000亿/g 的枯草芽孢杆菌微生态制剂。
生产过程不需要通压缩空气，不产生任何废水废气。
减少了枯草芽孢杆菌微生态制剂的生产成本。
且所得产品以玉米纤维低聚糖为载体具有益生元的功能提高了产品质量。
(51)Int.Cl.(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请权利要求书1页 说明书4页(10)申请公布号CN 104988088 A (43)申请公布日2015.10.21C N 104988088A1.一种用玉米粗蛋白粉生产枯草芽孢杆菌微生态制剂的方法，步骤如下：(1)取玉米粗蛋白粉移入固体发酵罐中，加水调到料水比为1：0.7-0.9，加氧化钙调pH 到6.0-7.0；(2)打开循环水使固体发酵罐温度上升到80-90℃后，通入蒸汽消毒30分钟；(3)待原料冷却到40℃-44℃后，加入物料干基重量1/9-1/10培养15h以后的种子液，固含量为5％；(4)维持30-40℃培养50-60h，24h后每隔6h搅拌一次物料；(5)培养到50-60h后，物料明显粘湿，有较浓的枯草芽孢杆菌特有气味，升温到44-56℃继续培养12-22h；(6)共计培养72h后移出物料，65-80℃烘干物料；(7)烘干物料水份到小于6％后，粉碎物料；(8)将粉碎的物料进行包装，取样检测产品质量。
枯草芽孢杆菌粉剂生产工艺研究精品资料
2结果
2.1蝶片式自动排渣分离机参数实验结果从图1可以看出进入离心机的流量在200L/h时，上清液中残留的菌数为0.24亿cfu/mL，当进入离心机的流量在400L/h时，上清液中残留的菌数为1.09亿cfu/mL。虽然400L/h离心时废液中残留的菌数很大，但是考虑占发酵液（发酵液为180亿cfu/mL）中菌数的比重、离心所需时间、工人成本以及耗电量等问题，最终确定流量为400L/h。从图2可以看到，在流速（400L/h）恒定的前提下发酵液进入离心机，排渣时间为4min时，废液中残留的菌数为0.09亿cfu/mL，当排渣时间为6min时，上清液中残留的菌体为0.89亿cfu/mL。虽然排渣时间为4min时，废液中菌体数量最少，但是分离出来的菌泥含水量很大，给后续混合，烘干带来很大的负担。排渣时间为6min时，废液中有0.89亿cfu/mL的菌体，但是相比发酵液母液180亿cfu/mL的量来讲，其比重是很小的。考虑到烘干时成本以及混合时用载体的量等多种因素，确定排渣时间为6min。综合两组实验确定离心机的参数为：进入离心机的流量为400L/h，排渣时间为6min。
产枯草芽孢杆菌实训报告
一、种子的制备
➢ 种子的制备
➢ 培养基
➢ 牛肉膏 0.5g 蛋白胨 1g 氯化钠 0.5g
蒸
馏水
➢ 将配置好的培养基放入250ml的三角瓶中装液 量为100ml，数量11个 。装液后进行高温灭菌。
➢ 一级种子的制备
➢ 选取长势良好的菌种，挑取菌落2~3环接种 导液体摇瓶中。
行升温，当温度达到120摄氏度、压强时，保持温度和 压力20min。 ➢ 灭菌后，关闭蒸汽进气阀，开大放气阀，当压强下降 到时开启通气阀。使罐内压力保持在左右。 ➢ 开启冷水阀门，对发酵罐进行降温。
五、接种
➢ 当罐温降到37摄氏度后，关闭冷水。用酒精将 接种口处仔细擦洗，并放上接种火圈。
➢ 减少进气，使罐压保持在，点燃接种火圈。 ➢ 拧下进料口螺盖，放入酒精中,以免染菌。 ➢ 按接种瓶的瓶口在火焰上灼烧一下，并在火焰
罐体经行升温，当温度达到120摄氏度、压强 时，保持温度和压力20min。 ➢ 灭菌后，关闭蒸汽进气阀，开大放气阀，进行 泄压。
四、实罐灭菌
➢ 泄压后，从进料口开始添加培养基，并开始搅拌（转 速130r/min）
➢ 进料完毕后开始调节PH值 ➢ 调好PH后，对罐体进行夹套预热85摄氏度以上。 ➢ 温度到达后，关闭夹套进气开关。通热蒸汽对罐体经
➢ 取上述溶液1ml，加入DNS试剂于沸水浴中加热2min进行显色，取出后 用水迅速冷却 ，加去9ml蒸馏水，摇匀，在540nm波长处测定吸光值。
