蛋白冻干保护剂

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4.低温、干燥保护剂的选择
• 糖类是生物制品冷冻干燥过程中使用最频繁的保护剂，这是因 为大多数糖在正常操作条件下不会结晶。并且，一般不选用还 原性糖，因为它可能与蛋白质之间发生Maillard反应。蔗糖、海 藻糖是最常用的保护剂。 • 某些聚合物，因其能提高玻璃化转变温度，而常被用作保护剂。 但是，聚合物与蛋白质分子形成氢键的能力远远低于糖类，所 以常常采用聚合物与糖联合使用。这样既可以提高配方的玻璃 化转变温度，又可以与蛋白质形成很强的氢键作用。
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5.8 冷冻干燥配方举例
• 一般来讲，蛋白质配方中固体成分含量在2%-10%之间。当 固体含量低于2%时，不能形成结实的冻干产品；而固体含 量高于10%时，又不能很好地进行冷冻干燥，即使冷冻干燥 完成，也会给复水带来困难。
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• 目前许多研究者比较赞同“水替代假说”的观点，这主要 是因为通过傅立叶红外线频谱仪（FTIR）对蛋白质分子的 结构以及蛋白质与保护剂之间的氢键作用进行直接检测， 为该理论提供了证据。
波 长cm-1 ------天然蛋白质溶液 —含有添加剂的蛋白质溶液 干扰素-γ分别在冷冻干燥固体状态和复水后的频谱图 School of Medical Instrument and Food Engineering
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其他机理 • 表面张力减小机理用来解释表面活性剂对蛋白质溶液 冻结过程的保护。 • 限制蛋白质分子扩散的机理认为许多保护剂都能够提 高溶液的黏度，抑制活性分子的扩散。
冻干干扰素-γ的频谱图。含有浓度为 1M蔗糖的冻干干扰素-γ的频谱，与 天然水溶液蛋白质极为相似；而没有 蔗糖时，频谱差异较大。在不含蔗糖 的干燥样品中，在1656cm-1处出现吸 收率减少，表示α-螺旋结构的损失， 作为补偿，相应地分别在16401645cm-1和1665-1695cm-1处出现吸 收率增加而转换成β-折叠和弯曲 （turns）结构。β-折叠结构的优先出 现，是对蛋白质与水之间氢键作用减 少的一种补偿，即代表了干燥样品中 氢键作用损失的最大程度。
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第五章 冷冻干燥的保护剂和添加剂
添加剂作用机理的几种说法 冷冻干燥配方需要注意的问题 冷冻干燥配方举例
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2.干燥过程中的保护机理
在干燥过程中，蛋白质的水合层被除去，这时，“优先作 用”机理已不再适用。在干燥过程中的保护机理，目前主 要有两大观点：（1）玻璃态假说；（2）水替代假说。
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2.缓冲剂的选择
• 有许多缓冲剂能够用于生物制品的冷冻干燥配方中，但是，并 非每一种缓冲剂都能够用于任何溶液，例如，对pH敏感的蛋白 质溶液，就应当避免使用磷酸钠缓冲剂，这是由于在冻结过程 中，Na2HPO4易于优先结晶，使得溶液的pH值降低，最终引起 蛋白质变性。 • 另外，正确选择缓冲剂的浓度也是很重要的。例如， β-牛乳糖 水溶液（2μg/ml）冷冻干燥过程中，因为甘露醇结晶而不能起 到保护作用。当添加浓度为10mM的磷酸盐缓冲液（pH7.4）后， 部分抑制了甘露醇的结晶，并且酶的活性达到95%；而将磷酸 盐缓冲液（pH7.4）的浓度提高到200mM就能够完全抑制甘露 醇结晶。
5.6 添加剂作用机理的几种说法 1.冻结过程中低温保护的机理
• 冻结过程的保护也称为低温保护。关于液体状态下保护剂蛋白质 稳定的机理，目前较被接受的是Timasheff的“优先作用”机理。 • 在冻结过程中，蛋白质溶液大多数时间是处于溶液状态，只有在 冻结快结束时，才达到最大冻结浓度。 • “优先作用”机理认为蛋白质溶液，在达到最大冻结浓度之前， 优先与水作用（优先水合）；而保护剂优先被排斥在蛋白质区 域外（优先排斥）。这是由于保护剂的加入，增大了水分子的 表面张力，促使了蛋白质分子优先与水分子相互作用。在这种情 况下，蛋白质分子外表面比其体相中有相对较多的水分子和相对 较少的保护剂分子，从而也就保护了蛋白质的天然构象。
