外显子测序&目标区域测序
外显子组测序信息分析
Base_covered_on_target(Mb)10 Coverage_of_target_region11 Fraction_of_target_covered_with_at_least_20x12 Fraction_of_target_covered_with_at_least_10x13 Fraction_of_target_covered_with_at_least_4x14
13721 92.05 47.31
12636 90.86 46.75
9776 66.84 43.05
9616 64.37 41.45
6904
6815
6684
6437
当比对到参考基因组目标区域的数据量在60%之上，认为外显子捕 获效率合格。
3.2.3、染色体覆盖深度分布
注：横坐标为染色体长度，纵坐标为覆盖深度取对数。
二、外显子组测序流程
基因组DNA的随机打断 DNA片段生物信息分析
三、外显子组测序信息分析流程
主要信息分析内容归类
3.1、数据过滤与评估 3.2、整体质量评估 3.3、SNP检测与注释 3.4、InDel检测与注释 3.5、高级分析
外显子组测序在医学研究中的应用
一 • 外显子组测序技术简介 二 • 外显子组测序流程 三 • 外显子组测序信息分析内容 四 • 外显子组测序的应用方案
一、外显子组测序技术简介
外显子测序是指利用序列捕获技术将全基因组外显子区 域DNA捕捉并富集后，再进行高通量测序的基因组分析方法。
外显子组序列仅占全基因组序列的1%左右，与人类85% 致病基因突变相关。与全基因组测序相比，外显子组测序不 仅费用较低，而且测序覆盖度更深，数据准确性更高。
全外显子测序检验的临床意义与样本要求
全外显子测序检验的临床意义与样本要求在当今医学领域，全外显子测序检验正逐渐成为临床诊断和治疗中不可或缺的重要工具。
全外显子测序是一种高通量的基因组测序技术，能够对所有外显子区域进行全面的检测和分析，从而帮助医生发现患者潜在的遗传变异和突变，为疾病的诊断和治疗提供更精准的信息。
针对全外显子测序检验的临床意义和样本要求，本文将从多个角度进行探讨，并共享个人观点和理解。
一、全外显子测序检验的临床意义1. 诊断和治疗指导：全外显子测序能够为医生提供全面的遗传变异信息，帮助精准诊断疾病类型和确定治疗方案。
尤其对于罕见遗传病、癌症等复杂疾病的诊断和治疗指导具有重要意义。
2. 遗传沟通和家族风险评估：通过全外显子测序检验，可以帮助患者进行遗传沟通，评估患病风险，并为家族成员提供相关遗传信息，帮助他们进行风险评估和健康管理。
3. 个性化医学：全外显子测序检验为个性化医学提供了重要的基础数据，可以根据个体的基因组信息，制定个性化的预防、诊断和治疗方案，实现精准医疗。
二、全外显子测序检验的样本要求1. 样本类型：全外显子测序通常需要采集患者的血液样本，获取其中的DNA进行测序分析。
对于一些特定疾病或研究项目，还可能需要获取肿瘤组织样本等特定样本。
2. 样本质量：样本的质量直接影响着全外显子测序的准确性和可靠性。
在采集和保存样本时，需要注意避免血液凝块和样本污染等情况，保证样本的纯度和完整性。
3. 样本数量：通常情况下，全外显子测序需要一定数量的DNA样本才能进行测序分析。
对于不同的实验项目和测序评台，样本数量的要求可能会有所不同，需要根据具体情况进行调整。
三、个人观点和理解全外显子测序作为一种新型的基因组测序技术，对于临床诊断和治疗具有重要意义。
通过对个体基因组的全面检测，我们能够更好地了解疾病的遗传基础，为精准医学提供数据支持。
然而，在进行全外显子测序检验时，我们也需要考虑样本的要求和质量，以确保测序结果的准确性和可靠性。
外显子测序原理
外显子测序原理
外显子测序是一种基因组测序技术，它的原理是通过对DNA中编码蛋白质的外显子区域进行测序，来揭示个体基因组的遗传信息。
外显子是基因组中编码蛋白质的部分，相对于整个基因组来说，外显子只占据了很小的比例，但却包含了大部分人类疾病相关的变异。
外显子测序的原理主要包括以下几个步骤，DNA提取、文库构建、高通量测序和数据分析。
首先，从样本中提取DNA，然后将DNA片段通过特定的方法构建成文库，接着进行高通量测序，获取大量的DNA序列信息。
最后，利用生物信息学分析软件对测序数据进行分析，鉴定外显子区域的变异信息。
在DNA提取过程中，需要保证提取的DNA质量和纯度，以确保后续测序的准确性和可靠性。
文库构建是将DNA片段连接到载体上，形成文库，这一步骤的关键是要避免DNA片段丢失或错位。
