TCA-丙酮沉淀法浓缩蛋白

真菌蛋白提取方法

真菌蛋白提取方法一TCA/丙酮法1 液氮将菌体研磨为粉末；2 向匀浆中加入10倍体积的丙酮（含13.3% (w/v) TCA和0.093% β巯基乙醇），过夜沉降；3 4 度20,000g 离心15 min；4 移处上清，用冰冷的含0.07% (v/v) β－巯基乙醇的丙酮清洗沉淀两次；5 离心后，沉淀干燥至丙酮挥发完全。

二酚抽提法1 在液氮中将 1g 菌体研磨为粉末2 加入 6 ml 水饱和酚（buffer-saturated phenol）和 2 ml提取液（20mMTris-Cl, pH 7.5, 0.5% Triton X-100 (v/v), 0.5M EDTA, pH 7.5, pH 8.0,0.07% β－巯基乙醇, protease inhibitors）。

3 在4度混合30分钟。

4 12000 rmp 离心1min，使两相分开。

5 弃沉淀，吸取上层的苯酚相，加入5倍体积的冷丙酮，-20度沉降2h。

6 12000 rmp，4度，离心15分钟沉淀蛋白，弃去上清。

7 沉淀干燥至丙酮挥发完全。

三提取液抽提丙酮沉淀法1 预先将研钵置于－20℃的冰箱内冷冻。

2 取液氮冻存的菌体，放入预冷的研钵内研磨至粉末状。

3 向匀浆中加入2倍体积的抽提液（20mM Tris-Cl, pH 7.5, 0.5% Triton X-100(v/v), 0.5M EDTA, pH 7.5, pH 8.0, 0.07% β－巯基乙醇, protease inhibitors）。

4 混匀后4度震荡30分钟，以便蛋白溶解。

5 12000 rmp，4度，离心15分钟，吸取上清于另一EP管中。

7 向上清液中加入5倍体积的预冷丙酮（含有0.07％β－巯基乙醇），混匀，－20℃，2小时沉淀蛋白质。

8 12000 rmp，4度，离心15分钟沉淀蛋白。

弃去上清，沉淀用乙醇洗三次，自然干燥蛋白沉淀。

四甲醇氯仿水沉淀法Chloroform /Methanol/Water Precipitation1 预先将研钵置于－20℃的冰箱内冷冻。

TCA蛋白沉淀方法

100% (w/v)三氯乙酸的配制方法：500g三熬乙酸用227ml水来溶無，所得溶液即100%三氯乙酸溶液。

避光,4度保(preparation of 100% TCA: 454ml H2O/kgTCA. Maintain in dark bold cat 4oC.Bc careful, use gloves!!!).培养基上清直接电泳跑出来的条带经常很难看，可以TCA沉淀浓缩后跑电泳，一般表达量大于可以看到明显条带，这是我用的TCA沉淀方法，效果很好：1 •菌液1000(也，离心5分钟，收集表达上清。

2•取500-10(X)ul ±清于EP管中，加入1/9体积的100%TCA,颠倒1()次混匀。

3•样品置于冰浴中大于0.5小时，过夜效果更好。

4.15000g,离心10-20分钟,可见有棕黑色沉淀，倒掉上清，将EP管倒扣在吸水纸上轻轻控几下，除去残余在管口的液体。

5.将EP管倒置于吸水纸长，37度烘箱10-20分钟，待管底无明显液体残留，如杲管壁还残留有液体，可以吸水纸吸掉。

可以改成室温或用电吹风，关犍是除去管底和管壁残余液体。

6.15OOOg,离心10-20分钟，用20ul枪头尽量吸去管底残余的液体，此步骤要快，不然沉淀容易散开，降低蛋白回收率，一般最多几ul或者没有，注意不要吸到沉淀。

7.EP管倒置于吸水纸长，37度烘箱5分钟，确认管壁和管底没有液体残留。

&加入20-50ul Loading buffer, 95度加热lOnim, —般沉淀会自动溶解，如果不溶，用手指轻弹管壁或用2()ul枪头轻轻吸打，注意整个操作尽量不要碰到管壁, 因为管壁可能沾有残余TCA。

如果蓝色的Loading buffer不变成黄色，说明残余TCA吸弃了干净，如果变黄，一般不影响电泳。

此方法连丙酮洗这一步都省了，而且不影响电泳效杲。

或者第5步和第6步改为丙酮洗:5•加入2()0u】冰冷的丙酮，用手指轻弹EP管，洗去管底和管壁残余的TCA。

植物组织蛋白提取方法

植物蛋白质提取方法总汇一、植物组织蛋白质提取方法1、根据样品重量（1g 样品加入3.5ml 提取液，可根据材料不同适当加入），准备提取液放在冰上。

2、把样品放在研钵中用液氮研磨，研磨后加入提取液中在冰上静置（3-4 小时）。

3、用离心机离心8000rpm40min4 C或11100rpm20min4 °C4、提取上清液，样品制备完成。

蛋白质提取液：300ml1 、1Mtris-HCl （PH8）45ml2、甘油（Glycerol ）75ml3、聚乙烯吡咯烷酮（Polyvinylpolypyrrordone ）6g这种方法针对SDS-PAGE垂直板电泳！二、植物组织蛋白质提取方法氯醋酸—丙酮沉淀法1 、在液氮中研磨叶片2、加入样品体积3倍的提取液在-20 C的条件下过夜，然后离心（4 C 8000rpm以上1 小时）弃上清。

3、加入等体积的冰浴丙酮（含0.07%的3 -巯基乙醇），摇匀后离心（4C 8000rpm 以上1 小时），然后真空干燥沉淀，备用。

4、上样前加入裂解液，室温放置30 分钟，使蛋白充分溶于裂解液中，然后离心（15C 8000rpm以上1小时或更长时间以没有沉淀为标准），可临时保存在 4 C待用。

5、用Brandford法定量蛋白，然后可分装放入-80 C备用。

药品：提取液：含10%TCA和0.07%的3 -巯基乙醇的丙酮。

裂解液：2.7g尿素0.2gCHAPS 溶于3ml灭菌的去离子水中（终体积为5ml），使用前再加入1M的DTT65ul/ml。

这种方法针对双向电泳，杂质少，离子浓度小的特点！当然单向电泳也同样适用，只是电泳的条带会减少！三、组织：肠黏膜目的：WESTERN BLO检测凋亡相关蛋白的表达应用TRIPURE提取蛋白质步骤：含蛋白质上清液中加入异丙醇：（1.5ml每ImITRIPURE用量）倒转混匀，置室温10min离心：12000 g，10min，4 度，弃上清加入0.3M盐酸胍/95 %乙醇：（2ml每ImITRIPURE用量）振荡，置室温20min离心：7500g ，5 min ，4 度，弃上清重复0.3M 盐酸胍/95 %乙醇步2 次沉淀中加入100%乙醇2ml充分振荡混匀，置室温20 min离心：7500g ，5min，4 度，弃上清吹干沉淀1 % SDS溶解沉淀离心：10000g，10min ，4 度取上清-20 度保存（或可直接用于WESTERN BLO）T存在的问题：加入1%SDS后沉淀不溶解，还是很大的一块，4度离心后又多了白色沉定，SDS结晶？测浓度，含量才1mg/ml左右。

TCA-丙酮沉淀法蛋白提取

TCA-丙酮沉淀法蛋白提取仪器：Eppendorf 冷冻离心机(Eppendorf)、组织匀浆器、超声破碎仪主要溶液配置：1.10mL SDS裂解液1%DTT，2% SDS，10%甘油，50mM Tris-Hcl(pH6.8)。

配置：称取0.1g DTT，0.2g SDS，加入1mL甘油和1mL的0.5MTris-Hcl(pH6.8)，然后定容至10mL。

2.10mL Triton样品溶解液浓度：150mM NaCl，1％Triton-X-100，50mM Tris-HCl(pH8.0)配置：称取0.087gNaCl、加入0.1mL Triton-X-100、500μL 浓度为1M的Tris-HCl (pH8.0) 加入约9.4mL水，混合溶解均匀。

保存：4度保存。

3.1mL尿素样品溶解液（现配现用）浓度：9M 尿素，4％CHAPS，1% IPGBuffer，1% DTT,配置：称取0.54g尿素、加入0.04g CHAPS、再加入0.56mL双蒸水，溶解后分装-20度冷冻保存，使用前融解后按0.98mL加入0.01g DTT（DTT过早加入会失效）和10μL Buffer的比例混合溶解均匀，最后再加入痕量溴酚蓝。

保存：-20度保存。

4.RIPA裂解液：浓度：50 mmol/L Tris-HCl (pH 8.0)，150 mmol/L NaCl，0.2 g/L叠氮钠，1 g/LSDS 100 mg/L Aprotin，10 g/L NP-40，5 g/L去氧胆酸钠，100 mg/LPMSF。

(RIPA裂解液有强、中和弱三种类型，其试配置略有差异)配置：称取：0.07882g Tris-HCl，0.08775g NaCl，0.002g叠氮钠，0.01gSDS，0.001g Aprotin，0.1g NP-40，0.05g去氧胆酸钠，0.001g PMSF。

