冷冻干燥的保护剂和添加剂
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School of Medical Instrument and Food Engineering
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2. 储藏过程
• 蛋白质凝聚：是冻干生物制品活性组分在贮藏过程中发生变 性的主要因素之一。导致蛋白质凝集可能是物理（非共价） 相互作用，也可能是蛋白质发生化学凝集（共价）。 • 脱酰胺作用：也是蛋白质发生变性的主要途径之一。天冬酰 胺（Asn）和谷氨酰胺（Gln）是蛋白质中易于发生脱酰胺作 用的两种氨基酸。 • 非酶褐变：也称作Maillard反应。它使得还原性糖（如葡萄糖） 与蛋白质中的赖氨酸（lysine）和精氨酸（arginine）形成碳水 络合物。 • 氧化反应：蛋白质中蛋氨酸Met，胱氨酸Cys，组氨酸His，色 氨酸Trp和酪氨酸Tyr残基的侧链是发生氧化反应的可能位臵。 • 水解作用: 虽然冻干的蛋白质中含有极少量的水分，但在贮藏 过程中仍然会发生水解作用。
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• 如前所述，生物制品的冷冻干燥过程是一个多步骤过 程，会产生低温、冻结和脱水等多种效应；即使成功 完成冷冻干燥过程后，在长期保存过程中也很难保证 冻干生物制品活性组分的稳定性。为了防止生物制品 在冷冻干燥和贮藏过程中活性组分的变性，研究者们 研究和探索了大量有效的保护添加剂。
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5.3 糖/多元醇类保护剂 1. 糖和多元醇的定义
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• 在冷冻干燥配方中，除了活性组分和溶剂以外，还要使用多 种添加剂。这些添加剂，有的被称为保护剂,有的被称为添加剂， 而又有的被称为赋形剂（excipient），至今没有统一的叫法。赋形 剂一词来源于药剂学，原来是指构成药物或抗原的无活性物 质辅料 (如阿拉伯胶、糖浆、淀粉)，特别是指在药物混合物 中有大量液体情况下，为使混合物有较高的粘性，以便制备 丸剂或片剂而加入的物质。而后来，赋形剂的l Instrument and Food Engineering
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3.低聚糖
• 在许多生物制品的冷冻干燥过程中，常常采用低聚糖，尤 其是二糖作为保护剂，这是因为二糖既能在冻结过程中起 到低温保护剂的功能；又能在干燥脱水过程中起到脱水保 护剂的作用。 • 二糖又分为还原性二糖和非还原性二糖，其中还原性二糖 包括乳糖（lactose）、麦芽糖（maltose）等，非还原性二糖 包括海藻糖（trehalose）和蔗糖（sucrose）等。
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第五章 冷冻干燥的保护剂和添加剂
冻干过程和储藏过程的变性机理 冷冻干燥保护添加剂的分类 糖/多元醇类保护剂 聚合物类保护剂 表面活性剂类、氨基酸类的保护剂
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（2）在生物制品溶液在冻结过程中也会产生大量的冰-水界面。 其中活性组分分子，如蛋白质，可能会被吸附到界面上，从而可 能破坏蛋白质的天然褶皱结构，最终导致蛋白质变性。 （3）在有些生物制品溶液的冻结过程中，溶液的pH值也会发生 变化。如在添加有pH值为7的磷酸盐缓冲液（NaH2PO4和 Na2HPO4的摩尔比为0.72）的蛋白质溶液冻结过程中，由于 NaH2PO4的溶解度远远大于Na2HPO4，当溶液达到三相共晶点时， 它们之间的摩尔比为57，最终导致了pH值的很大改变。蛋白质 发生物理聚集和化学变性。
据文献资料统计，“赋形剂”一词在冷冻干燥配方中用得比较多。