➢ 2）空白液的处理： ➢ 发酵液离心处理：8000rpm，5min ➢ 1ml离心后的发酵液+5ml 1%淀粉溶液直接加热煮沸5min，取1ml，加入
枯草芽孢杆菌菌株发酵生产工艺优化
３ 结论 风干燥箱 ，上海产，型号 Ｉ Ｏ １ Ａ 一 ３ ；电热恒温培养箱 ，上海产 ，型号 对于培养基的选择应该遵循原料取材方便 ， 来源广泛 ， 价格低廉的 Ｄ Ｈ Ｐ 一 ９ １ ６ ２ ； 垂直流超净工作 台， 上海产 ， 型号 ２ Ｈ Ｊ Ｈ 一 １ １ １ ２ ； 显微镜 ， 日 原则， 酵母膏、 酵母粉这类药品成本较高， 不适用于工业化生产。 本研究 本产 ， 型号 Ｎ ｉ ｋ ｏ ｎ — Ｙ Ｓ １ ０ ０ ； 手提式高压灭菌锅 ， 哈尔滨市医疗器械厂制 在通用培养基中添加了不同比例的的工农业副产品——豆饼粉和麸子 造； 可控温式摇床， 哈尔滨市东联科学仪器厂制造。 即适量的碳源和氮源 ， 根据发酵过程中枯草芽孢杆菌菌体数量的变 １ ． ４方法 。１ Ａ ． １ 菌种活化。 将保存的枯草芽孢杆菌移接到斜面试管 粉 ， 化 ， 得到最佳培养基配方， 即通用培养基 ＋ １ ． ５ ％豆饼粉 ＋ １ ｍ 麸皮 ， 利用 培养基 中， 在恒温培养箱 ３ ７ ±１ 。 ｃ 培养 ２ ４ ｈ 。１ ． ４ ． ２种子液的制备。 取一 这一配方， 生产 出了成本低廉 、 菌活数达 １ ８ 亿 ／ ｍｌ 以上的枯草芽孢杆菌 环 已活化完成斜 面菌种接人到三角瓶种子培养基 中， ５ ０ ０ ｍＬ三角瓶 达到了促进枯草芽孢杆菌菌株生长的目的， 增加了发酵液中菌体 中，装量为 １ ０ ０ ｍ Ｌ种子培养基 ， ３ ７± １ ｏ Ｃ ， １ ８ ０ ｒ ／ ｍｉ ｎ， 摇床 中震荡培养 菌剂 ， 数 量 和代谢 产物 ， 为 工业 化发 酵生 产 和大 面积 推广应 用 提供 充足 的 、 廉 ２ ４ ｈ 。１ ． ４ ． ３ 菌株发酵培养。取 ｌ ｍ Ｌ培养好的种子液， 以２ ％的接菌量ｆ 即 价 的微 生物 菌体及 发酵 菌液 。 在每 ｌ Ｏ Ｏ ｍｌ 的液体培养基 中接入 ２ ｍ ｌ 浓度为 ｌ ｘ ｌ Ｏ ｇ ｅ ｆ ｕ ／ ｍ ｌ 的发酵液汾 参 考文 献 别接入到 ｌ ５ 个（ 每种培养基 ３ 个） 装有 １ ０ ０ ｍ Ｌ发酵培养基的 ５ ０ ０ ｍＬ １ 阿 红， 蔡 学清， 洪永聪等． 辣椒内生细菌的分 离及拮抗菌的筛选ｌ Ｊ １ ． 中国 三角瓶 中， ３ ７ ±１ ℃， １ ８ ０ ｒ ／ ｍｉ ｎ ， 摇床中振荡培养 。 １ Ａ ． ４ 测定方法。 将各摇 ［
枯草生产工艺
枯草芽孢杆菌生产工艺规程（5000L发酵）一．产品简介品名：枯草芽孢杆菌（来源：市微所检测中心）拉丁学名Bacillus subtilis性状：浅黄色粉末二．工艺流程图试管斜面↓三角瓶摇瓶↓一级种子培养（50L罐）↓二级种子培养（500L罐）↓发酵培养（5000L罐）↓离心↓冷冻干燥↓粉碎→芽孢计数↓保存↓包装三．生产工艺的操作过程及要求1.摇瓶培养（1）50L、500L、5000L罐的清洗，过滤器检查，保压检漏。
空消。
（2）检查培养基原料、柴油是否够用。
（1）准备补碱瓶三个，消泡剂瓶两个，补料管一根（用于补糖）。
灭菌条件：121℃，30分钟。
（2）移种前镜检正常后，开始配制5000L罐的培养基。
4.发酵培养（5000L罐）5.补料（200L或500L罐）6.放罐离心放料速度：检测离心上清液OD600值。
拆卸频率：每台离心机装菌泥约5kg，根据发酵液湿重推出每次离心的发酵液体积。
放罐完毕取出pH电极，清洗后放到指定点。
7.菌泥添加冻干保护剂保护剂配方（每10kg菌泥）：麦芽糊精1kg，淀粉2kg，海藻糖300g，抗结块剂200g，水8L。
保护剂充分溶解后，与菌泥混合，搅拌混匀。
8.真空冷冻干燥（具体操作参见冷冻干燥SOP）装盘：每盘体积为1L。