注：以上列举了一些常见的裂解液，除此之外还有多种类型的裂解液，需要研究者根据自己研究的材料和实验目的选择合适的裂解液提取蛋白。

烟草叶片蛋白3种提取方法的比较研究

烟草叶片蛋白3种提取方法的比较研究摘要:使用酚/SDS法､Tris-HCl法及TCA/丙酮沉淀法提取烟草(Nicotiana tabacum)叶片蛋白,从终产物形式､颜色､提取时间､蛋白产量､SDS-PAGE电泳图谱等方面对3种方法进行比较,对提取的烟草叶片蛋白进行Western Blotting检测来评价3种方法提取蛋白的效果｡结果表明,与2种常用方法相比,酚/SDS法具有快速､操作方便等特点,提取的蛋白纯度高､种类丰富,可用于Western Blotting检测,是一种合适的提取植物组织中蛋白的方法｡关键词:烟草(Nicotiana tabacum)叶片;蛋白;Tris-HCl法;TCA/丙酮沉淀法;酚/SDS法Comparison Study on Three Methods for Tobacco Leaf Protein Extraction Abstract: Protein was extracted from tobacco(Nicotiana tabacum) leaves by three methods, phenol/SDS method, Tris-HCl method and TCA/acetone precipitation method. The extracting efficiency of the three methods was evaluated through the color and form of product, extraction time, protein yield and SDS-PAGE. Furthermore, the extracted protein was detected by Western Blotting. The results showed that compared with the other two methods, phenol/SDS method was faster and more convenient, and the protein extracted was with high quality, rich in protein species, and suitable for Western Blotting, thus was an appropriate method for extracting protein from plant tissue.Key words: tobacco(Nicotiana tabacum) leaf; protein; Tris-HCl extraction method; TCA/acetone precipitation; phenol/SDS extraction method蛋白质组学(Proteomics)是随着基因组学发展而发展起来的､在整体水平上研究细胞内蛋白质的组成及其活动规律的学科｡由于其能够阐明基因表达产物——蛋白在生物体内的相对含量､修饰化信息,蛋白质与其他生物大分子的相互作用等诸多内容而日益成为现代生物学的研究热点｡在蛋白质组研究中,蛋白样品制备是分析的起始和基础,蛋白提取质量和效果对后续的研究分析有重要影响[1,2]｡植物组织含有较厚的细胞壁,给组织中蛋白质的提取增加了一定的难度｡目前常用的植物蛋白的提取方法有两种,一种是普通Tris-HCl提取法,该方法通过选择适当的提取缓冲液pH,将植物中的可溶性蛋白尽可能地溶解;另一种是TCA/丙酮沉淀法,该方法中TCA作为蛋白质变性剂,能有效抑制丝氨酸蛋白酶和巯基蛋白酶的活性,减少蛋白损失,因此得到较为广泛的使用[3-6]｡但以上两种方法都不能有效地去除产物中的非蛋白物质,会对后续的研究产生不利的影响｡而酚/SDS蛋白提取法中,利用酚在SDS这种阴离子型表面活性剂的存在条件下能充分溶解蛋白的特点,可以取得在较短的时间内充分溶解植物组织中蛋白的效果,得到的蛋白纯度更高[7,8]｡目前该方法在国内使用得较少,特别是在烟草样品中尚未见报道｡本研究同时使用酚/SDS法､Tris-HCl法及TCA/丙酮沉淀法3种方法从烟草叶片中提取蛋白质,从终产物形式､颜色､提取时间､蛋白产量､SDS-PAGE电泳结果等方面进行比较,并使用糖基转移酶抗体对提取的烟草叶片蛋白进行免疫学检测,以评价3种方法提取蛋白的效果,为植物蛋白的提取和蛋白组学研究提供参考｡1 材料与方法1.1 材料和试剂烟草叶片(W38)来自中南民族大学生命科学学院国家民委生物技术重点实验室｡主要试剂:NC膜购自Whatman公司;ECL Western Blot System购自碧云天公司;Tris､三氯乙酸等化学试剂为国产分析纯;糖基转移酶多克隆抗体由北京华大蛋白技术有限公司制备｡1.2 蛋白提取方法1.2.1 Tris-HCl提取法准确称取0.5 g叶片,剪碎后加入0.25 mL Tris-HCl溶液冰浴研磨,再加入0.75 mL提取液(7 mol/L尿素､2 mol/L硫脲､0.4% CHAPS､10 mmol/L DTT),研磨至匀浆后,转移至1.5 mL离心管中,10 000 r/min离心10 min,上清液为所需的总蛋白｡1.2.2 TCA/丙酮沉淀法取0.5 g叶片,用液氮研磨充分,加入5 mL预冷的TCA 提取液(含质量分数10%的TCA､20 mmol/L DTT､1 mmol/L PMSF的丙酮溶液)充分混合后,-20 ℃放置1 h;13 000 r/min､4 ℃离心15 min,取沉淀;再加入5 mL预冷的样品洗涤液(20 mmol/L DTT､1 mmol/L PMSF的丙酮溶液),充分混合后,-20 ℃放置1 h;13 000 r/min､4 ℃离心15 min,取沉淀;用密封膜封口,用针在膜上扎几个小洞,低温冷冻干燥｡置于-80 ℃保存或直接进行蛋白电泳｡1.2.3 酚/SDS蛋白提取法取0.5 g烟草样品,液氮中研磨至粉末,快速转移至7 mL试管,加入5 mL预冷的质量分数为10%的TCA丙酮溶液,振荡混合均匀后,12 000 r/min､4 ℃离心3 min,弃上清;加入5 mL含有0.1 mol/L乙酸铵的体积分数为80%的乙醇溶液,振荡混合后12 000 r/min､4 ℃离心3 min,弃上清;再加入5 mL体积分数80%的丙酮,涡旋振荡直至沉淀充分分散,12 000 r/min､4 ℃离心3 min,弃上清,室温干燥10 min以除去剩余的丙酮,加入2.5 mL苯酚/SDS溶液,振荡混匀后,放置5 min,12 000 r/min､4 ℃离心3 min;转移上层苯酚相(约1~2 mL)至新的7 mL 管中,加入含有0.1 mol/L乙酸铵的乙醇溶液,置-20 ℃中10 min或过夜,12 000 r/min､4 ℃离心5 min,小心弃上清｡用无水乙醇洗沉淀,再用体积分数80%的丙酮洗沉淀｡最后让蛋白自然干燥,或根据实验需要用缓冲液溶解蛋白,保存在-80 ℃冰箱,或直接进行蛋白电泳｡1.3 检测方法考马斯亮兰G-250法测蛋白含量[9];SDS-PAGE电泳检测,按照文献[10,11]所述方法进行;Western Blotting检测:取发育状况接近的烟草叶片,分别用3种方法提取总蛋白,进行SDS-PAGE电泳,然后通过蛋白转膜､丽春红染色检测､封闭､标记一抗､洗脱一抗､标记二抗和杂交､再洗脱､化学发光法显色检测结果等步骤进行分析[12,13]｡2 结果与分析2.1 3种方法提取的蛋白质质量和产量比较对3种提取方法得到的烟草叶片蛋白形式､颜色､提取时间及蛋白产量进行比较(表1),可以看出,Tris-HCl提取法所得产物为绿色,这是由色素等杂质成分未能被完全去除而导致｡该方法虽提取速度快､产量高,但蛋白质量不高,所含杂质较多｡TCA/丙酮沉淀法用液氮充分研磨烟草叶片,同时加入蛋白酶抑制剂PMSF,降低了蛋白降解损失,故蛋白产量最高｡但是多次洗脱后样品颜色仍为淡黄色,这可能是因为烟草叶片中的一些物质能与蛋白共沉淀,导致终产物含有杂质｡此外,此方法操作耗时较长,会导致蛋白样品的损失和降解｡使用酚/SDS法提取蛋白,酚能够有效溶解蛋白,并在SDS存在下,其溶解效果更好,可溶解的蛋白更多,且该方法能有效去除非蛋白物质,非蛋白类成分较其他两种方法都少,获得的产物为白色｡虽然该方法的蛋白产量较TCA/丙酮沉淀法低,提取所需时间长于Tris-HCl法,但蛋白较纯｡2.2 SDS-PAGE检测结果使用常规的SDS-PAGE对3种方法获得的烟草蛋白样品进行比较分析,在蛋白上样量为20 μg时,Tris-HCl法提取的蛋白中检测到10个条带,TCA/丙酮沉淀法提取的蛋白电泳检测出14条条带,酚/SDS法提取的蛋白有12条条带(图1)｡Tris-HCl 法提取的蛋白条带较少,说明只提取到了部分蛋白,可能是该方法采用冰浴研磨,细胞破碎不够充分,只能得到植物组织中的部分可溶性蛋白｡当蛋白上样量为40 μg时,酚/SDS法所得的蛋白条带最多(图2),说明该方法提取的蛋白种类最多,提取效果比较好｡2.3 Western Blotting检测结果使用Western Blotting,以烟草糖基转移酶抗体为探针检测3种方法获得的蛋白,结果显示普通Tris-HCl法和TCA/丙酮法提取的蛋白均未出现任何杂交信号,只有酚/SDS法提取的蛋白出现杂交信号(图3),这表明酚/SDS法提取的蛋白用于Western Blotting分析能得到较好的效果｡3 结论3.1 蛋白提取质量在蛋白提取中,杂质的去除是一个主要问题[2],本研究中酚/SDS法提取的蛋白颜色最浅,所含杂质少,有利于后续的蛋白质组分析｡另外,该方法步骤简单,提取时间较短,能在4~5 h内完成,具有操作方便､快速的特点｡其他两种方法提取的蛋白质均含有较多杂质,不利于后续实验的进行｡3.2 电泳和Western Blotting检测对3种方法提取的蛋白进行电泳检测,Tris-HCl法只提取到了部分蛋白｡TCA/丙酮沉淀法所得蛋白条带虽多,但是该方法需要的时间长,容易产生蛋白样品的降解,从而导致蛋白电泳结果不稳定｡而酚/SDS蛋白提取法所得条带较多,重复性好,能够得到良好的一维电泳图谱｡此外,本研究使用Western Blotting对烟草叶片蛋白中的糖基转移酶进行了检测｡结果显示酚/SDS法提取的烟草叶片蛋白表现良好,可用于后续分析｡酚/SDS法提取植物蛋白,可获得高质量和较高产量的目标产物,为有效提取植物叶片蛋白提供了有力的依据,也为后续的蛋白分析实验打下了良好的基础｡参考文献:[1] WANG W, VIGNANI R, SCALI M, et al. A universal and rapid protocol for protein extraction from recalcitrant plant tissues for proteomic analysis[J]. Electrophoresis,2006,27(13):2782-2786.[2] 兰彦,钱小红.蛋白质组分析中蛋白质分步提取方法的建立[J]. 生物化学与生物物理进展,2001,28(3):415-418.[3] 曾亚. 水稻抗病基因介导的抗病反应中蛋白质表达谱的比较分析[D]. 武汉:华中农业大学,2008.[4] 严顺平. 水稻响应盐胁迫和低温胁迫的蛋白质组研究[D]. 北京:中国科学院研究生院,2005.[5] 赵敏. 水稻两优培九不同氮素处理叶片和籽粒蛋白质组学研究[D]. 福州:福建农林大学,2008.[6] 汪家政,范明.蛋白质技术手册[M]. 北京:科学出版社,2000. [7] WANG W, SCALI M, VIGNANI R, et al. Protein extraction for two-dimensional electrophoresis from olive leaf, a plant tissue containing high levels of interfering compounds[J]. Electrophoresis,2003,24(14):2369-2375.[8] FAUROBERT M, PELPOIR E, CHA B J. Phenol extraction of proteins for proteomic studies of recalcitrant plant tissues[J]. Methods in Molecular Biology,2006,355:9-14.[9] LI F F,WANG Y Y,LIU G F, et al. Cloning and expression of wheat heat-shockprotein 60(HSP60) gere in E. coli[D]. Agricultural Science & Technology,2010,11(1):5-7.[10] 郭尧君. 蛋白质电泳实验技术[M]. 北京:科学出版社,2005.[11] 丁.萨姆布鲁克, D.W.拉塞尔. 分子克隆实验指南[M]. 第三版.黄培堂,王嘉玺,朱厚础,等译.北京:科学出版社,2002.[12] 王卓. 一个新的烟草糖基转移酶的过表达及相关研究[D]. 武汉:中南民族大学,2008.[13] 王雪,谭艳平,周杰,等. 一个烟草糖基转移酶启动子在转基因烟草植株中的表达分析[J]. 安徽农业科学,2010,38(18):9426-9428.。