• 在生物制品的冷冻干燥配方中，有些赋形剂只能起到某一特 定的作用；而有些赋形剂可以同时起到几方面的作用。如 PVP既可用作低温保护剂，同时也可以用作填充剂。对保护 剂在配方中具体起什么作用，有时很难严格区分开来。即使 是同一种物质，在不同的冻干品也可能表现出不同的作用。
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5.2 冷冻干燥保护添加剂的分类
按分子量分类
• 低分子量化合物：又可以分为酸性物质、中性物质和碱性物质。 酸性物质主要为谷氨酸、天冬氨酸、苹果氨酸、乳酸等；中性 物质主要为葡萄糖、肌醇、乳糖、蔗糖、棉籽糖、海藻糖、山 梨醇D、L-苏氨酸、肌醇、木糖醇等；碱性物质主要为精氨酸 和组氨酸等。 • 高分子化合物：主要如白蛋白、明胶、蛋白胨、可溶性淀粉、 糊精、肉汁、果胶、阿拉伯胶、羟甲基纤维素、藻类等以及天 然混合物如脱脂牛奶、血清等。 • 一般认为，低分子化合物在冻干过程中直接发挥作用；而高分 子化合物则是促进低分子化合物的保护作用。因此，制备保护 剂配方时，一般多将低、高分子化合物配合使用。
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按物质的种类分类
• 糖/多元醇类(sugars/polyols)、 • 聚合物类(polymers)、
• 表面活性剂类(surfactants)、
• 氨基酸类(amino acids) • 盐类(salts)
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5.1 冻干过程和储藏过程的变性机理 1. 冷冻和干燥过程
在生物制品的冷冻干燥过程中，主要有三种效应会导致生物制 品中活性组分的变性：低温效应、冻结效应和脱水效应。
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• 脱水效应
（1）水溶液中蛋白质经过充分水合作用后，在蛋白质分子表面附 着一单层水，这就是所说的水合层(hydration shell)。一般来讲， 参与完全水合作用的水含量为0.3-0.35g（水）/g（蛋白质）。 而在冻干蛋白质产品中水的含量一般不超过10%，因此，必定 有一部分结合水在干燥过程中被除去。 （2）结合水的去除很可能破坏蛋白质的天然结构，最终导致蛋白 质变性。这是因为富含结合水的蛋白质在脱水过程中暴露在乏 水环境中，将质子转化为带电羧酸基团，破坏了蛋白质中电荷 平衡，电荷密度的降低可能促进蛋白质分子之间的疏水作用， 从而使蛋白质发生聚集 。
• 低温效应
生物制品中活性组分在降温与复温过程的一定温度范围内会发 生变性。如对卵清蛋白(ovalbumin)的研究发现，在-10℃~-40℃ 之间，其活性显著降低，而继续降温到在-192℃，活性几乎没 有变化。
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• 在食品、药品以及生物体的冷冻干燥和贮藏过程中，很多因素 （例如，化学成分、冻结速率、冻结和脱水应力、玻璃化转变 温度、干燥固体中剩余水分、贮藏环境的温度和湿度等）都会 影响其中活性组分的稳定性甚至会导致失活。 • 大量的实验研究表明，除了一些食品、人血浆、牛奶等少数物 料可以直接冷冻干燥外；大多数的药品和生物制品，都需要添 加合适的冷冻干燥保护剂和添加剂，配制成混合液后，才能进 行有效的冷冻干燥和贮藏。
• 酸碱调整剂（buffer agent, PH modifier ）：在冷冻干燥过程和贮藏过程 中，能将生物制品的pH值调整到活性物质的最稳定区域的物质，如磷酸、 山梨醇、EDTA（乙二胺四醋酸二纳）、氨基酸等。
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按保护剂功能和性质分类
• 冻干保护剂（lyoprotectant）：在冻结和干燥过程中，可以防止活性组分 发生变性的物质，如甘油、二甲亚砜（DMSO）、海藻糖、蔗糖、聚乙烯 吡咯烷酮（PVP）等； • 填充剂（bulking agent，bulking compound）：能防止有效组分随水蒸气 一起升华逸散，并使有效组分成形的物质，如甘露醇、乳糖、明胶等； • 抗氧化剂（antioxidant）：用作防止生物制品在冷冻干燥过程以及贮藏过 程中发生氧化变质的物质，如维生素D、维生素E、蛋白质水解物、硫代 硫酸钠等；