高通量测序是通过高通量测序技术对文库中的DNA片段进行大规模并行测序，产生海量的DNA序列数据。
数据分析是将测序得到的原始数据进行质控、比对、变异检测等一系列生物信息学分析过程，最终得到外显子区域的变异信息。
外显子测序技术的应用非常广泛，它可以用于研究人类疾病的发病机制、遗传变异的关联分析、药物靶点的筛选等领域。
通过对外显子的测序，可以发现与疾病相关的致病基因突变，为疾病的早期诊断和个体化治疗提供重要的依据。
同时，外显子测序也可以用于研究种群遗传结构、演化过程和基因型-表型关联等基因组学研究领域。
总的来说，外显子测序技术以其高通量、高效率、高准确性的特点，成为了当前研究基因组学和临床遗传学的重要工具。
随着测序技术的不断发展和成熟，外显子测序的应用前景将会更加广阔，为人类健康和疾病治疗带来更多的机遇和挑战。
针对外显子设计PCR测序引物教程
针对外显子设计PCR测序引物教程在园子搜索后，没有看到长基因（大与1000base)最简洁方法，而我现在欧洲实验室里从事这方面工作，作了大量这方面的工作。
自乐不如同乐，愿将我们设计引物技巧与大家分享，敲字很辛苦，请斑竹给点分。
可能有战友说了，我们的长基因都是交给测序公司用鸟枪法来测全基因的。
当然，您有钱当然可以这样做。
我们的方法适用于基因测序筛查突变，步骤相对简便，比较经济。
另外，本实验室最近的一偏文章采用该法发在了NEMJ上，可见该法已经是经典成熟的。
（1）基础知识我们知道gDNA由非编码区，外显子，内含子构成。
我们关心的基因是否突变在非编码区，外显字以及临近外显子的一小段内含子上。
至于其他的内含子（gDNA中的大头），发生突变与否并不是我们关心的，其临床意义也相当小。
因此我们只要设计引物来PCR上面三个重点区域就可以了。
（2）设计软件在线设计软件exon primerhttp://ihg2.helmholtz-muenchen.de/ihg/ExonPrimer.html大家从上图可以看到，网页提示我们现在需要输入两个序列，一个是cDNA，一个是gDNA。
由于我们还要考虑非编码区，而CDNA是没有非编码区UTR的。
因此，我们必须要用mRNA 输入网页中的cDNA栏。
否则我们得到的引物不会包含UTR。
要是有看官还看不懂的话，建议看下分子生物学教材关于cDNA和mRNA的区别。
下面我们以smurf2基因来说明如何设计针对外显子的测序引物。
（2）找到smurf2 mRNA打开gene bank/,注意要在database中选nucleotide如下图蹦出一大串序列。
找到我们要的人类的smurf2Homo sapiens SMAD specific E3 ubiquitin protein ligase 2 (SMURF2), mRNA直接点我们要的序列名字，就得到了mRNA了，Format:GenBank FASTA Graphics More Formats选项中当然要求点选FASTA形式了把mRNA序列拖选，拷贝下来再拷贝入在线设计软件exon primer （见第一贴）http://ihg2.helmholtz-muenchen.de/ihg/ExonPrimer.html好了。
外显子组测序技术
外显子组测序技术一、前言外显子组测序技术是一种高通量测序技术，它可以通过对人类基因组的外显子进行测序，来寻找与疾病相关的基因变异。
本文将详细介绍外显子组测序技术的原理、方法和应用。
二、原理外显子组测序技术是一种全基因组测序的变体，它只对基因组中编码蛋白质的区域（即外显子）进行测序。
这种技术可以检测到与疾病相关的单核苷酸多态性（SNP）、插入/缺失（indel）和结构变异等多种类型的突变。
三、方法1. 样品准备首先需要从患者或正常人身上提取DNA样品，并将其分离成片段。
然后使用特定的酶来切割这些片段，使其只包含编码蛋白质的区域。
2. 库制备接下来需要将这些片段连接到适当大小的DNA片段上，并添加适当的标签以便于后续处理。
这个过程称为库制备。
3. 测序完成库制备之后，需要进行高通量测序。
当前可用于外显子组测序的技术包括Illumina、Ion Torrent和Pacific Biosciences等。
4. 数据分析测序完成后，需要对数据进行处理和分析。
这个过程可以使用各种软件来完成，例如BWA、GATK和SAMtools等。
四、应用外显子组测序技术已经被广泛应用于疾病研究和临床诊断。
例如，在肿瘤学中，它可以检测到肿瘤细胞中的突变，并帮助医生选择最佳的治疗方案。
此外，它还可以用于遗传性疾病的诊断和预测。