植物蛋白质提取方法

一、植物蛋白质提取1. TCA-丙酮法（1）称量一定量的样品置于液氮预冷的研钵中，加少许PVPP，反复加液氮研磨至粉末。

（2）研磨好的样品用10 倍体积（w/V）的10%的TCA-丙酮溶液悬浮，加入0.1 M PMSF、1 M DTT 至终浓度为1 mM PMSF、10mM DTT，超声5 分钟，于-20℃静置6 小时或过夜后，4℃，20000g 离心15 分钟，弃上清。

（3）沉淀用10 倍体积于样品的丙酮溶液重悬浮，于-20℃静置1 小时后，4℃，20000g 离心15 分钟，弃上清。

（4）重复步骤（3）一次。

（5）沉淀用10 倍体积于样品的乙醇/乙醚=1:1 洗，于-20℃静置1 小时后，4℃，20000g 离心15 分钟，弃上清。

（6）重复步骤（3）一次。

（7）取出沉淀真空干燥约5 分钟，除尽有机溶剂。

（8）按10mg 干粉末加200 微升裂解液的比例，加入1 mM PMSF、10mM DTT，超声5分钟，充分溶解1 小时，10℃，35000g 离心30 分钟，上清为所需的蛋白溶液。

（9）用Bradford 法测定蛋白样品的蛋白浓度。

（10）蛋白样品溶液小量分装，-80℃保存。

注意事项：（1）TCA 有利于去除酚类色素等物质，但不利于蛋白的抽提，使用浓度不宜过高，在后面丙酮处理中，尽量除去。

（2）蛋白样品保存：样品浓度不宜过高，建议将高浓度样品适度调整，为避免反复冻融应分装保存，长期保存用-80℃，短期保存用-20℃。

（3）1M DTT：0.1542g DTT 用1ml MilliQ 水溶解，-20℃保存。

（4）0.1M PMSF：0.0174g PMSF 用1ml 异丙醇溶解，-20℃保存。

沉淀蛋白质的常用方法

沉淀蛋白质的常用方法（TCA、乙醇、丙酮沉淀蛋白操作步骤）2010-08-18 15:19TCA-DOCFor precipitation of very low protein concentration1) To one volume of protein solution, add 1/100 vol. of 2% DOC (Na deoxy cholate, detergent).2) Vortex and let sit for 30min at 4oC.3) Add 1/10 of Trichloroacetic acid (TCA) 100% vortex and let sit ON at 4oC (preparation of 100% TCA: 454ml H2O/kg TCA. Maintain in dark bottle at 4oC.Be careful, use gloves!!!).4) Spin 15min 4oC in microfuge at maximum speed (15000g). Carefully discharge supernatant and retain the pellet: dry tube by inversion on tissue paper (pellet may be difficult to see). [OPTION: Wash pellet twice repellet samples 5min at full speed between washes].5) Dry samples under vaccum (speed vac) or dry air. For PAGE-SDS, resuspend samples in a minimal volume of sample buffer. (The presence of some TCA can give a yellow colour as a consequence of the acidification of the sample buffer ; titrate with 1N NaOH or 1M TrisHCl pH8.5 to obtain the normal blue sample buffer colour.)Normal TCATo eliminate TCA soluble interferences and protein concentration1) To a sample of protein solution add Trichloroacetic acid (TCA) 100% to get 13% final concentration. Mix and keep 5min –20oC and then 15min 4oC; or longer time at 4oC without the –20oC step for lower protein concentration. Suggestion: leave ON if the protein concentration is very low.(preparation of 100% TCA: 454ml H2O/kg TCA. Maintain in dark bottle at 4oC.Be careful, use gloves!!!).2) Spin 15min 4oC in microfuge at maximum speed (15000g). Carefully discharge supernatant and retain the pellet: dry tube by inversion on tissue paper (pellet may be difficult to see).3) For PAGE-SDS, resuspend samples in a minimal volume of sample buffer. (The presence of some TCA can give a yellow colour as a consequence of the acidification of the sample buffer ; titrate with 1N NaOH or 1M TrisHCl pH8.5 to obtain the normal blue sample buffer colour.)Acetone PrecipitationTo eliminate acetone soluble interferences and protein concentration1) Add 1 volume of protein solution to 4 volumes of cold acetone. Mix and keep at least 20min –20oC. (Suggestion: leave ON if the protein concentration is very low).2) Spin 15min 4oC in microfuge at maximum speed (15000g). Carefully discharge supernatant and retain the pellet: dry tube by inversion on tissue paper (pellet may be difficult to see).3) Dry samples under vaccum (speed-vac) or dry air to eliminate any acetone residue (smell tubes). For PAGE-SDS, resuspend samples in a minimal volume of sample buffer.Ethanol PrecipitationUseful method to concentrate proteins and removal of Guanidine Hydrochloride before PAGE-SDS1) Add to 1 volume of protein solution 9 volumes of cold Ethanol 100%. Mix and keep at least 10min.at –20oC. (Suggestion: leave ON).2) Spin 15min 4oC in microcentrifuge at maximum speed (15000g). Carefully discharge supernatant and retain the pellet: dry tube by inversion on tissue paper (pellet may be difficult to see).3) Wash pellet with 90% cold ethanol (keep at –20oC). Vortex and repellet samples 5min at full speed.4) Dry samples under vaccum (speed vac) or dry air to eliminate any ethanol residue (smell tubes). For PAGE-SDS, resuspend samples in a minimal volume of sample buffer.TCA-DOC/AcetoneUseful method to concentrate proteins and remove acetone and TCA soluble interferences1. To one volume of protein solution add 2% Na deoxycholate (DOC) to 0.02% final (for 100 μl sample, add 1 μl 2% DOC).2. Mix and keep at room temperature for at least 15 min.3. 100% trichloroacetic acid (TCA) to get 10% final concentration (preparation of 100% TCA: 454ml H2O/kg TCA. Maintain in dark bottle at 4oC.Be careful, use gloves!!!).4. Mix and keep at room temperature for at least 1 hour.5. Spin at 4oC for 10 min, remove supernatant and retain the pellet. Dry tube by inversion on tissue paper.6. Add 200 μl of ice cold acetone to TCA pellet.7. Mix and keep on ice for at least 15 min.8. Spin at 4oC for 10 min in microcentrifuge at maximum speed.9. Remove supernatant as before (5), dry air pellet to eliminate anyacetone residue (smell tubes). For PAGE-SDS, resuspend samples in a minimal volume of sample buffer.10. (The presence of some TCA can give a yellow colour as a consequence of the acidification of the sample buffer ; titrate with 1N NaOH or 1M TrisHCl pH8.5 to obtain the normal blue sample buffer colour.)Acidified Acetone/MethanolUseful method to remove acetone and methanol soluble interferences like SDS before IEF1) Prepare acidified acetone: 120ml acetone + 10μl H Cl (1mM final concentration).2) Prepare precipitation reagent: Mix equal volumes of acidified acetone and methanol and keep at -20oC.3) To one volume of protein solution add 4 volumes of cold precipitation reagent. Mix and keep ON at -20oC.4) Spin 15min 4oC in microfuge at maximum speed (15000g). Carefully discharge supernatant and retain the pellet: dry tube by inversion on tissue paper (pellet may be difficult to see).5) Dry samples under vaccum (speed-vac) or dry air to eliminate any acetone or methanol residue (smell tubes).TCA-Ethanol PrecipitationUseful method to concentrate proteins and removal of Guanidine Hydrochloride before PAGE-SDS1) Dilute 10-25μl samples to 100μl with H2OAdd 100μl of 20% trichloroacetic acid (TCA) and mix (prepa ration of 100% TCA: 454ml H2O/kg TCA. Maintain in dark bottle at 4oC.Be careful, use gloves!!!).2) Leave in ice for 20min. Spin at 4oC for 15 min in microcentrifuge at maximum speed.3) Carefully discharge supernatant and retain the pellet: dry tube by inversion on tissue (pellet may be difficult to see).4) Wash pellet with 100μl ice-cold ethanol, dry and resuspend in sample buffer.5) In case there are traces of GuHCl present, samples should be loaded immediately after boiling for 7 min at 95°C6) (The presence of some TCA can give a yellow colour as a consequence of the acidification of the sample buffer ; titrate with 1N NaOH or 1M TrisHCl pH8.5 to obtain the normal blue sample buffer colour.)PAGE prepTM Protein Clean-up and Enrichment Kit - PIERCEThe PAGE prep? Kit enables removal of many chemicals that interfere with SDS-PAGE analysis: guanidine, ammonium sulfate, other common salts, acids and bases, detergents, dyes, DNA, RNA, and lipids.PIERCE: #26800 - PAGE prepTM Protein Clean-up and Enrichment Kit (pdf)Chloroform Methanol PrecipitationUseful method for Removal of salt and detergents1) To sample of starting volume 100 ul2) Add 400 ul methanol3) Vortex well4) Add 100 ul chloroform5) Vortex6) Add 300 ul H2O7) Vortex8) Spin 1 minute @ 14,0000 g9) Remove top aqueous layer (protein is between layers)10) Add 400 ul methanol11) Vortex12) Spin 2 minutes @ 14,000 g13) Remove as much MeOH as possible without disturbing pellet14) Speed-Vac to dryness15) Bring up in 2X sample buffer for PAGEReference: Wessel, D. and Flugge, U. I. Anal. Biochem. (1984) 138, 141-143哈哈,我做过这个论文哈!1. 配胶缓冲液系统对电泳的影响？在SDS－PAGE不连续电泳中，制胶缓冲液使用的是Tris－HCL缓冲系统，浓缩胶是pH6.7，分离胶pH8.9；而电泳缓冲液使用的Tris－甘氨酸缓冲系统。