预冷时间：-40℃左右维持4h。
抽真空：点动开循环泵加热。
出柜：产品贴上标签，注明生产批号、重量、出柜日期。
取样：出柜时抽取样品约20g，用于检测计数。
10.保存冷冻干燥后的菌体置于-20℃冰箱保存，填写冰箱物品保存记录。
11.粉碎使用60-100目筛网过筛，粉碎的器具应在粉碎间清洗干净，避免跟其它物品交叉污染。
12. 包装称重，用锡纸包装后，进行封口。
四．生产过程的质量控制1. 发酵前期pH值控制在6.5左右，6.00-7.00之间。
2. 发酵过程产生大量泡沫，需要流加消泡剂，不能跑料。
3. 摇瓶菌种、移种前的种子液和培养基、放罐后的菌液，均用显微镜检测是否正常。
枯草芽孢杆菌生产工艺
枯草芽孢杆菌生产工艺枯草芽孢杆菌是一种重要的微生物资源，在农业生产和环境保护中有着广泛的应用价值。
枯草芽孢杆菌能够分解有机物质，产生一系列生物活性物质，具有杀菌和促进植物生长的作用。
下面将介绍枯草芽孢杆菌的生产工艺。
1. 菌种培养首先要获得高质量的菌种，一般选择枯草芽孢杆菌的自然菌株或者已经纯化的菌株作为菌种。
然后将菌种接种到适合生长的培养基中，通过搅拌培养，保持适宜的培养条件（温度、pH 值、氧气含量等），使得菌种能够迅速繁殖。
2. 发酵培养将菌种转入发酵罐中进行发酵培养。
发酵罐中应该具备良好的通气性和温度控制系统，以确保菌种的正常生长和代谢。
在发酵过程中，要控制培养液的pH值，保持在适宜的范围内（一般为6-8），并添加适量的碳源和氮源，加速菌种的生长速度。
3. 发酵液分离发酵液中的细胞和液体部分需要进行分离，以获取纯净的发酵液。
可以通过离心和过滤等方法进行分离，将液体部分收集下来。
4. 提取和纯化将收集到的发酵液进行进一步处理，以得到所需要的活性成分。
可以采用溶剂提取、蒸馏浓缩、纯化柱层析等多种方法进行处理，去除无关化合物，得到目标物质。
5. 成品包装对纯化得到的目标物质进行检测和质量评估，确保其符合标准要求。
然后将成品进行包装，以便储存和使用。
需要注意的是，枯草芽孢杆菌的生产是一个复杂的过程，需要细致的操作和科学的控制。
在每个环节都要注意卫生和安全，防止外界的污染和菌株的变异。
同时，还需要对每个步骤进行合理设计和优化，以提高生产效率和产量。
枯草芽孢杆菌的生产工艺是一个有挑战性的任务，但通过不断的研究和改进，相信可以进一步提高该菌株的产量和质量，推动其在农业和环境领域的应用。
一种枯草芽孢杆菌活菌制剂的制备工艺[发明专利]
![一种枯草芽孢杆菌活菌制剂的制备工艺[发明专利]](https://img.taocdn.com/s3/m/e1c3bdef5122aaea998fcc22bcd126fff7055df7.png)
(10)申请公布号 (43)申请公布日 2014.12.24C N 104232526A (21)申请号 201410436583.2(22)申请日 2014.08.29C12N 1/20(2006.01)C12R 1/125(2006.01)(71)申请人湖北省生物农药工程研究中心地址430064 湖北省武汉市洪山区南湖大道8号(72)发明人饶犇 廖先清 周荣华 刘芳黄大野 万文栓 刘晓艳 曹春霞杨自文(74)专利代理机构武汉开元知识产权代理有限公司 42104代理人朱盛华(54)发明名称一种枯草芽孢杆菌活菌制剂的制备工艺(57)摘要本发明涉及一种枯草芽孢杆菌活菌制剂的制备工艺.枯草芽孢杆菌经一、二级种子扩大培养后接入发酵培养基中培养，在发酵过程中通过补料流加碳源增加芽孢杆菌的数量和转化率，显著提高单位产量，降低了单位成本；结束发酵，使用真空薄膜浓缩器浓缩发酵液，发酵液中的可溶性增效物质、促生物质、抑菌活性物质能有效回收；浓缩发酵液用多级低温喷雾流化干燥设备干燥造粒，分选颗粒，旋风分离器捕集细粉返回再造粒，得每克菌粉CFU 不少于2.0×1011个的枯草芽孢杆菌产品。
尾气处理，达标排放。