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• 生物制品中活性组分如蛋白质也属于聚合物，具有较高的玻璃化 转变温度。因此，提高蛋白质与赋形剂之间的质量比率也可以明 显提高生物制品冷冻干燥配方的玻璃化转变温度；并且，提高蛋 白质的浓度还可以抑制赋形剂的结晶。当然，蛋白质的浓度也不 能提高得太多，否则会因为没有足够的保护剂而使得蛋白质发生 变性。 • 某些盐类也可用作生物制品在冷冻干燥过程中的保护剂。然而这 可能会降低溶液的玻璃化转变温度。所以在生物制品配方中应当 尽量少地使用盐。
3. 贮藏过程中的保护机理
• 和冷冻干燥过程一样，在冻干制品的长期贮藏过程中也存在着多 种影响因素。两者之间的主要区别在于时间尺度上。干燥过程中 出现的引起蛋白质变质的时间尺度为小时；而对于贮藏而言，时 间尺度为月或年。在正确的冷冻干燥工艺中，要求产品温度接近 于其玻璃化转变温度；而在正确的贮藏条件下，环境温度应当比 其玻璃化转变温度低得多，以获得很长的松弛时间。
1） 玻璃态假说
这种观点认为在含有保护剂溶液的干燥过程中，当浓度足 够大且保护剂不发生结晶时，保护剂与活性组分混合物就 会形成玻璃态。这种玻璃态的形成可以使得冻干品的黏度 达到1012Pa.s，这也是玻璃态的黏度。保护剂在蛋白质周围 形成玻璃体，使大分子蛋白质的链段运动受阻，阻止蛋白 质的展开和沉淀，从而抑制了蛋白质结构亚能级与结构松 弛之间的相互转换，维持蛋白质分子三维结构的稳定性。
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2） 水替代假说
由于蛋白质分子中存在大量的氢键，结合水通过氢键与蛋 白质分子联结。当蛋白质在冷冻干燥过程中失去水分后， 保护剂的羟基能够替代蛋白质表面上水的羟基，使蛋白质 表面形成一层“水合层”，这样就可以保护氢键的联结位 置不直接暴露在周围环境中，从而保持了蛋白质天然结构 和功能的完整性。
• 另外，冷冻干燥配方的pH值对冻干生物制品长期贮藏的稳 定性也会带来很大影响。酸碱度会影响固体状态下蛋白质 的物理和化学稳定性。例如，冻干的核糖核酸酶（RNase） 在贮藏过程中发生不可逆聚集程度就与蛋白质溶液冷冻干 燥前的pH值有关。
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3.填充剂的选择
• 在生物制品的配方中添加一种易于结晶的填充剂，可以取得一些功 能：为最终的冻干产品提供足够的机械支撑作用；改进冻干制品的 外观；提高配方的溶解度；防止冻干制品发生塌陷和溢出容器。 • 为此填充剂的选择要满足以下几点：有相当好的溶解性；与生物制 品中活性组分相容；没有或者很小的毒性；以及具有较高共晶温度。 甘露醇和甘氨酸就是两种常用填充剂。 • 冷冻干燥生物制品配方中的有些赋形剂可能会抑制填充剂的结晶， 从而影响生物制品的稳定性。甘露醇与蔗糖、海藻糖、乳糖或麦芽 糖的混合物中，只有当甘露醇的浓度达到30%（w/w）以上，才有结 晶现象。
• 在冻干生物制品的长期贮藏过程中，各种赋形剂对它的保护作用 机理，同样有“玻璃态假说”和“水替代假说”之争论。
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1.确定最优的pH值
• 由于生物制品中的活性组分（如蛋白质）只有在很小的pH 值范围内才是稳定的；并且不同的pH环境会影响某些蛋白 质的溶解性。所以，选择最优的pH环境有利于蛋白质的稳 定性和它在溶液中的溶解性。例如，在中性环境中冻结卵 清蛋白（ovalbumin），不会导致蛋白质变性，但在pH1.9环 境下，蛋白质的结构发生了明显的变化。
• 由于添加剂之间的物理作用是相互的，因此保持各添加剂 之间的相对合适含量是很重要的。如果某种添加剂同时能 起到几种功能，如有的糖既能起到低温保护剂的功能，又 能起到冻干保护剂的功能，那么它应当是首选的添加剂。 • 另外，应当尽量避免大量使用缓冲剂或盐类，因为它们有 可能在冻结过程中改变pH值，也有可能降低配方的玻璃化 转变温度。
5.7 冷冻干燥配方需要注意的问题
• 由于生物物料中活性组分各不相同，因而一般均须针 对物料单独配方。为了确保生物制品冷冻干燥后最大 程度地获得活性恢复率，必须充分考虑各种保护剂和 添加剂与生物制品活性组分之间的最大相容性。
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