沉淀蛋白质的通用方法(TCA,乙醇,丙酮沉淀蛋白操作技巧步骤)

沉淀蛋白质的常用方法（TCA、乙醇、丙酮沉淀蛋白操作步骤）TCA-DOCFor precipitation of very low protein concentration1) To one volume of protein solution, add 1/100 vol. of 2% DOC (Na deoxycholate, detergent).2) Vortex and let sit for 30min at 4oC.3) Add 1/10 of Trichloroacetic acid (TCA) 100% vortex and let sit ON at 4oC (preparation of 100% TCA: 454ml H2O/kg TCA. Maintain in dark bottleat 4oC.Be careful, use gloves).4) Spin 15min 4oC in microfuge at maximum speed (15000g). Carefully discharge supernatant and retain the pellet: dry tube by inversion on tissue paper (pellet may be difficult to see). [OPTION: Wash pellet twice with one volume of cold acetone (acetone keep at –20oC). Vortex and repellet samples 5min at full speed between washes].5) Dry samples under vaccum (speed vac) or dry air. For PAGE-SDS, resuspend samples in a minimal volume of sample buffer. (The presence of some TCA can give a yellow colour as a consequence of theacidification of the sample buffer ; titrate with 1N NaOH or 1M TrisHCl pH8.5 to obtain the normal blue sample buffer colour.)Normal TCATo eliminate TCA soluble interferences and protein concentration1) To a sample of protein solution add Trichloroacetic acid (TCA) 100% to get 13% final concentration. Mix and keep 5min –20oC and then 15min 4oC; or longer time at 4oC without the –20oC step for lower protein concentration. Suggestion: leave ON if the protein concentration is very low.(preparation of 100% TCA: 454ml H2O/kg TCA. Maintain in dark bottleat 4oC.Be careful, use gloves).2) Spin 15min 4oC in microfuge at maximum speed (15000g). Carefully discharge supernatant and retain the pellet: dry tube by inversion on tissue paper (pellet may be difficult to see).3) For PAGE-SDS, resuspend samples in a minimal volume of sample buffer. (The presence of some TCA can give a yellow colour as a consequence of the acidification of the sample buffer ; titrate with 1NNaOH or 1M TrisHCl pH8.5 to obtain the normal blue sample buffer colour.)Acetone PrecipitationTo eliminate acetone soluble interferences and protein concentration 1) Add to 1 volume of protein solution 4 volumes of cold acetone. Mix and keep at least 20min –20oC. (Suggestion: leave ON if the protein concentration is very low).2) Spin 15min 4oC in microfuge at maximum speed (15000g). Carefully discharge supernatant and retain the pellet: dry tube by inversion on tissue paper (pellet may be difficult to see).3) Dry samples under vaccum (speed-vac) or dry air to eliminate any acetone residue (smell tubes). For PAGE-SDS, resuspend samples in a minimal volume of sample buffer.Ethanol PrecipitationUseful method to concentrate proteins and removal of Guanidine Hydrochloride before PAGE-SDS1) Add to 1 volume of protein solution 9 volumes of cold Ethanol 100%. Mix and keep at least 10min.at –20oC. (Suggestion: leave ON).2) Spin 15min 4oC in microcentrifuge at maximum speed (15000g). Carefully discharge supernatant and retain the pellet: dry tube by inversion on tissue paper (pellet may be difficult to see).3) Wash pellet with 90% cold ethanol (keep at –20oC). Vortex and repellet samples 5min at full speed.4) Dry samples under vaccum (speed vac) or dry air to eliminate any ethanol residue (smell tubes). For PAGE-SDS, resuspend samples in a minimal volume of sample buffer.TCA-DOC/AcetoneUseful method to concentrate proteins and remove acetone and TCA soluble interferences1. To one volume of protein solution add 2% Na deoxycholate (DOC) to 0.02% final (for 100 μl sample, add 1 μl 2% DOC).2. Mix and keep at room temperature for at least 15 min.3. 100% trichloroacetic acid (TCA) to get 10% final concentration(preparation of 100% TCA: 454ml H2O/kg TCA. Maintain in dark bottleat 4oC.Be careful, use gloves).4. Mix and keep at room temperature for at least 1 hour.5. Spin at 4oC for 10 min, remove supernatant and retain the pellet. Dry tube by inversion on tissue paper.6. Add 200 μl of ice cold acetone to TCA pellet.7. Mix and keep on ice for at least 15 min.8. Spin at 4oC for 10 min in microcentrifuge at maximum speed.9. Remove supernatant as before (5), dry air pellet to eliminate any acetone residue (smell tubes). For PAGE-SDS, resuspend samples in a minimal volume of sample buffer.10. (The presence of some TCA can give a yellow colour as a consequence of the acidification of the sample buffer ; titrate with 1N NaOH or 1M TrisHCl pH8.5 to obtain the normal blue sample buffer colour.)Acidified Acetone/MethanolUseful method to remove acetone and methanol soluble interferences like SDS before IEF1) Prepare acidified acetone: 120ml acetone + 10μl HCl (1mM final concentration).2) Prepare precipitation reagent: Mix equal volumes of acidified acetone and methanol and keep at -20oC.3) To one volume of protein solution add 4 volumes of cold precipitation reagent. Mix and keep ON at -20oC.4) Spin 15min 4oC in microfuge at maximum speed (15000g). Carefully discharge supernatant and retain the pellet: dry tube by inversion on tissue paper (pellet may be difficult to see).5) Dry samples under vaccum (speed-vac) or dry air to eliminate any acetone or methanol residue (smell tubes).TCA-Ethanol PrecipitationUseful method to concentrate proteins and removal of Guanidine Hydrochloride before PAGE-SDS1) Dilute 10-25μl samples to 100μl with H2OAdd 100μl of 20% trichloroacetic acid (TCA) and mix (preparation of 100% TCA: 454ml H2O/kg TCA. Maintain in dark bottleat 4oC.Be careful, use gloves).2) Leave in ice for 20min. Spin at 4oC for 15 min in microcentrifuge at maximum speed.3) Carefully discharge supernatant and retain the pellet: dry tube by inversion on tissue (pellet may be difficult to see).4) Wash pellet with 100μl ice-cold ethanol, dry and resuspend in sample buffer.5) In case there are traces of GuHCl present, samples should be loaded immediately after boiling for 7 min at 95°C6) (The presence of some TCA can give a yellow colour as a consequence of the acidification of the sample buffer ; titrate with 1N NaOH or 1M TrisHCl pH8.5 to obtain the normal blue sample buffer colour.)PAGE prep TM Protein Clean-up and Enrichment Kit - PIERCEThe PAGEprep? Kit enables removal of many chemicals that interfere with SDS-PAGE analysis: guanidine, ammonium sulfate, other common salts, acids and bases, detergents, dyes, DNA, RNA, and lipids.PIERCE: #26800 - PAGE prep TM Protein Clean-up and EnrichmentKit (pdf)Chloroform Methanol PrecipitationUseful method for Removal of salt and detergents1) To sample of starting volume 100 ul2) Add 400 ul methanol3) Vortex well4) Add 100 ul chloroform5) Vortex6) Add 300 ul H2O7) Vortex8) Spin 1 minute @ 14,0000 g9) Remove top aqueous layer (protein is between layers)10) Add 400 ul methanol11) Vortex12) Spin 2 minutes @ 14,000 g13) Remove as much MeOH as possible without disturbing pellet14) Speed-Vac to dryness15) Bring up in 2X sample buffer for PAGEReference: Wessel, D. and Flugge, U. I. Anal. Biochem. (1984) 138, 141-143蛋白质浓缩——方法很全1130徐炉李2011-05-28 14:35楼主蛋白质浓缩——方法很全- 丁香园论坛-医学/药学/生命科学论坛蛋白质浓缩方法总结一个简便的方法你可以试试：找一透析袋，底部扎紧，袋口扎一去底的塑料或玻璃试管，将待浓缩的液体从管口灌入透析袋中，将整个装置挂在冰箱中，或者用电风扇吹，液体干后可再继续加入，直至样品浓缩至所需体积。