本发明能最大程度保留发酵液中有效物质，产品质量高、设备利用率高，生物活性保持的比较好，废气，废水达标排放，能大规模产业化生产。
(51)Int.Cl.权利要求书1页 说明书7页(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请权利要求书1页 说明书7页(10)申请公布号CN 104232526 A1.一种枯草芽孢杆菌活菌制剂的制备工艺，其特征在于具体步骤如下：1)一级种子培养：5000ml三角瓶中装有2000ml一级种子培养基，115℃-121℃湿热灭菌15-30min,取10ml枯草芽孢杆菌活菌冻干管菌种接种于一级种子培养基中，在30℃-35℃培养8～10h；一级种子培养所用培养基的原料及用量为：葡萄糖0.5％-3％，牛肉膏0.5％-3％，蛋白胨0.5％-3％，氯化钠0.3-1％，培养基pH为6.5-7.5；2)二级种子培养：在400L发酵罐中装有150L或300L二级种子培养基，115℃-121℃湿热灭菌15-30min,将3000ml一级种子接种于二级种子培养基中；在30℃-35℃培养8～10h；二级种子培养所用培养基的原料及用量为：葡萄糖0.5％-3％，酵母抽提物0.5％-3％，蛋白胨0.5％-3％，磷酸氢二钾0.02％-0.05％，氯化钠0.5％-1％，硫酸镁0.02％-0.1％，培养基pH调为6.5-7.5；3)发酵：在5m3或40m3发酵罐中装有或4000L或30m3枯草芽孢杆菌活菌发酵培养基，115℃-121℃湿热灭菌15-30min,将150L或300L二级种子接种于枯草芽孢杆菌活菌发酵培养基中，控制罐压0.02Mpa-0.05Mpa，在28℃-35℃培养30-36h；发酵所用培养基的原料及用量为：葡萄糖0.5％-3％，豆粕1％-4％，玉米浆1％-3％，酵母粉1％-3％，蛋白胨1％-3％，磷酸氢二钾0.01％-0.05％，硫酸镁0.1％-0.2％，硫酸锰0.002％，培养基pH为6.5-7.5；4)补料：当发酵至8-12h开始流加由葡萄糖20％-60％，水40％-80％配制成的葡萄糖补料培养基，发酵至24-28小时结束；5)至芽孢形成率大于等于90％时，结束发酵；6)将发酵液加热到35℃-60℃时进入浓缩器，在真空度为-70kpa～-95kpa下进行浓缩，浓缩至含固量达到10％-25％时，开始出料；7)浓缩发酵液用多级低温喷雾流化干燥设备进行干燥造粒，颗粒经过分选，符合颗粒要求直接出塔，得CFU不少于2.0×1011个的枯草芽孢杆菌产品；所述进风温度130-180℃，出口温度60-80℃；8)尾气处理：采用化学氧化、等离子照射或紫外照射去味、脱氨氮或脱硫化氢处理后排放。
枯草芽孢杆菌-MBS发酵工艺设计
课程设计姓名：学院：生命科学学院系别：生物工程班级：学号：指导教师：日期： 2011年4 月 19日～5月31日前言在畜禽养殖中使用益生菌不仅可避免长期使用抗生素所引起的肠道微生态平衡被破坏、产生耐药性及药物残留等问题 ,还能提高动物的生产性能和免疫力。
枯草芽孢杆菌能改善肠道微生态环境 ,促进动物生长和提高抗病力 ,而且分泌各种消化酶类 (如蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶和纤维素酶等 ) ,促进养分的消化、吸收 ,更重要的是枯草芽孢杆菌在不利环境条件下能形成芽孢 ,在饲料制粒、贮存及胃酸环境中仍能保持较高活性。
因此 ,枯草芽孢杆菌比其他有益微生物有着更多的优点而得到广泛的研究和应用。
试验选择在实际畜禽饲养生产中效果较好的 1株枯草芽孢杆菌 - MBS为研究对象 ,对其成长条件及培养基成分进行优化 ,为标准化生产提供依据。
利用实验获得的最优条件依次在摇瓶中及一级种子罐中扩大培养，发酵罐中扩大培养以获得所需菌体。
所得菌体经过进一步的加工处理得到菌剂等产物，以获得经济效益。
本设计为单批次液体发酵1吨枯草芽孢杆菌-MBS的发酵工艺设计，通过设计得出实际生产所需的设备及其规格要求，各理论的配比系数等参数，旨在应用到实际生产当中去。