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• 糖的主要组成元素是碳、氢、氧；而且其中氢和氧的比例总是2 ： 1，恰好与水中氢和氧的比例相同，所以，糖类也被称为碳水化 合物（carbohydrate）。糖类一般可分为单糖、低聚糖和多糖三 类。单糖是糖类中不能再水解的化合物，是最小分子的糖，如葡 萄糖、果糖、半乳糖、核糖等；低聚糖指能被水解成2-10个单糖 分子的糖，主要有蔗糖、麦芽糖、乳糖、海藻糖、棉子糖等；多 糖指能被水解成更多的单糖和低聚糖的糖，主要有淀粉、纤维素、 果胶等。 • 含有两个或两个以上羟基的醇统称为多元醇，又称糖醇（sugar alcohol）。在生物制品的低温冻结、解冻、冷冻干燥以及保存过 程中，使用较多的是多元醇包括丙三醇（甘油）、山梨醇和甘露 醇。由于糖和多元醇的官能团都是羟基，所以，它们用作低温保 护剂和冷冻干燥保护剂时，具有一定的共性。
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2.单糖
• 从理论上讲，在生物制品的冷冻干燥过程中，如果糖类与 生物制品活性组分的分子形成氢键而替代了原有水的位臵， 那么，它对这些生物制品就能够提供保护作用。 • 实验证明，单糖（如葡萄糖、半乳糖）对蛋白质的冷冻干 燥过程不能起到保护作用，这是因为单糖在冻结过程中只 能提供非常微弱的稳定作用，使得蛋白质在脱水干燥前就 发生了不可逆变性。而相同浓度的海藻糖在冻结过程和脱 水过程中却都能提供有效的保护作用。 • 目前的生物制品的冷冻干燥配方中，一般不单独使用单糖 作为保护剂，而是经常和其它赋形剂联用。
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• 冻结效应（包括离子浓度的增加、冰晶的形成与生长、pH值变化 以及相分离等 ）
（1）在生物制品的冻结过程中，不断结晶会导致溶液的浓度快速 升高。小分子糖在最大冻结浓缩基质中的计算浓度高达80%。当 溶液浓度发生变化时，离子浓度增加，促进了化学反应。
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2. 储藏过程
• 蛋白质凝聚：是冻干生物制品活性组分在贮藏过程中发生变 性的主要因素之一。导致蛋白质凝集可能是物理（非共价） 相互作用，也可能是蛋白质发生化学凝集（共价）。 • 脱酰胺作用：也是蛋白质发生变性的主要途径之一。天冬酰 胺（Asn）和谷氨酰胺（Gln）是蛋白质中易于发生脱酰胺作 用的两种氨基酸。 • 非酶褐变：也称作Maillard反应。它使得还原性糖（如葡萄糖） 与蛋白质中的赖氨酸（lysine）和精氨酸（arginine）形成碳水 络合物。 • 氧化反应：蛋白质中蛋氨酸Met，胱氨酸Cys，组氨酸His，色 氨酸Trp和酪氨酸Tyr残基的侧链是发生氧化反应的可能位臵。 • 水解作用: 虽然冻干的蛋白质中含有极少量的水分，但在贮藏 过程中仍然会发生水解作用。
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• 如前所述，生物制品的冷冻干燥过程是一个多步骤过 程，会产生低温、冻结和脱水等多种效应；即使成功 完成冷冻干燥过程后，在长期保存过程中也很难保证 冻干生物制品活性组分的稳定性。为了防止生物制品 在冷冻干燥和贮藏过程中活性组分的变性，研究者们 研究和探索了大量有效的保护添加剂。
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5.3 糖/多元醇类保护剂 1. 糖和多元醇的定义
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• 在冷冻干燥配方中，除了活性组分和溶剂以外，还要使用多 种添加剂。这些添加剂，有的被称为保护剂,有的被称为添加剂， 而又有的被称为赋形剂（excipient），至今没有统一的叫法。赋形 剂一词来源于药剂学，原来是指构成药物或抗原的无活性物 质辅料 (如阿拉伯胶、糖浆、淀粉)，特别是指在药物混合物 中有大量液体情况下，为使混合物有较高的粘性，以便制备 丸剂或片剂而加入的物质。而后来，赋形剂的l Instrument and Food Engineering