用于蛋白质组分析的两种马铃薯块茎蛋白质提取方法的比较

２０１９年２月甘　肃　农　业　大　学　学　报第５　４卷第１期８９～９５ＪＯＵＲＮＡＬ　ＯＦ　ＧＡＮＳＵ　ＡＧＲＩＣＵＬＴＵＲＡＬ　ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ双月刊用于蛋白质组分析的两种马铃薯块茎蛋白质提取方法的比较王润润１，２，王东霞１，３，张小微１，２，杨巧玲１，２，崔丹丹１，２，张俊莲４，程李香１，３（１．甘肃省干旱生境作物学重点实验室，甘肃兰州　７３００７０；２．甘肃农业大学生命科学技术学院，甘肃兰州　７３００７０；３．甘肃农业大学农学院，甘肃兰州　７３００７０；４．甘肃农业大学园艺学院，甘肃兰州　７３００７０）摘要：【目的】进行两种提取方法下马铃薯块茎蛋白质组结果差异分析，并确定最佳马铃薯块茎蛋白质提取方法．【方法】采用酚提取法和三氯乙酸／丙酮沉淀与乙酸铵／甲醇沉淀相结合的两步沉淀法提取马铃薯块茎蛋白质，进行２－ＤＥ分离，对差异表达蛋白质进行ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳ质谱鉴定．【结果】两步沉淀法提取的马铃薯块茎蛋白质较酚提取法获得蛋白质纯度和浓度及蛋白质点数目均明显增加，双向电泳凝胶图谱分辨率较高．质谱鉴定结果表明，两步沉淀法中鉴定的差异表达蛋白质丰度均显著高于酚提取法，并鉴定到一些新出现的蛋白质包括假定的线粒体ＮＡＤ依赖的苹果酸脱氢酶、酸性磷酸酶类似物和蛋白酶抑制剂ＩＩ前体类型Ｂ．【结论】提取马铃薯块茎蛋白质时两步沉淀法优于酚提取法．关键词：马铃薯；蛋白质提取；蛋白质组；双向凝胶电泳；差异表达蛋白质中图分类号：Ｑ９４６．１文献标志码：Ａ文章编号：１００３－４３１５（２０１９）０１－００８９－０７ＤＯＩ：１０．１３４３２／ｊ．ｃｎｋｉ．ｊｇｓａｕ．２０１９．０１．０１２Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ　ｏｆ　ｔｗｏ　ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　ｍｅｔｈｏｄｓ　ｏｆ　ｐｏｔａｔｏ　ｔｕｂｅｒｐｒｏｔｅｉｎ　ｂａｓｅｄ　ｏｎ　ｐｒｏｔｅｏｍｉｃ　ａｎａｌｙｓｉｓＷＡＮＧ　Ｒｕｎ－ｒｕｎ１，２，ＷＡＮＧ　Ｄｏｎｇ－ｘｉａ１，３，ＺＨＡＮＧ　Ｘｉａｏ－ｗｅｉ　１，２，ＹＡＮＧ　Ｑｉａｏ－ｌｉｎ１，２，ＣＵＩ　Ｄａｎ－ｄａｎ１，２，ＺＨＡＮＧ　Ｊｕｎ－ｌｉａｎ４，ＣＨＥＮＧ　Ｌｉ－ｘｉａｎｇ１，３（１．Ｇａｎｓｕ　Ｐｒｏｖｉｎｃｉａｌ　Ｋｅｙ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｏｆ　Ａｒｉｄｌａｎｄ　Ｃｒｏｐ　Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｌａｎｚｈｏｕ　７３００７０，Ｃｈｉｎａ；２．Ｃｏｌｌｅｇｅ　ｏｆ　ｌｉｆｅ　ｓｃｉｅｎｃｅ　ａｎｄｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｇａｎｓｕ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｌａｎｚｈｏｕ　７３００７０，Ｃｈｉｎａ；３．Ｃｏｌｌｅｇｅ　ｏｆ　Ａｇｒｏｎｏｍｙ，Ｇａｎｓｕ　ＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｌａｎｚｈｏｕ　７３００７０，Ｃｈｉｎａ；４．Ｃｏｌｌｅｇｅ　ｏｆ　Ｈｏｒｔｉｃｕｌｔｕｒｅ，Ｇａｎｓｕ　ＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｌａｎｚｈｏｕ　７３００７０，Ｃｈｉｎａ）Ａｂｓｔｒａｃｔ：【Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ】Ｔｏ　ａｎａｌｙｚｅ　ｔｈｅ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ　ｐｏｔａｔｏ　ｔｕｂｅｒ　ｐｒｏｔｅｏｍｉｃ　ｕｎｄｅｒ　ｔｗｏ　ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　ｍｅｔｈｏｄｓ，ａｓ　ｗｅｌｌ　ａｓ　ｔｈｅ　ｏｐｔｉｍａｌ　ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　ｍｅｔｈｏｄ　ｏｆ　ｐｏｔａｔｏ　ｔｕｂｅｒ　ｐｒｏｔｅｉｎ．【Ｍｅｔｈｏｄ】Ｐｏｔａｔｏ　ｔｕｂｅｒ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｗａｓ　ｅｘ－ｔｒａｃｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ｐｈｅｎｏｌ　ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　ｍｅｔｈｏｄ　ａｎｄ　ｔｗｏ－ｓｔｅｐ　ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ　ｍｅｔｈｏｄ，ａｎｄ　ｔｈｅｎ　ａｎａｌｙｚｅｄ　ｕｓｉｎｇ　ｔｗｏ－ｄｉ－ｍｅｎｓｉｏｎ　ｇｅｌ　ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ（２－ＤＥ），ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｔｈｅ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ　ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｗｅｒｅ　ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ　ｂｙＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ／ＴＯＦ　ｍａｓｓ　ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ．【Ｒｅｓｕｌｔ】Ｔｈｅ　ｐｕｒｉｔｙ　ａｎｄ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｅｘｔｒａｃｔｅｄ　ｗｉｔｈｔｗｏ－ｓｔｅｐ　ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ　ｍｅｔｈｏｄ　ｗａｓ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ　ｈｉｇｈ　ｔｈａｎ　ｔｈａｔ　ｏｆ　ｐｈｅｎｏｌ　ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　ｍｅｔｈｏｄ，ａｎｄ　ｔｈｅ　ｎｕｍｂｅｒｏｆ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｓｐｏｔｓ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ　ｏｆ　２－ＤＥ　ｇｅｌ　ｍａｐｓ　ｗｅｒｅ　ａｌｓｏ　ｉｎｃｒｅａｓｅｄ．Ｍａｓｓ　ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ　ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｒｅｓｕｌｔｓ　ｉｎｄｉｃａｔｅｄ　ｔｈａｔ　ｃｏｍｐａｒｅｄ　ｗｉｔｈ　ｐｈｅｎｏｌ　ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　ｍｅｔｈｏｄ，ｔｈｅ　ａｂｕｎｄａｎｃｅ　ｏｆ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｅｘｔｒａｃｔｅｄ　ｗｉｔｈ第一作者：王润润，硕士研究生．Ｅ－ｍａｉｌ：１４２５７１７１１４＠ｑｑ．ｃｏｍ通信作者：程李香，助理研究员，研究方向为马铃薯遗传育种．Ｅ－ｍａｉｌ：ｃｈｅｎｇｌｉｘｉａｎｇ＿０４１９＠１６３．ｃｏｍ基金项目：甘肃省干旱生境作物学重点实验室开放基金项目（ＧＳＣＳ－２０１６－０６）；甘肃省青年科技基金计划项目（１６０６ＲＪＹＡ２２９）；国家马铃薯产业技术体系项目（ＣＡＲＳ－０９－Ｐ１４）．收稿日期：２０１７－０３－２８；修回日期：２０１７－０４－１４甘肃农业大学学报２０１９年ｔｗｏ－ｓｔｅｐｓ　ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ　ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　ｍｅｔｈｏｄ　ｗａｓ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ　ｅｎｈａｎｃｅｄ．Ａｎｄ　ｓｏｍｅ　ｎｅｗ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｗｅｒｅ　ｏｎｌｙ　ｉ－ｄｅｎｔｉｆｉｅｄ　ｉｎ　ｔｗｏ－ｓｔｅｐｓ　ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ　ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　ｍｅｔｈｏｄ，ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ　ｐｕｔａｔｉｖｅ　ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ　ＮＡＤ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔｍａｌａｔｅ　ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ，ａｃｉｄ　ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ－ｌｉｋｅ　ａｎｄ　ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ　ＩＩ　ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ　ｔｙｐｅ　Ｂ．【Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ】Ｐｏ－ｔａｔｏ　ｔｕｂｅｒ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｅｘｔｒａｃｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ｔｗｏ－ｓｔｅｐ　ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ　ｍｅｔｈｏｄ　ｉｓ　ｂｅｔｔｅｒ　ｔｈａｎ　ｐｈｅｎｏｌ　ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　ｍｅｔｈｏｄ．Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：ｐｏｔａｔｏ；ｐｒｏｔｅｉｎ　ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ；ｐｒｏｔｅｏｍｉｃ；ｔｗｏ－ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ　ｇｅｌ　ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ；ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ　ｅｘ－ｐｒｅｓｓｅｄ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ蛋白质组用于各种细胞、组织中蛋白质的研究．高分辨率的双向凝胶电泳（２－ＤＥ）技术已经普遍用于各种植物组织蛋白质的分离、分析以及鉴定．蛋白质的提取是２－ＤＥ分析和鉴定的关键步骤．植物组织中通常含有厚细胞壁、高浓度有机酸的液泡以及大量的次生代谢物如色素、酚复合物，这些物质严重干扰蛋白质的提取和分离．因此，从植物组织中制备高质量的蛋白质样品是一个巨大的挑战［１－２］．最近研究结果表明，以苯酚提取法和ＴＣＡ丙酮为基础改善后的蛋白质提取法能够有效地提高富含多糖、脂质和酚醛树脂复合物以及高纤维的植物组织中２－ＤＥ的分别率、清除非蛋白质的复合物、降低条纹的干扰［３－６］．Ｌａｕ等［７］采用苯酚／ＳＤＳ结合醇酸铵沉淀法、苯酚结合ＴＣＡ／丙酮沉淀法和ＴＣＡ／丙酮法提取植株叶绿体可溶性蛋白质，结果表明苯酚／ＳＤＳ结合醇酸铵沉淀法提取的蛋白质产量最高，２－ＤＥ图谱的蛋白质点数目最多．Ａｌ－Ｏｂａｉｄｉ等［８］利用酚提取法、三氯乙酸／丙酮沉淀与乙酸铵／甲醇沉淀相结合的方法提取灵芝防御相关蛋白质，结果表明酚提取法是最适的灵芝属蛋白质提取方法．此外，融入二甲基亚砜或者尿素缓冲液的ＴＣＡ／丙酮提取玉米根的蛋白质较传统的ＴＣＡ／丙酮沉淀法明显改善了２－ＤＥ图谱分辨率、增加了蛋白点数目［１０－１１］．因此，改善蛋白质提取方法有利于植物蛋白质携带信息的获取．马铃薯（Ｓｏｌａｎｕｍ　ｔｕｂｅｒｏｓｕｍＬ．）块茎作为储藏器官具有细胞组织倍性一致的特点，是储藏器官蛋白质组研究的良好材料［１２］．但马铃薯块茎细胞中含有大量的多酚、醌类和糖类等次生代谢物质，用常规的蛋白质提取方法不易去除干净，不能有效提纯和分离块茎蛋白质，蛋白质样品的制备体系还不完善，双向电泳效果差，干扰大．为了深入研究马铃薯块茎蛋白质组，选择合适的马铃薯块茎总蛋白质提取方法是后续获得高质量的２－ＤＥ图谱的关键．本试验根据马铃薯块茎的特点，采用酚提取法和三氯乙酸／丙酮沉淀与乙酸铵／甲醇沉淀相结合的两步沉淀法提取马铃薯块茎蛋白质，进行２－ＤＥ分离，对差异表达蛋白质进行ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳ质谱鉴定，探索适合马铃薯块茎蛋白质样品制备的最佳方法．１　材料和方法１．１　试验材料马铃薯普通栽培种‘大西洋’的成熟块茎，采集于甘肃农业大学试验田，液氮速冻，于－８０℃冰箱贮存备用．１．２　主要试剂ＩＰＧ干胶条（Ｉｍｍｏｂｉｌｉｎｅ　ｄｒｙｓｔｒｉｐ，ｐＨ３－１０，１７ｃｍ）为Ｂｉｏ－Ｒａｄ公司产品；丙烯酰胺（Ａｃｒ）、过硫酸铵（ＡＰＳ）、甲叉双丙烯酰胺（Ｂｉｓ）、考马斯亮蓝Ｇ－２５０（ＣＢＢ　Ｇ－２５０）、二硫苏糖醇（ＤＴＴ）、乙二胺四乙酸（ＥＤＴＡ）、甘氨酸（Ｇｌｙｃｉｎｅ）、碘乙酰胺（ＩＡＡ）、硫脲（Ｔｈｉｏｕｒｅａ）、尿素（Ｕｒｅａ）、三羟甲基氨基甲烷（Ｔｒｉｓ）、十二烷基磺酸钠（ＳＤＳ）、低熔点琼脂糖、甘油、β－巯基乙醇、丙酮、醋酸铵、甲醇、溴酚蓝为Ａｍ－ｒｅｓｃｏ公司产品；Ｔｒｉｓ－饱和酚为Ｓｏｌａｒｂｉｏ公司产品．所有溶液和缓冲液均为Ｍｉｌｌｉ－Ｑ水配制．１．３　样品制备１．３．１　粗蛋白提取　方法一：酚提取法　参照Ａｌ－Ｏｂａｉｄｉ等［８］的方法略有改动．称取２ｇ马铃薯块茎，液氮研磨后，加入１２ｍＬ提取缓冲液（０．７ｍｏｌ／ＬＳｕｃｒｏｓｅ，５００ｍｍｏｌ／Ｌ　Ｔｒｉｓ，３０ｍｍｏｌ／Ｌ　ＨＣｌ，１００ｍｍｏｌ／Ｌ　ＫＣｌ，５０ｍｍｏｌ／Ｌ　Ａｓｃｏｒｂｉｃ　ａｃｉｄ，２ｍｍｏｌ／Ｌ　ＰＭＳＦ，ｐＨ　８．０），冰浴３０ｍｉｎ，４℃下１２　０００　ｇ离心１５ｍｉｎ．取上清，加入１５ｍＬ　Ｔｒｉｓ平衡酚，涡旋１０ｍｉｎ，４℃下６　０００　ｇ离心１５ｍｉｎ．收集酚相加入５倍体积的０．１ｍｍｏｌ／Ｌ乙酸铵／甲醇溶液，－２０℃沉淀过夜．４℃下１２　０００　ｇ离心１０ｍｉｎ．沉淀加１ｍＬ水悬浮，再加６ｍＬ乙醇，－２０℃沉淀０９第１期王润润等：用于蛋白质组分析的两种马铃薯块茎蛋白质提取方法的比较过夜．沉淀加５ｍＬ还原缓冲液（８ｍｍｏｌ／Ｌ　Ｕｒｅａ，２００ｍｍｏｌ／Ｌ　Ｔｒｉｓ，２ｍｍｏｌ／Ｌ　ＥＤＴＡ，２０ｍｍｍｏｌ／ＬＤＴＴ，ｐＨ　８．０），溶解１ｈ后加入２５０μＬ　０．５ｍｍｏｌ／Ｌ　Ｔｒｉｓ，黑暗静置３０ｍｉｎ后加６倍体积的乙醇，４℃下１２　０００　ｇ离心１０ｍｉｎ，沉淀经真空干燥，得到的粗蛋白质粉末进行称质量后，于－８０℃保存备用．方法二：两步沉淀法　第一步沉淀为三氯乙酸／丙酮沉淀，根据Ｋａｒｐｐｉｎｅｎ等［１３］和Ｗａｎｇ等［１４］的方法略有改动．称取２ｇ马铃薯块茎，液氮研磨后，加入１０ｍＬ提取缓冲液（５０ｍｍｏｌ／Ｌ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ，２５ｍｍｏｌ／Ｌ　ＥＤＴＡ，５００ｍｍｏｌ／Ｌ　Ｔｈｉｏｕｒｅａ，２ｍｍｏｌ／Ｌ　ＰＭＳＦ，０．０７％β－巯基乙醇，ｐＨ　８．０），冰浴３０ｍｉｎ，４℃下１２　０００　ｇ离心１５ｍｉｎ．收集上清液，加入５倍体积预冷丙酮．涡旋振荡后，－２０℃沉淀过夜．４℃下１２　０００　ｇ离心２０ｍｉｎ，沉淀重悬于等体积预冷丙酮溶液２次．４℃下１２　０００　ｇ离心１５ｍｉｎ．第二步沉淀为乙酸铵／甲醇沉淀，根据Ｋｏｉｓｔｉｎ－ｅｎ等［１５］的方法略有改动．第一步沉淀样品加６ｍＬ０．１ｍｍｏｌ／Ｌ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ提取缓冲液（ｐＨ８．０），涡旋后４℃静置２０ｍｉｎ，加入等体积的水饱和酚，轻摇１０ｍｉｎ．１５℃下１２　０００　ｇ离心１５ｍｉｎ，收集酚层溶液，加入１２ｍＬ　０．１ｍｍｏｌ／Ｌ乙酸铵／甲醇溶液．－２０℃沉淀过夜．４℃下１２　０００　ｇ离心１０ｍｉｎ．沉淀加入１０ｍＬ预冷丙酮溶液，涡旋振荡后－２０℃下静置２０ｍｉｎ．４℃下１２　０００　ｇ离心５ｍｉｎ，重复该步骤２遍．沉淀经真空干燥，得到的粗蛋白质粉末进行称质量后，于－８０℃保存备用．１．３．２　蛋白质提取　称取粗蛋白质干粉１０ｍｇ，以１∶２０（ｍｇ／μＬ）加入样品裂解液．涡旋振荡后于３０℃水浴２ｈ．４℃下１２　０００　ｇ离心１５ｍｉｎ，上清液即为待分析的蛋白质溶液，于－８０℃保存用于双向电泳分析．１．４　蛋白质定量以牛血清白蛋白质为标准蛋白绘制标准曲线．取待分析上清液与蛋白试剂反应５ｍｉｎ，５９５ｎｍ波长下测定吸光值，计算蛋白质浓度．１．５　双向凝胶电泳及２－ＤＥ图谱分析取含９５０μｇ蛋白质的上清液，用水化上样缓冲液［７∶Ｕｒｅａ，２∶Ｔｈｉｏｕｒｅ，０．３％（ｗ／ｖ）ＤＴＴ，２％（ｗ／ｖ）ＣＨＡＰＳ，２％（ｖ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ－１１４，０．５％（ｖ／ｖ）ＩＰＧ缓冲液，０．００２％（ｗ／ｖ）溴酚蓝］补至３５０μＬ，充分混匀，４℃下１２　０００　ｇ离心１０ｍｉｎ，进行ＩＥＦ上样．将聚焦完成的胶条取出，置于含１％ＤＴＴ或４％碘乙酰胺的平衡缓冲液［６∶Ｕｒｅａ，１．５∶Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ，２％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ，２０％（ｖ／ｖ）甘油，ｐＨ８．８］各５ｍＬ分别平衡１５ｍｉｎ．待其平衡后，采用１２％分离胶进行第二向ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳．电泳结束后，ＣＢＢ染色液染色２０ｈ，去离子水浸泡脱色至背景清晰．凝胶采用ＵＭＡＸ　Ｍａｇｉｃｓｃａｎ扫描仪扫描，光学分辨率３００ｄｐｉ（Ｄｏｔ　ｐｅｒ　ｉｎｃｈ），保存为数字图像．采用ＰＤＱｕｅｓｔ　８．０．１软件，对酚提取法和三氯乙酸／丙酮沉淀与乙酸铵／甲醇沉淀相结合的两步沉淀法提取得到的蛋白质凝胶图像进行匹配分析．标记并切取差异表达的蛋白质点进行ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ／ＴＯＦ－ＭＳ分析．１．６　数据处理运用ＳＰＳＳ　１９．０软件对试验数据进行统计分析．２　结果与分析２．１　蛋白质获得量及纯度的比较采用两种提取方法对马铃薯块茎所获得的粗蛋白质干质量、纯蛋白质获得量以及蛋白质纯度等进行比较（表１）．酚提取法获得的粗蛋白质量达到９１．３３ｍｇ，是两步沉淀法提取的３．７１倍，而且纯蛋白质的获得量也显著高于两步沉淀法，但是酚提取法获得蛋白质的纯度和浓度却明显低于两步沉淀法．２．２　电泳结果的比较２．２．１　双向ＳＤＳ－ＰＡＧＥ结果　利用酚提取法和两步沉淀法提取的马铃薯块茎总蛋白质在１７ｃｍ　ｐＨ３～１０非线性胶条进行等点聚焦，然后用１２％ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分离后获得２－ＤＥ图谱（图１）．两步沉淀法所得双向电泳图谱（图１－Ｂ）较酚提取法所得电泳图谱（图１－Ａ）横向纹理较少、蛋白质斑点数多且清晰可见，主要分布在ｐＨ值４～７范围内，没有拖尾现象，分离效果比较理想，在ｐＨ　７～１０的碱性区亦有较多显著的蛋白质点．而酚提取法２－ＤＥ电泳图谱上在碱性区几乎没有清晰且呈椭圆的蛋白质点的分布．采用ＰＤＱｕｅｓｔ　８．０．