目录设计任务书 (3)1 设计题目：单批次液体发酵1吨枯草芽孢杆菌-MBS的发酵工艺设计 (3)2 基本工艺流程： (3)3 设计依据： (3)4 设计结果： (3)设计正文 (3)1枯草芽孢杆菌简介 (3)1.1生理特性 (3)1.2作用机理 (3)1.3应用范围 (3)2设计依据 (4)2.1基本发酵工艺流程 (4)2.2总体发酵规模 (4)2.3发酵工艺设计理论参数与及工艺环节参数的选择原则 (4)3 发酵工艺流程与设备流程设计 (5)3.1工艺环节参数推算过程 (5)3.1.1接种量及装液系数 (5)3.2工艺流程简图 (5)3.3设备选型推算过程 (5)3.3.1种子罐及发酵罐 (5)3.3.2蒸汽发生器 (6)3.3.3空气压缩机 (6)3.3.4冷冻干燥机 (6)3.4实际设计的发酵工艺参数汇总表1 (6)3.5实际确定的发酵设备选型推算结果参数汇总表2 (6)3.6设备流程简图 (6)4 发酵最优条件简述 (7)5 设备汇总图表 (8)5.1 (8)5.2 (8)6 参考文献 (9)设计任务书1 设计题目：单批次液体发酵1吨枯草芽孢杆菌-MBS的发酵工艺设计2 基本工艺流程：保藏菌种（试管斜面培养）菌种摇瓶培养一级种子罐培养发酵罐发酵获得菌体3 设计依据：发酵培养类型理论接种比例（%）理想接种比例（%）理论装液系数（%）理想装液系数（%）三角瓶 1～5 1.5～2 10～20 20种子罐1～5 1.5～2 40～80 60～70 发酵罐1～5 1.5～2 56～70 60～704 设计结果：发酵级别发酵液总量(L)理论装液系数(%)理想装液系数(%)需要设备容量(L)选用设备规格及数量实际设备利用率（%）设备型号及厂家摇瓶0.4 10～20 20 0.25 4 ----------种子罐20 40～80 60～70 30 1 66.7 SY-3030 上海世远生物设备工程有限公司发酵罐1000 56～70 60～70 1500 1 66.7 TF-1500 连云港永上制药设备有限公司设计正文1枯草芽孢杆菌简介1.1生理特性枯草芽孢杆菌，是芽孢杆菌属的一种。
枯草芽孢杆菌固态高密度发酵工艺条件的优化
meal, rice husk and straw were made into the solid-state fermentation medium. The best fermentation technology of
Bacillus subtilis was optimized by single factor test and orthogonal test of four factors and three levels. Results
721
单因素试验结果
3.2.1 发酵时间对活菌数的影响
发酵时间对枯草芽孢杆菌固态发酵产物中活菌
数的影响结果见图1，发酵时间达到25 h时，活菌数
数也在升高，当发酵时间达到 30 h 时，增长幅度减
下培养 12~14 h。取活化后的液体培养基 2 mL 接入
200 mL 液 体 培 养 基 进 行 扩 大 培 养 ， 置 于 37 ℃ 、
195 r·min-1 培养 3~6 h 后，作为种子液备用[14]。
2.2
固态发酵
将豆粕、稻壳、玉米秸秆粉碎后过筛，按表 1
的比例置于 500 mL 的烧杯中。将烧杯置于高压灭
质量比 631 为最佳配比，不但降低了原料成本，
同时也提高了粮食作物的性价比。
根据原料的市场保有量和价格设计不同的原料
配比，以固态发酵产物中的活菌数为指标，将豆
粕、玉米秸秆和稻壳按比例配制后进行固态发酵试
验，确定最佳原料配比，结果见表 3。
活菌数/（cfu·g-1）
451
5.2×107
631
玉米秸秆，购自吉林华展生物工程有限责任公司。
培养基
斜面培养基：蛋白胨 10.00 g·L- 1，酵母浸粉