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3.低聚糖
• 在许多生物制品的冷冻干燥过程中，常常采用低聚糖，尤 其是二糖作为保护剂，这是因为二糖既能在冻结过程中起 到低温保护剂的功能；又能在干燥脱水过程中起到脱水保 护剂的作用。 • 二糖又分为还原性二糖和非还原性二糖，其中还原性二糖 包括乳糖（lactose）、麦芽糖（maltose）等，非还原性二糖 包括海藻糖（trehalose）和蔗糖（sucrose）等。
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第五章 冷冻干燥的保护剂和添加剂
冻干过程和储藏过程的变性机理 冷冻干燥保护添加剂的分类 糖/多元醇类保护剂 聚合物类保护剂 表面活性剂类、氨基酸类的保护剂
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（2）在生物制品溶液在冻结过程中也会产生大量的冰-水界面。 其中活性组分分子，如蛋白质，可能会被吸附到界面上，从而可 能破坏蛋白质的天然褶皱结构，最终导致蛋白质变性。 （3）在有些生物制品溶液的冻结过程中，溶液的pH值也会发生 变化。如在添加有pH值为7的磷酸盐缓冲液（NaH2PO4和 Na2HPO4的摩尔比为0.72）的蛋白质溶液冻结过程中，由于 NaH2PO4的溶解度远远大于Na2HPO4，当溶液达到三相共晶点时， 它们之间的摩尔比为57，最终导致了pH值的很大改变。蛋白质 发生物理聚集和化学变性。
据文献资料统计，“赋形剂”一词在冷冻干燥配方中用得比较多。
• 在生物制品的冷冻干燥配方中，有些赋形剂只能起到某一特 定的作用；而有些赋形剂可以同时起到几方面的作用。如 PVP既可用作低温保护剂，同时也可以用作填充剂。对保护 剂在配方中具体起什么作用，有时很难严格区分开来。即使 是同一种物质，在不同的冻干品也可能表现出不同的作用。
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5.2 冷冻干燥保护添加剂的分类
按分子量分类
• 低分子量化合物：又可以分为酸性物质、中性物质和碱性物质。 酸性物质主要为谷氨酸、天冬氨酸、苹果氨酸、乳酸等；中性 物质主要为葡萄糖、肌醇、乳糖、蔗糖、棉籽糖、海藻糖、山 梨醇D、L-苏氨酸、肌醇、木糖醇等；碱性物质主要为精氨酸 和组氨酸等。 • 高分子化合物：主要如白蛋白、明胶、蛋白胨、可溶性淀粉、 糊精、肉汁、果胶、阿拉伯胶、羟甲基纤维素、藻类等以及天 然混合物如脱脂牛奶、血清等。 • 一般认为，低分子化合物在冻干过程中直接发挥作用；而高分 子化合物则是促进低分子化合物的保护作用。因此，制备保护 剂配方时，一般多将低、高分子化合物配合使用。
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按物质的种类分类
• 糖/多元醇类(sugars/polyols)、 • 聚合物类(polymers)、
• 表面活性剂类(surfactants)、
• 氨基酸类(amino acids) • 盐类(salts)
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5.1 冻干过程和储藏过程的变性机理 1. 冷冻和干燥过程
在生物制品的冷冻干燥过程中，主要有三种效应会导致生物制 品中活性组分的变性：低温效应、冻结效应和脱水效应。
School of Medical Instrument and Food Engineering
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• 脱水效应
（1）水溶液中蛋白质经过充分水合作用后，在蛋白质分子表面附 着一单层水，这就是所说的水合层(hydration shell)。一般来讲， 参与完全水合作用的水含量为0.3-0.35g（水）/g（蛋白质）。 而在冻干蛋白质产品中水的含量一般不超过10%，因此，必定 有一部分结合水在干燥过程中被除去。 （2）结合水的去除很可能破坏蛋白质的天然结构，最终导致蛋白 质变性。这是因为富含结合水的蛋白质在脱水过程中暴露在乏 水环境中，将质子转化为带电羧酸基团，破坏了蛋白质中电荷 平衡，电荷密度的降低可能促进蛋白质分子之间的疏水作用， 从而使蛋白质发生聚集 。