１软件分析电泳图谱，两步沉淀１９甘肃农业大学学报２０１９年表１　两种提取方法获得蛋白质的比较Ｔａｂｌｅ　１　Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｔｗｏ　ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　ｍｅｔｈｏｄｓ提取方法Ｍｅｔｈｏｄ粗蛋白质获得量／（ｍｇ·ｇ－１）Ａｍｏｕｎｔ　ｏｆｃｒｕｄｅ　ｐｒｏｔｅｉｎ蛋白质浓度／（ｍｇ·ｍＬ－１）Ｃｏｎｔｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｆ　ｐｒｏｔｅｉｎ纯蛋白质获得量／（ｍｇ·ｇ－１）Ａｍｏｕｎｔ　ｏｆｐｕｒｅ　ｐｒｏｔｅｉｎ蛋白质纯度／％Ｃｏｎｔｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｆ　ｐｒｏｔｅｉｎ酚提取法Ｐｈｅｎｏｌ　ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　ｍｅｔｈｏｄ９１．３３±１．１２ａ１０．３９±１．０７ｂ　２９．４１±０．７６ａ３２．２１±０．６７ｂ两步沉淀法Ｔｗｏ－ｓｔｅｐ　ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄ２４．６１±０．６６ｂ　１７．９８±０．５７ａ１７．６２±０．３８ｂ　７１．６３±０．５８ａ同列不同小写字母表示在０．０５水平上差异显著．Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｓｍａｌｌ　ｌｅｔｔｅｒｓ　ｗｉｔｈｉｎ　ｔｈｅ　ｓａｍｅ　ｃｏｌｕｍｎ　ｉｎｄｉｃａｔｅ　ｔｈａｔ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ　ａｔ　０．０５ｌｅｖｅｌ．图１　酚提取法和两步沉淀法提取的马铃薯块茎蛋白质２－ＤＥ图谱Ｆｉｇｕｒｅ　１　２－ＤＥ　ｐｒｏｆｉｌｅｓ　ｏｆ　ｐｏｔａｔｏ　ｔｕｂｅｒ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｅｘｔｒａｃｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ｐｈｅｎｏｌ　ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　ｍｅｔｈｏｄ　ａｎｄ　ｔｗｏ－ｓｔｅｐｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ　ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　ｍｅｔｈｏｄ法和酚提取法提取的马铃薯块茎总蛋白质点数目分别为３９８±４６个和８７０±６９个．ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ／ＴＯＦ－ＭＳ鉴定了８个差异表达蛋白质点（表２），分别是７０ｋＵ热激相关蛋白质，叶绿体、假定的线粒体ＮＡＤ依赖的苹果酸脱氢酶、烯醇酶类似物、脱氢抗坏血酸还原酶、蛋白酶抑制剂ＩＩ前体类型Ｂ、成熟酶Ｋ、酸性磷酸酶类似物和蛋白酶抑制剂１．这些被鉴定的蛋白质可分为不同的功能类别，分别为能量和代谢相关蛋白质（３７．５％）、贮藏和防御相关蛋白质（２５％）、氧化还原相关蛋白质（１２．５％）、转录相关蛋白质（１２．５％）和翻译相关蛋白质（１２．５％）（图２）．进一步对获得的８个差异表达蛋白质丰度进行比较分析（图３），结果表明两步沉淀法中鉴定５种差异表达蛋白质丰度显著高于酚提取法，分别是７０ｋＵ热激相关蛋白，叶绿体、烯醇酶类似物、脱氢抗图２　两种提取方法下马铃薯块茎差异表达蛋白质的功能分类Ｆｉｇｕｒｅ　２　Ｔｈｅ　ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ　ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙｅｘｐｒｅｓｓｅｄ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｏｆ　ｐｏｔａｔｏ　ｔｕｂｅｒ　ｅｘｔｒａｃｔｅｄ　ｗｉｔｈｔｗｏ　ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　ｍｅｔｈｏｄｓ２９第１期王润润等：用于蛋白质组分析的两种马铃薯块茎蛋白质提取方法的比较３９甘肃农业大学学报２０１９年１８０９、２６１０、３８１９、５３０６、８００１、８２０４、８２１０和６００５分别是７０ｋＵ热激相关蛋白，叶绿体、假定的线粒体ＮＡＤ依赖的苹果酸脱氢酶、烯醇酶类似物、脱氢抗坏血酸还原酶、蛋白酶抑制剂ＩＩ前体类型Ｂ、成熟酶Ｋ、酸性磷酸酶类似物和蛋白酶抑制剂１．图３　两种提取方法下马铃薯块茎差异表达蛋白质丰度比较Ｆｉｇｕｒｅ　３　Ｔｈｅ　ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ　ｏｆ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ　ｅｘｐｒｅｓｓｅｄｐｒｏｔｅｉｎｓ　ａｂｕｎｄａｎｃｅ　ｏｆ　ｐｏｔａｔｏ　ｔｕｂｅｒ　ｅｘｔｒａｃｔｅｄｗｉｔｈ　ｔｗｏ　ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　ｍｅｔｈｏｄｓ坏血酸还原酶和成熟酶Ｋ．此外，两步沉淀法较酚提取法鉴定到一些新出现的蛋白质包括假定的线粒体ＮＡＤ依赖的苹果酸脱氢酶、酸性磷酸酶类似物和蛋白酶抑制剂ＩＩ前体类型Ｂ．３　讨论蛋白质组学已经被广泛用于分析植物体各种生理生化机制［１６］．蛋白质样品的制备是２－ＤＥ的关键环节，直接影响２－ＤＥ的分辨率和分离效果．目前，国际上普遍采用的一种蛋白质提取方法是三氯乙酸／丙酮沉淀法，乙酸铵／甲醇沉淀法和酚提取法，单独的每种方法操作简便并且已经广泛应用于烟草（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ　ｔａｂａｃｕｍ）花粉［１７］、水稻（Ｏｒｙｚａ　ｓａｔｉｖａ）根［１８－１９］、拟南芥（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｔｈａｌｉａｎａ）叶片［２０］和葡萄（Ｖｉｔｉｓ　ｖｉｎｉｆｅｒａ）叶和根［２１］、香蕉（Ｍｕｓａ　ｓｐｐ）和苹果（Ｍａｌｕｓ　ｄｏｍｅｓｔｉｃａ）［２２］等组织的蛋白质提取．但是，对于富含酚类、色素类、脂类以及有机酸等次生代谢物质的材料，蛋白质提取效果却并不理想．三氯乙酸／丙酮沉淀法具有降低次生代谢物质脂肪和色素的干扰、减少蛋白质降解等优点［２３］，乙酸铵／甲醇沉淀法可有效去除样品中的可溶性杂质［１３］．本试验将三氯乙酸／丙酮沉淀和乙酸铵／甲醇沉淀结合在一起的两步沉淀法提取的蛋白质和酚提取法提取的蛋白质比较，两步沉淀法提取的蛋白质的含量较低，但其蛋白质纯度和浓度显著增加，说明三氯乙酸／丙酮沉淀与乙酸铵／甲醇沉淀相结合的两步沉淀法比酚提取法提取马铃薯块茎蛋白质更有效，除杂效果更彻底．用酚提取法提取蛋白质时，由于只收集酚相，大量的沉淀物被丢弃，导致蛋白质的损失较多［２４］．经质谱分析两步沉淀法和酚提取法表达量在２．５倍以上的差异表达蛋白质，主要富集在碱性区（ｐＨ７～１０），包括酸性磷酸酶类似物、成熟酶、烯醇酶类似物、假定的线粒体ＮＡＤ依赖的苹果酸脱氢酶，与Ｄｅｌａｐｌａｃｅ等［２５］采用酚提取法提取马铃薯块茎蛋白质经２－ＤＥ分离后蛋白质主要富集在酸性区（ｐＨ４～７）相比，两步沉淀法大大提高了马铃薯块茎碱性区蛋白质的收集，改善了酚提取法碱性区蛋白质损失多的特性．４　结论采用酚提取法和三氯乙酸／丙酮沉淀与乙酸铵／甲醇沉淀相结合的两步沉淀法提取马铃薯块茎蛋白质，经过２－ＤＥ图谱分析发现两步沉淀法提取马铃薯块茎蛋白质点数量增加且蛋白质点分离效果好．该方法具有更好的除杂效果和高效富集碱性区域蛋白质的作用，是提取马铃薯块茎蛋白质的最佳方法，为研究马铃薯块茎蛋白质组学提供了更完善的技术支撑．参考文献［１］　Ｗａｎｇ　Ｗ，Ｔａｉ　Ｆ，Ｃｈｅｎ　Ｓ．Ｏｐｔｉｍｉｚｉｎｇ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｆｒｏｍ　ｐｌａｎｔ　ｔｉｓｓｕｅｓ　ｆｏｒ　ｅｎｈａｎｃｅｄ　ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ　ａｎａｌｙｓｉｓ［Ｊ］．Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ　Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００８，３１（１１）：２０３２－２０３９．［２］　Ｒｏｄｅ　Ｃ，Ｗｉｎｋｅｌｍａｎｎ　Ｔ，Ｂｒａｕｎ　Ｈ　Ｐ，ｅｔ　ａｌ．Ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｇｅｌ　ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ（ＤＩＧＥ）：ｍｅｔｈｏｄｓ　ａｎｄ　ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ［Ｍ］．Ｔｏｔｏｗａ：Ｈｕｍａｎａ　Ｐｒｅｓｓ，２０１２．［３］　Ｗａｎｇ　Ｘ，Ｓｈｉ　Ｍ，Ｌｕ　Ｘ，ｅｔ　ａｌ．Ａ　ｍｅｔｈｏｄ　ｆｏｒ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｅｘ－ｔｒａｃｔｉｏｎ　ｆｒｏｍ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒ　ｆｒａｃｔｉｏｎｓ　ｏｆ　ｌａｔｉｃｉｆｅｒｌａｔｅｘ　ｉｎ　Ｈｅｖｅａ　ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ　ｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ　ｗｉｔｈ　２－ＤＥ　ａｎｄＭＳ［Ｊ］．Ｐｒｏｔｅｏｍｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０１０，８（１）：３５－４５．［４］　Ｓｅｂａｓｔｉａｎａ　Ｍ，Ｆｉｇｕｅｉｒｅｄｏ　Ａ，Ｍｏｎｔｅｉｒｏ　Ｆ，ｅｔ　ａｌ．Ａ　ｐｏｓｓｉ－ｂｌｅ　ａｐｐｒｏａｃｈ　ｆｏｒ　ｇｅｌ－ｂａｓｅｄ　ｐｒｏｔｅｏｍｉｃ　ｓｔｕｄｉｅｓ　ｉｎ　ｒｅｃａｌｃｉ－ｔｒａｎｔ　ｗｏｏｄｙ　ｐｌａｎｔｓ［Ｊ］．Ｓｐｒｉｎｇｅｒｐｌｕｓ，２０１３，２（１）：２１０．４９第１期王润润等：用于蛋白质组分析的两种马铃薯块茎蛋白质提取方法的比较［５］　Ｆａｕｒｏｂｅｒｔ　Ｍ，Ｐｅｌｐｏｉｒ　Ｅ，Ｃｈａ　ｂ　Ｊ．