微生物发酵法生产枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶的生产工艺[发明专利]
![微生物发酵法生产枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶的生产工艺[发明专利]](https://img.taocdn.com/s3/m/f9ddc6310640be1e650e52ea551810a6f424c841.png)
[19]中华人民共和国国家知识产权局[12]发明专利申请公布说明书[11]公开号CN 101368177A [43]公开日2009年2月18日[21]申请号200810231714.8[22]申请日2008.10.13[21]申请号200810231714.8[71]申请人西北农林科技大学地址712100陕西省西安市杨凌农业示范区西农路22号[72]发明人安德荣 刘双发 [74]专利代理机构西安新思维专利商标事务所有限公司代理人韩翎[51]Int.CI.C12N 9/56 (2006.01)C12R 1/125 (2006.01)权利要求书 4 页 说明书 10 页 附图 1 页[54]发明名称微生物发酵法生产枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶的生产工艺[57]摘要本发明涉及一种微生物发酵法生产枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶的生产工艺，其采用微生物发酵生产碱性蛋白酶，周期短，营养需求低，提取工艺简单，降低了成本，同时提高了蛋白酶的回收率。
本发明包括以下步骤：(1)菌种培养：采用种子培养基对枯草芽孢杆菌种进行扩大培养；(2)发酵培养基配制；(3)发酵：将枯草芽孢杆菌菌种接入摇瓶，进行发酵得发酵液；(4)粗提：发酵液经预处理后离心，脱色，过滤和减压干燥得粗品碱性蛋白酶；(5)精制：粗品经纯化溶解后，盐析，透析，超滤浓缩，凝胶过滤层析，然后干燥浓缩得成品。
200810231714.8权 利 要 求 书第1/4页 1.一种微生物发酵法生产枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶的生产工艺，其特征在于包括以下步骤：(1)菌种培养：采用种子培养基对枯草芽孢杆菌种进行扩大培养；(2)发酵培养基配制；(3)发酵：将枯草芽孢杆菌菌种接入摇瓶，进行发酵得发酵液；(4)粗提：发酵液经预处理后离心，脱色，过滤和减压干燥得粗品碱性蛋白酶；(5)精制：粗品经纯化溶解后，盐析，透析，超滤浓缩，凝胶过滤层析，然后干燥浓缩得成品。
2.根据权利要求1所述的微生物发酵法生产枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶的生产工艺，其特征在于：步骤(1)中发酵培养基的配方为：葡萄糖1.2％+蔗糖0.6％十淀粉1.2％，豆饼粉3％，酵母粉0.3％，K2HPO4·3H2O0.2％，其余以蒸馏水补充，其中百分比为w/w。
枯草芽孢杆菌生产工艺
枯草芽孢杆菌生产工艺-实验室操作1. 培养基1.1 种子培养基蛋白胨1 %，酵母浸出物0. 5 %，氯化钠1 % ，自然pH。
1.2 基础发酵培养基蔗糖1 %，蛋白胨1 %，磷酸氢二钠0. 2 %，磷酸二氢钠0.2 %，pH 7. 0。
1.3 主要试剂蔗糖、葡萄糖、淀粉、玉米淀粉、麦芽糖、酵母浸出物、胰蛋白胨、牛肉膏、尿素、氯化铵、硫酸锰、硫酸镁、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、硫酸亚铁、氯化钠和氯化钙。
1.4 仪器设备控温摇床、高压蒸气灭菌锅、电子天平、pH 测定仪、无菌操作台和紫外分光光度计。
2.方法2. 1培养方法2. 1. 1菌种活化将保存的菌种转接到斜面培养基，37 ℃培养24 h，备用。