• 低温效应
生物制品中活性组分在降温与复温过程的一定温度范围内会发 生变性。如对卵清蛋白(ovalbumin)的研究发现，在-10℃~-40℃ 之间，其活性显著降低，而继续降温到在-192℃，活性几乎没 有变化。
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• 在食品、药品以及生物体的冷冻干燥和贮藏过程中，很多因素 （例如，化学成分、冻结速率、冻结和脱水应力、玻璃化转变 温度、干燥固体中剩余水分、贮藏环境的温度和湿度等）都会 影响其中活性组分的稳定性甚至会导致失活。 • 大量的实验研究表明，除了一些食品、人血浆、牛奶等少数物 料可以直接冷冻干燥外；大多数的药品和生物制品，都需要添 加合适的冷冻干燥保护剂和添加剂，配制成混合液后，才能进 行有效的冷冻干燥和贮藏。
• 酸碱调整剂（buffer agent, PH modifier ）：在冷冻干燥过程和贮藏过程 中，能将生物制品的pH值调整到活性物质的最稳定区域的物质，如磷酸、 山梨醇、EDTA（乙二胺四醋酸二纳）、氨基酸等。
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按保护剂功能和性质分类
• 冻干保护剂（lyoprotectant）：在冻结和干燥过程中，可以防止活性组分 发生变性的物质，如甘油、二甲亚砜（DMSO）、海藻糖、蔗糖、聚乙烯 吡咯烷酮（PVP）等； • 填充剂（bulking agent，bulking compound）：能防止有效组分随水蒸气 一起升华逸散，并使有效组分成形的物质，如甘露醇、乳糖、明胶等； • 抗氧化剂（antioxidant）：用作防止生物制品在冷冻干燥过程以及贮藏过 程中发生氧化变质的物质，如维生素D、维生素E、蛋白质水解物、硫代 硫酸钠等；
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• 糖的主要组成元素是碳、氢、氧；而且其中氢和氧的比例总是2 ： 1，恰好与水中氢和氧的比例相同，所以，糖类也被称为碳水化 合物（carbohydrate）。糖类一般可分为单糖、低聚糖和多糖三 类。单糖是糖类中不能再水解的化合物，是最小分子的糖，如葡 萄糖、果糖、半乳糖、核糖等；低聚糖指能被水解成2-10个单糖 分子的糖，主要有蔗糖、麦芽糖、乳糖、海藻糖、棉子糖等；多 糖指能被水解成更多的单糖和低聚糖的糖，主要有淀粉、纤维素、 果胶等。 • 含有两个或两个以上羟基的醇统称为多元醇，又称糖醇（sugar alcohol）。在生物制品的低温冻结、解冻、冷冻干燥以及保存过 程中，使用较多的是多元醇包括丙三醇（甘油）、山梨醇和甘露 醇。由于糖和多元醇的官能团都是羟基，所以，它们用作低温保 护剂和冷冻干燥保护剂时，具有一定的共性。
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2.单糖
• 从理论上讲，在生物制品的冷冻干燥过程中，如果糖类与 生物制品活性组分的分子形成氢键而替代了原有水的位臵， 那么，它对这些生物制品就能够提供保护作用。 • 实验证明，单糖（如葡萄糖、半乳糖）对蛋白质的冷冻干 燥过程不能起到保护作用，这是因为单糖在冻结过程中只 能提供非常微弱的稳定作用，使得蛋白质在脱水干燥前就 发生了不可逆变性。而相同浓度的海藻糖在冻结过程和脱 水过程中却都能提供有效的保护作用。 • 目前的生物制品的冷冻干燥配方中，一般不单独使用单糖 作为保护剂，而是经常和其它赋形剂联用。
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• 冻结效应（包括离子浓度的增加、冰晶的形成与生长、pH值变化 以及相分离等 ）
（1）在生物制品的冻结过程中，不断结晶会导致溶液的浓度快速 升高。小分子糖在最大冻结浓缩基质中的计算浓度高达80%。当 溶液浓度发生变化时，离子浓度增加，促进了化学反应。