枯草芽孢杆菌冷冻干燥保护剂的初步研究

枯草芽孢杆菌冷冻干燥保护剂的初步研究摘要：为提高枯草芽孢杆菌菌粉冻干存活率，对其冻干保护剂进行筛选和优化。

采用单因素筛选试验和正交试验，通过分析菌粉冻干存活率，筛选优化出最佳复合保护剂的组成。

最终确定枯草芽孢杆菌最佳冻干保护剂的配方为：脱脂乳粉10%、L-抗坏血酸钠3%、海藻糖2%，菌种冻干存活率高达(90.01±1.31)%。

本研究对枯草芽孢杆菌菌种的保藏、应用、活菌产品质量的稳定以及新产品的开发均有一定的理论指导意义。

关键词：枯草芽孢杆菌；冻干保护剂；正交设计；冻干菌粉Preliminary Research on the cryoprotectant of Bacillussubtilis PowderAbstract：Study on the technology of selection and optimization of Bacillus subtilis freeze-dried powder, in order to improve the survival rates of Bacillus subtilis.The single factor and orthogonal test were taken, through analysis of the survival bacteria, and then optimized the best form of composite protective agent. The final determination of the effective lyophilized formulation protection agent: 10% skim milk powder, 3% L-sodium ascorbate, 2% trehalose, the results showed the survival rates was up to (90.01 ± 1.31)%. The protection agent of Bacillus subtilis was optimized that provided a certain theoretical significance for preservation and application of Bacillus subtilis, stable quality of products and the development of new products Keywords: Bacillus subtilis cryoprotectant orthogonal design freeze-dried powder 0 引言枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)是一种嗜温性好氧产芽孢的革兰式阳性杆菌。

该菌其生理特征丰富多样，分布广泛，易分离培养，对环境无污染，对人畜无毒害，且能产生多种抗菌素和酶，具有广谱抗菌活性[1]。

该菌所产的芽孢对高温和某些化学物质具有较强的抗逆性，为剂型加工及其在环境中的存活、定殖与繁殖奠定了理论基础。

枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) 具有多种功能，是一种可应用于多个领域的优良菌种，例如可作为微生物农药、微生物饲料添加剂、生物有机肥接种剂、净水剂等[2-3]。

近年来，随着微生态学研究地不断深入，枯草芽孢杆菌作为一种有益菌得到了广泛的研究和开发。

然而，由于长期保存较困难，且变异机率较大，故枯草芽孢杆菌的保藏成了研究的热门课题。

利用真空冷冻干燥保存菌种是多种菌种保藏方法中较为理想的一种，然而真空冷冻干燥过程中由于环境、温度和压力的急剧变化，导致部分菌体细胞某些酶钝化、失活、细胞受到损伤甚至死亡[4-5]。

因此，真空冷冻干燥过程中应选择合适的保护剂来降低靶标菌在冻干过程中的死亡率。

不同的保护剂对不同菌种的保护效果也不尽相同，一般来讲，单一保护剂的保护效果不及复配保护剂[6]。

只有选择合适有效的复配保护剂，使其尽可能保护靶标菌的生物活性和生理生化特征，从而减轻冷冻和真空过程中对靶标菌的损伤[7]。

本研究以前期从某商品化的枯草芽孢杆菌菌粉中分离纯化的一株枯草芽孢杆菌为研究对象，采用单因素试验及正交试验对抗冻保护剂的组成及浓度进行了优化，以期最大限度地发挥保护剂的保护功能，减少菌体在真空冷冻干燥过程中的死亡率，为枯草芽孢杆菌高效冻干粉的研制提供依据。

1材料与方法1.1 材料1.1.1 供试菌种枯草芽孢杆菌（肥料级），由三门峡龙飞生物工程有限公司、河南省农业微生物工程技术研究中心提供。

1.1.2 培养基牛肉膏蛋白胨液体培养基：牛肉膏10g，蛋白胨8g，葡萄糖10g，氯化钠5g，水1000mL，高压蒸汽灭菌30min。

计数培养基：营养琼脂。

1.1.3 保护剂溶液的配制固体按照质量与体积比、液体按照体积与体积比配制所需浓度的保护剂溶液。

1.2 主要试剂和仪器1.2.1 主要试剂脱脂乳粉为食品级，市场购买；牛肉膏、蛋白胨、葡萄糖、氯化钠、营养琼脂粉、海藻糖、甘油、吐温80、蔗糖、L-抗坏血酸钠等，以上试剂均为分析纯试剂。

1.2.2 主要仪器超低温冰箱、真空冷冻干燥机、恒温培养箱、温控摇床、离心机、安瓿熔封机、高频电火花等。

1.3 方法1.3.1 工艺流程加入保护剂冻干前活菌计数菌种活化扩大培养离心收集菌体菌体悬浮液的制备预冻真空冷冻干燥冻干粉真空熔封真空度检测活菌计数1.3.2 冻干保护剂单因素试验取两环活化的枯草芽孢杆菌，接种于200mLl牛肉膏蛋白胨液体培养基中，37℃、180r/min 培养24h。