五、优缺点1. 优点外显子组测序技术具有高通量、高灵敏度和高特异性等优点。
它可以检测到多种类型的基因变异，并且可以同时对多个样品进行分析。
2. 缺点外显子组测序技术的主要缺点是成本较高，并且需要较长的数据处理时间。
此外，由于只对编码蛋白质区域进行测序，因此无法检测到与非编码RNA相关的突变。
六、总结外显子组测序技术是一种重要的高通量测序技术，它可以用于疾病研究和临床诊断。
虽然它有一些缺点，但随着技术的不断发展，相信它将在未来得到更广泛的应用。
外显子测序 生物学重复-概述说明以及解释
外显子测序生物学重复-概述说明以及解释1.引言1.1 概述外显子测序（exome sequencing）是一种基于高通量测序技术的生物学研究方法，其目的是对生物体中的外显子区域进行快速、准确地测序和分析。
外显子是基因组中编码蛋白质的片段，它们占据了整个基因组的仅0.5至1.5的区域，但却承载着80以上的已知致病突变。
因此，外显子测序被广泛应用于寻找蛋白质编码基因的突变，以及与遗传性疾病、肿瘤和其他复杂疾病相关的致病突变的鉴定和研究。
外显子测序的基本原理是使用高通量测序技术对DNA样本进行测序，然后利用生物信息学方法将测序结果与参考基因组进行比对和分析，从而确定样本中外显子的序列和存在突变的位置。
与全基因组测序相比，外显子测序具有较低的成本和更高的效率，因为外显子相对较小且具有较高的功能重要性，可以更准确地筛选和鉴定潜在致病突变。
外显子测序在生物学研究中的应用广泛而重要。
它不仅可以用于研究人类遗传性疾病和肿瘤突变，还可应用于农业、畜牧业和其他生物领域的基因组学研究。
通过对不同个体的外显子进行测序，我们可以了解个体间的遗传差异、突变积累和遗传进化规律，为人类进化和适应性研究提供重要依据。
然而，外显子测序也面临一些挑战。
首先，由于外显子区域相对较小，它只能提供关于外显子的信息，对非编码区域的突变鉴定有限。
其次，外显子测序在处理复杂疾病和疾病相关基因组变异时可能会遇到困难，因为这些变异可能位于基因的调控区域或与功能相关的非编码RNA中。
此外，外显子测序对测序深度和准确性要求较高，因此需要高质量的测序平台和数据分析方法的支持。
总之，外显子测序作为一种高效、准确的测序技术，在生物学研究和临床诊断中发挥着重要作用。
随着技术的不断发展和应用的不断扩大，外显子测序将为我们揭示生物体的基因组变异与功能之间的关系，为疾病的早期诊断和个性化治疗提供更多可能性。
同时，对于生物学重复的研究也为我们提供了全新的视角和理解，有助于揭示生命的奥秘和进化的规律。
全外显子组测序常见问题（上）
全外显⼦组测序常见问题（上）1全外显⼦组测序必须要有参考基因组吗？必须有，如果没有参考因组，要提供近缘物种的序列，但不能保证捕获结果的可靠性。
因为捕获探针是根据提供的参考序列来设计的，如果已知⽬标区域与参考基因组⽐有较⼤出⼊，例如⼤⽚段的插⼊缺失，是不推荐的。
2为什么外显⼦测序在分析时需要跟全基因组⽐对，⽽不是直接与⽬标区域⽐对？第⼀，⽬标区域相对于全基因组⼀般较短，⽽且可能不连续，如果将⽬标区域单独提取出来，会影响区域边缘的序列⽐对效果；第⼆，⽆法评估捕获质量，例如脱靶率、on target⽐例等。
3全外显⼦组测序⼀般建议做多少倍的覆盖？⼀般做100×或150×。
较⾼的覆盖倍数，对于测异质性的遗传变质，可以发现⼩⽐例的突变。
另外，外显⼦测序的覆盖是随机的，这样较⾼的平均覆盖率有利于保证⼤部分的区域有⾜够的覆盖倍数。
4全外显⼦组测序深度的意义是什么？测序深度如何换算？测序深度代表了序列被探针组覆盖的次数，次数越⾼，测序结果的识别就越精确，后续的统计分析也就越准确。
如果做肿瘤、低频突变研究，建议测序深度⾄少应达到150×以上。
如果只看经典SNP、⾮低频突变，测序深度也⾄少应该在30×以上。
测序深度换算⽅法：⼀般⽬标区域的捕获效率在60-70%，安捷伦和罗⽒等外显⼦捕获试剂盒的⽬标区域⼤⼩在60Mb左右，即测序深度=10G*60%/60Mb=100×。
5全外显⼦组测序能够测出多⼤的⽚段缺失？⼤致能测出50bp的⽚段缺失。
由于外显⼦测序的覆盖很不平均，所以如果有⼤段的缺失，⽆法判断是因为杂交没有捕获到，还是因为缺失。
⽬前能够测到的，就是在⼀个read中发现的缺失。
⼀个read的长度也就是150bp，所以50bp以下的⽚段缺失可以从外显⼦测序中测出来。
6全外显⼦组测序可以做CNV分析吗？检测CNV的⽅法还有哪些？全外显⼦测序因为有⼀个杂交捕获的过程，这样就会有⼀个杂交捕获效率的问题。
外显子组测序
346: 256-259.