2. 1. 2种子液的制备取一环活化的菌种，接入装量为50 mL种子培养基的250mL三角瓶中，37℃，180 r/ min 培养18 h。
2. 1. 3摇瓶培养分别取1 mL 种子液，接入盛有50mL 发酵培养基的200 mL三角瓶中(接种量为2% ，V/ V) 。
置摇床中，30 ℃振荡培养12 h，转速为160 r/ min3. 培养条件3.1碳源以葡萄糖、蔗糖和麦芽糖为碳源时枯草芽孢杆菌的生长明显优于可溶性淀粉和玉米淀粉。
最佳碳源是葡萄糖，其次是蔗糖。
3.2氮源氮源为有机氮源时枯草芽孢杆菌的生长明显优于无机氮源。
最适氮源是酵母浸出物，从发酵成本考虑，酵母浸出物、胰蛋白胨及氯化铵组成的复合氮源较合适。
4.发酵条件4.1生长曲线接种12 h后细菌数量开始减少，枯草芽孢杆菌进入生长衰亡期。
因此，采用8～12 h 时的菌液作为菌种较合适，此时枯草芽孢杆菌为对数生长末期，既可保持高的细胞活力，又可获得尽可能多的细胞数。
4.2 初始PH在初始pH 5. 5～8范围内枯草芽孢杆菌均可良好生长，pH 为6. 0 时生长最好，说明枯草芽孢杆菌对pH的适应性较宽，但随pH 的增大，活菌数呈下降趋势。
枯草芽孢杆菌的发酵
枯草芽孢杆菌的发酵学院：化工学院专业：生物工程班级：生物10-2 ：霞摘要枯草芽孢杆菌是我国农业部允许作为饲料添加剂的15 种菌种之一, 其已被越来越多地制成饲用微生态制剂。
因其制剂是无毒、无残留、无污染的“绿色” 添加剂，故具有广阔的发展前景，并已在畜牧业、饲料业广泛应用，显示巨大的社会效益和生态效益。
通过摇床培养筛选出较适宜于枯草芽孢杆菌发酵的培养基配方，发酵培养基配方确定后，在摇床条件下，通过对温度、初始ｐＨ值、初始接种量、装液量、摇床转速等发酵条件的摸索，确定最佳发酵条件。
在摇瓶条件下优化发酵培养基和发酵工艺后，采用发酵罐进行发酵培养，对枯草芽孢杆菌在液体发酵过程中的菌体数量、ｐＨ值、总糖含量和总氮含量四个因素随时间的变化进行了观察。
枯草芽孢杆菌，是芽孢杆菌属的一种。
单个细胞0.7 ～0.8×2～3 微米，着色均匀。
无荚膜，周生鞭毛，能运动。
革兰氏阳性菌，芽孢0.6 ～0.9 ×1.0 ～1.5 微米，椭圆到柱状，位于菌体中央或稍偏，芽孢形成后菌体不膨大。
菌落表面粗糙不透明，污白色或微黄色。
枯草芽孢杆菌菌体生长过程中产生的枯草菌素、多粘菌素、制霉菌素、短杆菌肽等活性物质，这些物质对致病菌或源性感染的条件致病菌有明显的抑制作用。
枯草芽孢杆菌迅速消耗环境中的游离氧，造成肠道低氧，促进有益厌氧菌生长，并产生乳酸等有机酸类，降低肠道pH 值，间接抑制其它致病菌生长。
枯草芽孢杆菌菌体自身合成α- 淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、纤维素酶等酶类，在消化道中与动物体的消化酶类一同发挥作用，能合成维生素B1、B2、B6、烟酸等多种B 族维生素，提高动物体干扰素和巨噬细胞的活性，在饲料中应用广泛。
它还可以用来改善水质，应用在污水处理和环境保护中。
和其它微生物混合使用，还可以用于生物肥料和土地改良等关键词：枯草芽孢杆菌生长发酵活菌数第一章材料与方法1.1材料1.1.1菌种枯草芽孢杆菌1.1.2培养基（1）LB培养基：蛋白胨10g，酵母膏5g，NaCl10g，蒸馏水1000ml，pH 为7，（可溶性淀粉20g）琼脂20g。
枯草芽孢杆菌的分离纯化ppt正式完整版
• 原理：许多芽孢杆菌产生淀粉酶，能将培养基中的淀 粉水解，淀粉水解后，遇碘不再变蓝色。
• 培养基：在肉汤琼脂中添加0.2%的可溶性淀粉，分装 于三角瓶。0.1MPa(15lbf/in2)20min灭菌备用。
• 步骤：
将培养基做成平板，凝固后取菌种点种于平板上
（每皿点种2点），一般于30摄氏度培养2—4天，形 成菌落后，在平板上滴加碘液，以铺满菌落为度，平
• 分离步骤 （4）挑菌及纯化：从上述分离的平板上分别挑取单菌落中部分菌体，在牛肉膏蛋白胨培养基上划线纯化。