将上述发酵液6000rpm离心10min，收集菌体，用适量无菌生理盐水悬浮，4℃保存备用。

参照有关文献[8-11]及实验室前期的研究工作，选取脱脂乳粉、海藻糖、甘油、吐温80、蔗糖、L-抗坏血酸钠6种材料作为单因素试验的筛选对象。

供试保护剂的种类及浓度见表1。

将保护剂母液配制成所需浓度的两倍，脱脂乳粉115℃灭菌15min，其它5种保护剂溶液121℃灭菌20min，备用。

然后将6种保护剂分别与菌悬液等体积混合，制成浓菌液，每支安瓿管分装2.0mL。

预冻前先放入4℃冰箱中平衡40min，使菌体与保护剂充分混匀。

然后置于-20℃冰箱中冷冻预冷2h，随后转入-50℃冰箱中冷冻过夜。

将冷冻后的样品安瓿管插于真空冷冻干燥机的橡胶阀下接口进行冻干，至菌粉的含水量降至3%-5%即可收获成品，真空封口并进行真空度检验，合格样品放入-50℃冰箱，保存备用。

表1 供试保护剂的种类及浓度Table1 The kinds and concentration of protective agents保护剂保护剂浓度（%）空白加等体积的无菌水海藻糖 2 4 6 8 10脱脂乳 6 8 10 12 14甘油 1 2 3 4 5吐温80 1 2 3 4 5蔗糖 2 4 6 8 10 L-抗坏血酸 1 2 3 4 51.3.3 正交试验优化抗冻保护剂由于当正交试验做方差分析时，必须估计随机误差，故正交表的表头中必须余留空白列，以确定随机误差引起的离差平方和。

根据单因素试验结果，本研究建立4 因素3水平（包括一列空白列）的L9（34）正交试验，确定3种在单因素试验中有较好保护效果的保护剂的复配效果。

正交试验影响因素水平选择见表2。

表2正交试验因素水平表Table 2 Factor level of orthogonal test因素水平脱脂乳A(%) 海藻糖B(%) L-抗坏血酸钠C(%) 空白D(%)1 102 1 ——2 12 4 2 ——3 14 6 3 ——1.3.4活菌计数及冻干存活率的计算冻干前后均采用通用检测方法NY/T 1461-2007进行活菌计数，菌体冻干存活率的计算公式如下：存活率= 冻干后样品用生理盐水恢复至原体积测得的活菌数／冻干前测得的活菌数×100%2结果与分析2.1 单因素试验结果本研究将脱脂乳粉、海藻糖、甘油、吐温80、蔗糖、L-抗坏血酸钠6种不同浓度的保护剂分别进行单因素试验，各因素均以不加保护剂的处理为对照组。

通过分析各处理组样品冻干存活率，来判断其对菌体的保护作用，结果见图1。

如图1所示，其中10%的脱脂乳粉对枯草芽孢杆菌的保护效果最好，菌种冻干存活率高达（84.45±1.29）%；而所对应的不加保护剂的对照组，菌种冻干存活率仅为（7.85±1.00）%。

这可能是由于脱脂乳中的乳清蛋白在菌体表面形成蛋白膜对细胞加以保护，同时固定酶类，防止因细胞壁蛋白质损坏而引起的胞内物质泄漏，并为冻干的样品提供了一种轻而多空的疏松结构，大大增强了菌粉的复水性，提高了菌粉的冻干存活率[12-13]。

其它保护剂中，L-抗坏血酸钠和海藻糖的保护效果较好，这是因为L-抗坏血酸钠是一种水溶性极强的抗氧化剂，能使枯草芽孢杆菌在冻干过程中免遭氧气的影响，保持细胞活性并提高稳定性[14-15]。

另外，海藻糖具有多个羟基可以与菌体细胞表面自由基联结起来，避免菌体暴露在介质中，还可与蛋白质形成氢键以取代水，从而保证蛋白质的稳定性[16]。

目前关于海藻糖保护机制主要有两种假说：一种称为“水替代”假说；另一种称为“玻璃态”假说[17-18]。

然而，这两种假说均还不能完全解释现有的试验现象。

因此，海藻糖保护生物活性物质的机理，仍需深入研究。

图1 不同保护剂对枯草芽孢杆菌冻干存活率的影响Fig.1 The effect of different cryoprotectant on the survival rates of Bacillus subtilis 由图1可以看出，在一定浓度范围内，随着保护剂浓度的增加，菌粉冻干存活率也随之增加；然而当达到一定临界值时，若保护剂浓度继续增加，菌粉冻干存活率反而呈现下降趋势。

故保护剂的浓度存在一个最佳浓度，过高或者过低均不能达到最佳效果。

其中10%–14%脱脂乳粉对菌种的保护效果最为显著；此外1%–3%的L-抗坏血酸钠及2%–6%的海藻糖对菌种的保护效果也较好；而选用甘油、吐温80和蔗糖作为保护剂时，菌种的冻干存活率较低。

因此，正交试验时选用脱脂乳粉、L-抗坏血酸钠和海藻糖来配制抗冻效果显著的复合保护剂。

2.2 正交试验优化冻干保护剂的最佳复配比例根据正交试验结果分析表明，单一保护剂的抗冻保护效果存在局限性，而复配保护剂体系中每种保护剂成分在冷冻干燥过程中都发挥各自的作用，同时相互间又具有协同作用[19]，其配比与存活率的关系见表3。

其中由极差分析可知，影响菌种冻干存活率的主次因素由大到小依次为：A（脱脂乳粉）﹥C（L-抗坏血酸钠）﹥B（海藻糖）；由此说明上述3种保护剂中，脱脂乳粉对菌种冻干存活率的影响最为显著，其次是L-抗坏血酸钠及海藻糖；故复配保护剂的最优组合为：A1B1C3，即脱脂乳粉10%，L-抗坏血酸钠3%，海藻糖2%。