［案例三］ 癌症研究：外显子测序研究局限性肺腺癌瘤内异质性[14] 本研究采用多区域取样分析瘤内异质性的研究思路，对11位患者的局限性肺腺癌的48
个肿瘤样品进行了外显子测序。共鉴定出7269个体突变，其中21个是已知的与癌症相关的 基因突变，76% 的体突变及21个已知癌症基因突变中的20个都可以在同一肿瘤的所有区域 样品中检测到，表明对肿瘤的某一区域进行单次活检，以适当的深度对其测序，可以鉴别 出绝大多数突变。而前期关于肾透明细胞癌的研究结果表明，肿瘤不同区域样品的共有突 变仅占突变总数的31%~37%，说明肿瘤异质性在不同癌种间存在差异。
应用方向
孟德尔疾病研究
马布里综合症[1]：发现致病基因PIGV； 逆向性痤疮[2]：发现致病基因NCSTN； 眼皮肤白化病[3]：发现致病基因SLC24A5； 先天性肾脏和尿道畸形[4]：发现致病基因DSTYK;
复杂疾病研究
混合型低脂血症[5]：发现致病 基因ANGPTL3； 孤独症[6]：发现11 个新生突变 ……
[9] Rudin C M, Durinck S, Stawiski E W, et al. Comprehensive genomic analysis identifies SOX2 as a frequently amplified gene in small-cell lung cancer[J]. Nature Genetics, 2012, 44(10): 1111-1116.
人类外显子测序技术参数
一、技术参数
一
基本功能要求
1.1
服务范围：外显子测序
1.2
测序平台：HiSeqX Ten/Nova Seq6000
1.3
技术优势：合作项目1200例以上，成功的临床转化经验，优质的室间质评结果，在高通量、准确性上优势明显，应用效果好
1.4
实.Clean Reads Rate>80%；2. Adapter polluted rate<10%；3.碱基含量分布，AT，GC不分离；4.Dup率<20%；5.捕获特异性＞75%；6.基因组比对率>99%；7.基因组比对率>99%,Q30＞85%。
4.数据分析内容：数据处理、比对及质控、SNP检测及注释、Indel检测及注、SNP&Indel差异分析、CNV检测及注释、SV检测及注释、融合基因分析、变异全局总览
9.变异全局总览：对检测到的SNP、InDel、SV等变异的分布信息以CIRCOS展示出来，便于对整体情况的掌握及对不同样本显子捕获系统：AgilentV6 60M
2.质量检测：1％的琼脂糖电泳检测DNA样品是否有降解以及杂质；NanoPhotometer®分光光度计检测样品纯度；Qubit® 3.0 Flurometer检测DNA样品浓度。
2.比对及质控：本项目以UCSC hg19参考基因组作为参考序列，利用比对软件BWA（，将过滤后的Clean Reads比对到参考基因组上，得到BAM格式比对结果文件。使用Samtools软件对BAM文件进行排序，只保留序列唯一比对结果，再利用Picard标记比对结果中的Duplication read，同时还利用GATK对InDel周围的序列进行局部重新比对，降低SNP检测假阳性，得到高准确性的用于变异检测的比对结果BAM文件。按照个体或样本的特征将其分类，使同一类别内的个体具有尽可能高的同质性，类别之间具体尽可能高的异质性。代谢物含量数据采用极差法进行归一化处理，对代谢物在不同样本间的积累模式进行聚类分析。
全外显子组测序的具体方法及步骤
全外显子组测序的具体方法及步骤全外显子组测序（Whole Exome Sequencing，简称WES）是一种高通量测序技术，用于测定一个个体的所有外显子区域的DNA序列。
外显子是编码蛋白质的基因组区域，占据了人类基因组的约1-2%。
WES可以用于寻找致病基因突变，特别是在遗传性疾病的分子诊断中有广泛的应用。
下面将详细介绍WES的具体方法及步骤。
1.样品准备：-提取DNA：从待测个体的外周血或组织样品中提取总DNA。
-细胞裂解：使用特定组织裂解缓冲液将细胞或组织样品裂解，释放DNA。
-纯化DNA：通过离心等步骤，去除杂质，纯化DNA。
2.外显子库建立：- 靶向捕获：使用外显子组富集探针（baits）将DNA中的外显子区域进行加权，并去除非外显子区域的DNA片段。
-杂交反应：将靶向探针与DNA样品进行杂交反应，使探针与待测DNA的外显子区域发生特异性结合。
-洗涤：将未结合的探针洗掉，保留结合的外显子区域DNA片段。
-PCR扩增：对靶向捕获得到的DNA片段进行PCR扩增，以增加样品中外显子区域的DNA原料。
3.高通量测序：-数据库构建：将PCR扩增得到的外显子DNA片段建立一个DNA文库，用于测序。
- 测序反应：使用高通量测序平台（如Illumina HiSeq X）进行DNA文库的测序，得到大量的短序列片段（reads）。
- 数据处理：通过对这些reads进行去除低质量序列、比对到参考基因组等处理，获得高质量的测序数据。
4.数据分析：- 变异检测：使用专门的变异检测软件对样品中的变异进行分析，包括单核苷酸多态性（Single Nucleotide Polymorphisms，简称SNPs）和小片段插入缺失等。