而后静止5min，吸取上层液0. 脂肽类抗生素的HPLC定量检测 操作步骤：菌液穿刺接种到上述培养基中，一般于培养3—7天观察结果。
• 生理生化鉴定 菌落颜色、形状、质地、透明度等均一致）
2%的可溶性淀粉，分装于三角瓶。 06MPa（8lbf/in2）30min灭菌
板呈蓝色，而菌落周围如有无色透明圈出现，说明淀 粉被水解，透明圈的大小，可表明水解能力的大小。
• 经生理生化鉴定，确定是芽孢杆菌属纯
种后，从中选择一株转接于牛肉膏蛋白胨 （4）挑菌及纯化：从上述分离的平板上分别挑取单菌落中部分菌体，在牛肉膏蛋白胨培养基上划线纯化。
而后静止5min，吸取上层液0. 原理：有些芽孢杆菌发酵葡萄糖产酸，并将产生的酸进一步转化为中性化合物，如乙酰甲基甲醇。
枯草芽孢杆菌的分离纯化
（优选）枯草芽孢杆菌的分离 纯化
目录
• 菌种简介 培养结束后,7000r/min离心10min,取上清，加 HCl调节pH为5·0、4·5、4·0、3·5、3·0、2·5、2·0,7000r/min离心10min,收集沉淀。
（2）平板的制备：溶化三角瓶中的牛肉汤蛋白胨培养基，以每皿20ml左右倒6个平板。 5ml无菌水的试管中，制成1:100浓度的悬液，然后吸取土壤悬浊液0.
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枯草芽孢杆菌生产工艺-实验室操作
1. 培养基
1.1 种子培养基蛋白胨1 %，酵母浸出物0. 5 %，氯化钠1 % ，自然pH。
1.2 基础发酵培养基蔗糖1 %，蛋白胨1 %，磷酸氢二钠0. 2 %，磷酸二氢钠0. 2 %，pH 7. 0。
1.3 主要试剂
蔗糖、葡萄糖、淀粉、玉米淀粉、麦芽糖、酵母浸出物、胰蛋白胨、牛肉膏、尿素、氯化铵、硫酸锰、硫酸镁、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、硫酸亚铁、氯化钠和氯化钙。
1.4 仪器设备
控温摇床、高压蒸气灭菌锅、电子天平、pH 测定仪、无菌操作台和紫外分光光度计。
2.方法
2. 1培养方法
2. 1. 1菌种活化
将保存的菌种转接到斜面培养基，37 ℃培养24 h，备用。
2. 1. 2种子液的制备
取一环活化的菌种，接入装量为50 mL种子培养基的250mL三角瓶中，37℃，180 r/ min 培养18 h。
2. 1. 3摇瓶培养
分别取1 mL 种子液，接入盛有50 mL 发酵培养基的200 mL三角瓶中(接种量为2 % ，V/ V) 。
置摇床中，30 ℃振荡培养12 h，转速为160 r/ min
3. 培养条件
3.1碳源
以葡萄糖、蔗糖和麦芽糖为碳源时枯草芽孢杆菌的生长明显优于可溶性淀粉和玉米淀粉。
最佳碳源是葡萄糖，其次是蔗糖。
3.2氮源
氮源为有机氮源时枯草芽孢杆菌的生长明显优于无机氮源。
最适氮源是酵母浸出物，从发酵成本考虑，酵母浸出物、胰蛋白胨及氯化铵组成的复合氮源较合适。
4.发酵条件
4.1生长曲线
接种12 h后细菌数量开始减少，枯草芽孢杆菌进入生长衰亡期。
因此，采用8～12 h 时的菌液作为菌种较合适，此时枯草芽孢杆菌为对数生长末期，既可保持高的细胞活力，又可获得尽可能多的细胞数。
4.2 初始PH
在初始pH 5. 5～8范围内枯草芽孢杆菌均可良好生长，pH 为6. 0 时生长最好，说明枯草芽孢杆菌对pH 的适应性较宽，但随pH 的增大，活菌数呈下降趋势。
4.3温度
枯草芽孢杆菌在25～40℃均可良好生长，其生长的最适温度为35℃。
4.4装液量及接种量
枯草芽孢杆菌为需养菌，在生长过程中需要大量的氧气，装液量不可过多，培养液与容器体积比可设定为2:25；接种量3 % (V/ V) 较适合其生长。
5.干燥方式
采用喷雾干燥和低温冷冻干燥。
低温冷冻干燥更利于芽孢的形成，但其操作复杂、成本高，不利于规模化工业生产。
而喷雾干燥同样可产生高芽孢率，且成本相对低，更适合工业生产。