-数据解读：将检测到的变异与公开的数据库进行对比，筛选出可能与疾病相关的变异。
-功能注释：对筛选出的变异进行功能注释，评估其潜在影响，进一步缩小候选基因的范围。
- 候选基因验证：对最终候选基因进行进一步的实验验证，如Sanger测序。
外显子测序简介
外显⼦测序简介外显⼦测序，也叫做外显⼦捕获测序。
⾸先利⽤序列捕获技术将外显⼦区域的DNA捕获并富集，然后进⾏⾼通量测序。
外显⼦测序主⽤⽤来分析基因组上的变异位点，包括SNP和INDEL。
外显⼦区域占整个⼈类基因组1%的⽐例，但是却包含了85%左右的已知疾病变异。
相⽐全基因组测序，外显⼦测序成本低，⽽且可以检测到全基因组测序鉴定不到的⼀些SNP位点。
⽬前市场上主流的外显⼦捕获试剂盒是以下3家公司的产品：1. Roche2. Agilent3. IlluminaRoche的Nimblegen SeqCap EZ Exome Kit；Agilent的SureSelect Exome kit; Illumina公司的TrueSeq Exome Kit。
Nimblegen SeqCap EZ Exome Kit⽬前为v3版本，链接如下https:///en/products-solutions/by-category/target-enrichment/hybridization/seqcap-ez-exome-v3-kit.html从下图可以看出，这款试剂盒覆盖的区域是最⼴泛的。
SureSelect Exome kit⽬前为v7版本，链接如下https:///en/SureSelect-DNA-Target-Enrichment-Baits-NEW/SureSelect-Human-All-Exon-V6/?cid=AG-PT-124&tabId=AG-PR-1308V7是今年才出来的最新版，⽬前⼤部分的数据还是基于v6版的。
illumina 是⽬前最⼤的⼆代测序仪⼚商，其外显⼦试剂盒价格⽐较低，应⽤的也很多。
链接如下https:///products/by-type/sequencing-kits/library-prep-kits/truseq-exome.html?langsel=/cn/外显⼦区域富集完成之后，就是⾼通量测序了，⽬前主流的测序平台还是illumina, 包括Miseq, Hiseq和Novaseq。
全外显子测序结题报告
全外显子测序结题报告客户项目编号上海祥音生物科技有限公司目录1.项目概述 (3)2.建库测序流程 (3)2.1.DNA样本检测 (3)2.2.建库捕获 (3)2.3.库检及上机测序 (3)3.数据分析 (4)3.1.分析流程 (4)3.2.数据库信息 (4)3.3数据分析软件 (5)4.分析结果 (5)4.1.原始数据 (5)4.2.质量控制 (7)4.3.质量评估 (9)4.4.重要指标统计 (15)4.5变异检测结果 (21)5.参考文献 (28)1.项目概述2.建库测序流程2.1.DNA样本检测对DNA样品的检测主要包括3种方法：(1)琼脂糖凝胶电泳分析DNA降解程度以及是否有RNA及蛋白等污染。
(2)Nanodrop检测DNA的纯度（OD260/280比值）。
(3)Qubit对DNA浓度进行精确定量。
一般OD值在1.8~2.0之间，含量在1.5ug以上的DNA样品用来建库结果更好。
2.2.建库捕获Agilent SureSelect Human All Exon V6是 Agilent自主研发的全外显子捕获芯片，该产品汲取多个权威数据库（如RefSeq，OMIM_cds）的核心内容，具有更大的捕获区间，更高的捕获效率，保证外显子编码区的高覆盖率及SNP检出率。
将全外显子区域进行捕获并富集后，使用主流的 illumina、Life Technology 等测序平台进行高通量测序。
实验严格按照生产流程进行操作。
2.3.库检及上机测序1)取1μl文库使用Qubit dsDNA HS Assay Kit进行定量，记录文库浓度，文库浓度约在1-10ng/μl；2)取1μl样品使用Agilent2100Bioanalyzer system（Agilent DNA1000Kit）进行文库片段长度测定，文库长度约在220-320bp之间；3)使用高通量测序平台进行测序。
3.数据分析3.1.分析流程获得原始测序序列(Sequenced Reads)后，在有参考序列或参考基因组(GRCh37/hg19)的情况下，进行信息分析流程，大致包括以下两个部分：1)测序数据质量评估：主要对数据量、碱基质量、比对率、覆盖率、捕获率、均一性等指标进行统计，评估建库测序是否达到了标准，符合标准则进行后续分析。
8种特殊建库测序
8种特殊建库测序8种特殊建库测序1. RNA-seq2. 外显⼦测序3. small RNA-seq4. 单细胞DNA测序5. 单细胞mRNA测序6. 甲基化测序7.Moleculo长测序8. Ribozero和⽅向性RNA⽂库1. RNA-seq今天呐，主要是给⼤家介绍⼀下RNA-seq（RNAsequencing)。
也就是RNA的⾼通量测序技术。
因为我们这个节⽬主要是针对医学⽅⾯的技术进展，所以，我们今天对于RNA的介绍，也会侧重于⼈的RNA测序⽅⾯的技术介绍，以及相关的⽣物信息学⽅⾯的⼯作。
RNA⾼通量测序（RNA-sequencing,缩写为RNA-seq）是⽬前⾼通量测序技术中被⽤得最⼴的⼀种技术，RNA-seq可以帮助我们了解：各种⽐较条件下，所有基因的表达情况的差异。
它可以检测的差异有：正常组织和肿瘤组织的之间的差异；它呐，也可以检测药物治疗前后，基因表达的差异；它呐还可以检测发育过程中，不同的发育阶段，不同的组织之间的基因表达差异。
诸如此类呐，很多。
我们不⼀⼀列举。
那么在所有检测的差异类型中，最常见的，就是检测所有mRNA的表达量的差异，这是最常⽤的⼀种检测。
同时呐，我们还可以检测 RNA 的结构上的差异。
例如：mRNA的剪接⽅式的差异，也就是我们⼀般说的“可变剪接”，还可以检测“融合基因”，同时还可以检测基因单点突变导致的SNP（Single Nucleotide Polymorphisom)。
接下来，我们分成“RNA-seq测序⽅法”和“RNA-seq测序数据分析”两个部分，分别介绍RNA-seq。
RNA测序⽅法在测mRNA的过程当中，⾸先要解决的问题，是如何去除核糖体RNA也就是去除“rRNA”(Ribosomal RNA)。
那在通常抽提到的总RNA中，绝⼤部分都是核糖体RNA（rRNA）。
以⼈类的细胞或组织为例，⼀般抽提到的总RNA当中，95%都是核糖体RNA。
剩下的2%到3%是mRNA。
全外显子测序实验步骤
全外显子测序实验步骤简介全外显子测序是一种高通量测序技术，可以对人类基因组中的所有外显子进行测序。
外显子是基因组中编码蛋白质的部分，全外显子测序可以帮助我们了解基因组中的变异和突变，从而揭示与疾病相关的基因变异。
全外显子测序实验涉及多个步骤，本文将详细介绍这些步骤，包括样本准备、DNA提取、文库构建、测序和数据分析等。
步骤1. 样本准备全外显子测序实验首先需要准备样本，通常是从患者或实验动物中获取的血液、组织或细胞样本。
样本的选择应根据研究目的和样本可获得性进行。
2. DNA提取从样本中提取DNA是进行全外显子测序的关键步骤。
DNA提取方法可以根据样本类型选择，常见的方法包括酚氯仿法、盐析法和商用DNA提取试剂盒等。
3. 文库构建文库构建是将提取的DNA样本转化为可以进行测序的文库的过程。
文库构建的主要步骤包括DNA片段化、末端修复、连接测序适配体和文库富集等。
•DNA片段化：将提取的DNA样本通过超声波或酶切等方法打断成较小的片段，通常大小为200-300碱基对。
•末端修复：对DNA片段的末端进行修复，包括去除3’和5’的过度突出部分，以及在末端添加磷酸基团。
•连接测序适配体：将修复的DNA片段与测序适配体连接，适配体含有测序引物和标识序列，用于后续的测序反应。
•文库富集：通过PCR扩增等方法富集连接好的文库，以增加测序效率和准确性。
4. 测序文库构建完成后，接下来进行测序。
全外显子测序通常采用高通量测序技术，如Illumina HiSeq或NovaSeq等。
•测序前处理：将文库中的DNA片段固定到测序芯片上，通常使用PCR扩增和桥式PCR等方法。
•测序反应：在测序芯片上进行碱基的顺序测定，根据测序适配体上的引物和标识序列识别碱基。
•数据生成：测序仪器会生成原始测序数据，通常以FASTQ格式存储。
5. 数据分析测序完成后，需要进行数据分析以获得有用的信息。
数据分析的主要步骤包括：•数据质控：对原始测序数据进行质量评估和过滤，去除低质量的序列。
全外显测序 考试题
全外显测序考试题：一、选择题（每题5分，共50分）1.全外显子测序是一种基于什么的测序技术？A. 基因组测序B. 转录组测序C. 蛋白质组测序D. 表观遗传学测序2.全外显子测序主要应用于哪些研究领域？A. 基因组结构变异研究B. 转录组调控机制研究C. 蛋白质功能和互作研究D. 疾病分子机制和药物靶点发现3.全外显子测序相比全基因组测序的优势是什么？A. 检测范围更广B. 数据分析更简单C. 检测成本更低D. 检测时间更短4.全外显子测序的局限性是什么？A. 检测范围有限B. 数据分析复杂C. 检测成本高昂D. 检测时间长5.全外显子测序的主要目的是什么？A. 发现新的基因和蛋白质B. 了解基因组的整体结构C. 研究基因的表达和调控D. 揭示疾病的分子机制6.全外显子测序通常采用哪种测序平台？A. Sanger测序平台B. Illumina测序平台C. PacBio测序平台D. Ion Torrent测序平台7.全外显子测序的数据分析主要包括哪些步骤？A. 序列比对、基因注释、变异检测、注释和解读B. 序列比对、SNP检测、基因表达分析、通路富集分析C. 序列组装、基因预测、基因功能分析、系统进化分析D. 序列比对、基因表达分析、变异检测、蛋白质互作分析8.全外显子测序在临床诊断中的应用主要是什么？A. 个体化医疗和精准治疗B. 新药研发和药物筛选C. 疾病预防和健康管理D. 生物进化研究和系统发育分析9.全外显子测序相比单基因病诊断的优势是什么？A. 提高检测的灵敏度和特异性B. 降低检测成本和时间C. 扩大检测范围和样本量D. 增加数据的可重复性和可验证性10.下列哪个不是全外显子测序的应用场景？A. 罕见病和遗传性疾病研究B. 癌症的分子分型和个性化治疗C. 农业动植物育种和遗传改良D. 法医学个体识别和亲缘关系鉴定二、简答题（每题10分，共50分）简述全外显子测序的基本原理。
说明全外显子测序在人类疾病研究中的应用价值。
panel全外显子组与全基因组测序的全方位对比
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捕获探针供应商
国外较大的提供杂交捕获探针库的供应商
Agilent SureSelect
Roche NimbleGen
IDT xGen™
Twist Bioscience Human Core Exome
国内
迪赢生物
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靶向捕获与冗余数据
液相杂交捕获技术流程图
冗余数据的产生
同源序列
目标序列
同源序列干扰
panel大小约1-2M，约占全外显子的1%-2%左右
2
检测范围与测序深度
全基因组测序 全外显子组测序 不孕不育panel
30-40X 100-150X 500X以上
3
检测方案的选择
WGS
WES panel
panel和WES，临床上如何选择？
panel具有更低廉的价格，更高的测序深度 WES具有更广泛的检测范围
表型遗传异质性较高，疾病 复杂，难以区分，需要对大 量基因进行筛查，更适合 WES或WGS。
PMID: 29398702
5
检测方案的选择
神经系统疾病/发育异常类疾病
精子异常导致的男性不育
智力障碍
小儿癫痫
线粒体病
行为异常 遗传代谢病
神经肌肉病
基因数量多达2000个以上，表型异质性高，症 状难以区分，容易误诊，更适合WES/WGS
WGS包含所有碱基，可以检测 CNV和非编码序列 panel可定制检测范围，可以加 入WES不包含的目标区域
WES测序深度还不足以区分真 假基因，深度更高的panel却有 可能做到。
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安捷伦各版本WES对比
靶标 大小
设计 大小
V8
35.1 Mb 41.6 Mb
针对外显子设计PCR测序引物教程
针对外显子设计PCR测序引物教程外显子是基因组中编码蛋白质的区域，研究外显子可以帮助我们理解基因的功能和相关疾病的发生机制。
PCR测序引物是进行PCR扩增和测序的关键组分，合理的引物设计可以提高PCR测序的准确性和可靠性。
本教程将介绍如何针对外显子设计PCR测序引物。
一、引物设计原则1.引物长度：一般而言，引物的长度应在18-30个碱基对之间，太短会导致非特异性扩增，太长则会影响扩增效率。
2.引物Tm值：引物的熔解温度（Tm）应在52-58℃之间，以确保引物在PCR反应中的稳定性。
3.引物互补性：引物之间以及引物与模板DNA的互补性应避免或最小化，以防止非特异性扩增。
4.引物特异性：引物应特异性地结合到目标外显子区域，而不结合到其他区域。
可以通过BLAST等工具对引物进行序列比对，确保引物的特异性。
5.引物GC含量和GC均匀性：引物的GC含量应在40-60%之间，同时引物的GC均匀性也应较好。
GC含量过高或过低会影响PCR反应的效率。
二、引物设计步骤2. 引物定位：根据目标外显子序列，确定引物的起始位置和结束位置。
一般而言，引物应位于外显子的边界处，以确保扩增目标外显子。
同时，可使用软件工具（如ExonPrimer、Primer3等）进行自动引物定位。
3.引物设计：根据引物设计原则，设计一对特异性引物。
通常，外显子扩增需要一对引物，即前向引物和反向引物。
前向引物应与目标外显子的正链序列互补，反向引物则应与目标外显子的负链序列互补。
4. 引物评价：使用引物评价工具（如OligoAnalyzer等）评估引物的物理性质，如Tm值、互补性和自身形成二聚体等。
并根据评价结果对引物进行优化调整，确保引物质量。
5.引物合成：将引物序列提交给合成引物的机构进行合成。
三、实验操作注意事项1.引物浓度：引物的最佳浓度应在10-50uM之间。
过高或过低的引物浓度都会影响PCR反应的效率。
2.引物储存：琼脂糖电泳检测双峰带应将引物储存在-20℃的冰箱中，避免反复冻融。
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参考文献
[1] Li Y, Vinckenbosch N, Tian G, et al. Resequencing of 200 human exomes identifies an excess of low-frequency non-synonymous coding variants. Nat Genet. 2010, 42(11): 969-972. [2] Nelson MR, Wegmann D, Ehm MG, et al. An Abundance of Rare Functional Variants in 202 Drug Target Genes Sequenced in 14,002 People. Science. 2012.
外显子测序案例分享 Nat Genet. 2010, 42(11): 969-972.
案例描述 通过对 200 个丹麦人进行外显子测序，得到大量突变；通过在群体中进行分析，认为
大量变异属于低频。 部分研究成果
采用外显子捕获芯片对 200 个丹麦人进行外显子捕获测序；平均测序深度 12X，测序 策略 PE91，最终得到的 SNP 用基于群体的数据进行分析，结果显示约 2%~4%的变异属于低 频突变。文章表明影响健康的大多数遗传因素是低频基因变异造成的，而之前这些低频基 因变异往往被研究人员忽视，新一代测序将有助于低频突变的有效检测。
技术流程:
技术参数
一、样本要求 总量：≥ 6 µg DNA； 浓度：≥ 50 ng/µL； 纯度：OD260/280=1.8-2.0。 二、测序策略： 90 PE 或 100 PE 三、推荐数据量：
外显子测序深度 > 50X 四、项目执行周期：
A. 按标准流程（不包括高级信息分析），100 个样本，平均深度 50X 的外显子测 序项目，运转周期约为 40 个工作日；
研究发现稀有遗传变异的丰度为每 17 个碱基出现一个，且呈地域局限性（如下图）。 因此，即便进行大样本量调查，对稀有变异的统计也未能完全。通过对已观察到的基因变 异模式进行建模，估算这些变异在人群中的增长参数，并统计有害基因变异的频率分布比 例及基因突变率，认为由于快速的人口增长和较弱的纯化选择，人类群体目前具有大量的 稀有基因变异；而这其中相当一部分都是有害的，与已知疾病的风险存在相关性。
摘自华大科技（BGI.Tech）官方网站: /
外显子&目标区域测序
外显子&目标区域测序是指利用特制的探针对客户感兴趣的蛋白编码区域 DNA 或某段特定 序列进行捕获，富集后进行高通量测序的基因组分析方法。该方法能够获得指定外显子&目 标区域的遗传信息，极大的提高了基因组中外显子区域的研究效率，显著降低了研究成本。 主要用于识别和研究与疾病、种群进化相关的编码区域内的结构变异。结合大量的公共数 据库提供的外显子数据，有利于更好地解释所得变异结构之间的关联和致病机理。
产品优势 研究内容 研究案例 技术流程 技术参数
产品优势:
•高性价比：较低价格得到全部外显子的基因信息； •高覆盖度：测序区域仅仅几十 M，可以增加测序深度至 50X 以上； •高信息密度：只针对编码区域进行测序，更大可能发现引起功能改变的突变；
研究内容:
一、标准信息分析 1. 对原始数据进行去除接头、污染序列及低质量 reads 的处理； 2. 测序评估（数据比对统计，测序饱和度分析，测序随机性的统计分析，Reads 在参考基 因上的分布分析）； 3. SNP 检测，注释和统计。 二、 高级信息分析 1. InDel 检测，注释和统计
2. 癌症高级信息分析 3. 复杂疾病高级信息分析
目标区域测序案例分享 Nelson MR, Wegmann D, Ehm MG, et al.
Science. 2012.
案例描述 稀有基因变异可增加复杂疾病的风险，然而人类群体中稀有基因变异的丰度仍不清楚。
研究者对 14,002 个人类个体的 202 个药物靶点编码基因进行测序，以研究这些基因变化的 范围。 部分研究成果
B. 按标准流程（不包括高级信息分析运 转周期约为 140 个工作日（含芯片定制及预实验时间）。
五、项目合格指标：
有效平均测序深度不低于合同的规定。