Ｐｌａｎｔ　ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ：ｍｅｔｈｏｄｓ　ａｎｄ　ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ［Ｍ］．Ｔｏｔｏｗａ：Ｈｕｍａｎａ　Ｐｒｅｓｓ，２００７．［６］　Ｈｅ　Ｃ，Ｗａｎｇ　Ｙ．Ｐｒｏｔｅｉｎ　ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　ｆｒｏｍ　ｌｅａｖｅｓ　ｏｆ　Ａｌｏｅｖｅｒａ　Ｌ．，ａ　ｓｕｃｃｕｌｅｎｔ　ａｎｄ　ｒｅｃａｌｃｉｔｒａｎｔ　ｐｌａｎｔ，ｆｏｒ　ｐｒｏ－ｔｅｏｍｉｃ　ａｎａｌｙｓｉｓ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　Ｒｅｐｏｒｔｅｒ，２００８，２６（４）：２９２－３００．［７］　Ｌａｕ　Ｂ　Ｙ，Ｄｅｂ－Ｃｈｏｕｄｈｕｒｙ　Ｓ，Ｍｏｒｔｏｎ　Ｊ　Ｄ，ｅｔ　ａｌ．Ｍｅｔｈｏｄｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ　ｔｏ　ｅｘｔｒａｃｔ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｆｒｏｍ　ｏｉｌ　ｐａｌｍ　ｃｈｒｏ－ｍｏｐｌａｓｔ　ｆｏｒ　ｐｒｏｔｅｏｍｉｃ　ａｎａｌｙｓｉｓ［Ｊ］．Ｓｐｒｉｎｇｅｒｐｌｕｓ，２０１５，４（１）：７９１－８０４．［８］　Ａｌ－Ｏｂａｉｄｉ　Ｊ　Ｒ，Ｓａｉｄｉ　Ｎ　Ｂ，Ｕｓｕｌｄｉｎ　Ｓ　Ｒ，ｅｔ　ａｌ．Ｃｏｍｐａｒｉ－ｓｏｎ　ｏｆ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　ｍｅｔｈｏｄｓ　ｆｏｒ　ｇｅｌ－ｂａｓｅｄ　ｐｒｏｔｅｏｍｉｃ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ｇａｎｏｄｅｒｍａ　ｓｐｐ［Ｊ］．ＰｒｏｔｅｉｎＪｏｕｒｎａｌ，２０１６，３５（２）：１００－６．［９］　Ｃａｌｄｅｒａｎ－Ｒｏｄｒｉｇｕｅｓ　Ｍ　Ｊ，Ｊａｍｅｔ　Ｅ，Ｄｏｕｃｈｅ　Ｔ，ｅｔ　ａｌ．Ｃｅｌｌｗａｌｌ　ｐｒｏｔｅｏｍｅ　ｏｆ　ｓｕｇａｒｃａｎｅ　ｓｔｅｍｓ：ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ　ｏｆ　ａ　ｄｅ－ｓｔｒｕｃｔｉｖｅ　ａｎｄ　ａ　ｎｏｎ－ｄｅｓｔｒｕｃｔｉｖｅ　ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　ｍｅｔｈｏｄｓｈｏｗｅｄ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ　ｉｎ　ｇｌｙｃｏｓｉｄｅ　ｈｙｄｒｏｌａｓｅｓ　ａｎｄ　ｐｅｒｏｘｉ－ｄａｓｅｓ［Ｊ］．ＢＭＣ　Ｐｌａｎｔ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，２０１６，１６（１）：１４－３１．［１０］　Ｓｏｎｇ　Ｙ，Ｚｈａｎｇ　Ｈ，Ｗａｎｇ　Ｇ，ｅｔ　ａｌ．ＤＭＳＯ，ａｎ　ｏｒｇａｎｉｃｃｌｅａｎｕｐ　ｓｏｌｖｅｎｔ　ｆｏｒ　ＴＣＡ／ａｃｅｔｏｎｅ－ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｅｄ　ｐｒｏ－ｔｅｉｎｓ，ｉｍｐｒｏｖｅｓ　２－ＤＥ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ｒｉｃｅ　ｒｏｏｔｓ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　Ｒｅｐｏｒｔｅｒ，２０１２，３０（５）：１２０４－１２０９．［１１］　Ｌｕ　ｓ　Ｉ　Ｍ，Ａｌｅｘａｎｄｒｅ　Ｂ　Ｍ，Ｏｌｉｖｅｉｒａ　Ｍ　Ｍ，ｅｔ　ａｌ．Ｓｅｌｅｃ－ｔｉｏｎ　ｏｆ　ａｎ　ａｐｐｒｏｐｒｉａｔｅ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　ｍｅｔｈｏｄ　ｔｏｓｔｕｄｙ　ｔｈｅ　ｐｈｏｓｐｈｏｐｒｏｔｅｏｍｅ　ｏｆ　ｍａｉｚｅ　ｐｈｏｔｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃｔｉｓｓｕｅ［Ｊ］．Ｐｌｏｓ　Ｏｎｅ，２０１６，１１（１０）：ｅ０１６４３８７．［１２］　李成．马铃薯匍匐茎发育特性、二倍体野生种与四倍体栽培种块茎差异蛋白质组研究［Ｄ］．兰州：甘肃农业大学，２０１５．［１３］　Ｋａｒｐｐｉｎｅｎ　Ｋ，Ｔａｕｌａｖｕｏｒｉ　Ｅ，Ｈｏｈｔｏｌａ　Ａ．Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎｏｆ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　ｆｒｏｍ　Ｈｙｐｅｒｉｃｕｍ　ｐｅｒｆｏｒａｔｕｍｔｉｓｓｕｅｓ　ａｎｄ　ｉｍｍｕｎｏｂｌｏｔｔｉｎｇ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｈｙｐ－１ａｔ　ｄｉｆ－ｆｅｒｅｎｔ　ｓｔａｇｅｓ　ｏｆ　ｌｅａｆ　ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ［Ｊ］．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏ－ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１０，４６（３）：２１９－２６．［１４］　Ｗａｎｇ　Ｗ，Ｖｉｇｎａｎｉ　Ｒ，Ｓｃａｌｉ　Ｍ，ｅｔ　ａｌ．Ａ　ｕｎｉｖｅｒｓａｌ　ａｎｄｒａｐｉｄ　ｐｒｏｔｏｃｏｌ　ｆｏｒ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　ｆｒｏｍ　ｒｅｃａｌｃｉｔｒａｎｔｐｌａｎｔ　ｔｉｓｓｕｅｓ　ｆｏｒ　ｐｒｏｔｅｏｍｉｃ　ａｎａｌｙｓｉｓ［Ｊ］．Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅ－ｓｉｓ，２００６，２７（１３）：２７８２－２７８６．［１５］　Ｖｅｒｔｏｍｍｅｎ　Ａ，Ｐａｎｉｓ　Ｂ，Ｓｗｅｎｎｅｎ　Ｒ，ｅｔ　ａｌ．Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎｏｆ　ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ／ｍｅｔｈａｎｏｌ　ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　ｔｏ　ｆａｃｉｌｉｔａｔｅ　ｔｈｅｓｔｕｄｙ　ｏｆ　ｍｅｍｂｒａｎｅ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｏｆ　ｎｏｎ－ｍｏｄｅｌ　ｐｌａｎｔｓ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔａ，２０１０，２３１（５）：１１１３－１１２５．［１６］　Ｊｏｒｒｉｎ　Ｊ　Ｖ，Ｍａｌｄｏｎａｄｏ　Ａ　Ｍ，Ｃａｓｔｉｌｌｅｊｏ　Ｍ　Ａ．Ｐｌａｎｔｐｒｏｔｅｏｍｅ　ａｎａｌｙｓｉｓ：ａ　２００６ｕｐｄａｔｅ［Ｊ］．Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ，２００７，７（１６）：２９４７－２９６２．［１７］　Ｆíｌａ　Ｊ，ＡｐｋｏｖáＶ，ＦｅｃｉｋｏｖáＪ，ｅｔ　ａｌ．Ｉｍｐａｃｔ　ｏｆ　ｈｏｍｏｇｅ－ｎｉｚａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ　ｏｎ　ｔｈｅ　ｏｂ－ｔａｉｎｅｄ　ｔｏｂａｃｃｏ　ｐｏｌｌｅｎ　ｐｒｏｔｅｏｍｉｃ　ｐａｔｔｅｒｎｓ［Ｊ］．ＢｉｏｌｏｇｉａＰｌａｎｔａｒｕｍ，２０１１，５５（３）：４９９－５０６．［１８］　Ｘｉａｎｇ　Ｘ，Ｎｉｎｇ　Ｓ，Ｊｉａｎｇ　Ｘ，ｅｔ　ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ　ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｆｒｏｍ　ｒｉｃｅ（Ｏｒｙｚａ　ｓａｔｉｖａ　Ｌ．）ｒｏｏｔ　ｆｏｒ　ｔｗｏ－ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ－ａｌ　ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｒｅｓｉｓ［Ｊ］．Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ　ｏｆ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ　ｉｎ　Ｃｈｉ－ｎａ，２０１０，４（４）：４１６－４２１．［１９］　Ｒａｏｒａｎｅ　Ｍ　Ｌ，Ｎａｒｃｉｓｏ　Ｊ　Ｏ，Ｋｏｈｌｉ　Ａ．Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｆｒｏｍ　ｐｌａｎｔｓ：ｍｅｔｈｏｄｓ　ａｎｄ　ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ［Ｍ］．Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ：Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，２０１６．［２０］　Ｓｇｈａｉｅｒ－Ｈａｍｍａｍｉ　Ｂ，Ｒｅｄｏｎｄｏ－Ｌ　ｐｅｚ　Ｉ，Ｍａｌｄｏｎａｄｏ－Ａｌｃｏｎａｄａ　Ａ　Ｍ，ｅｔ　ａｌ．Ａ　ｐｒｏｔｅｏｍｉｃ　ａｐｐｒｏａｃｈ　ａｎａｌｙｓｉｎｇｔｈｅ　ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｔｈａｌｉａｎａ　ｒｅｓｐｏｎｓｅ　ｔｏ　ｖｉｒｕｌｅｎｔ　ａｎｄ　ａ－ｖｉｒｕｌｅｎｔ　ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｓｙｒｉｎｇａｅ　ｓｔｒａｉｎｓ［Ｊ］．ＡｃｔａＰｈｙｓｉｏｌｏｇｉａｅ　Ｐｌａｎｔａｒｕｍ，２０１１，３４（３）：９０５－９２２．［２１］　Ｊｅｌｌｏｕｌｉ　Ｎ，Ｓａｌｅｍ　Ａ　Ｂ，Ｇｈｏｒｂｅｌ　Ａ，ｅｔ　ａｌ．Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ　ｏｆｐｒｏｔｅｉｎ　ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　ｍｅｔｈｏｄｓ　ｆｏｒ　ｖｉｔｉｓ　ｖｉｎｉｆｅｒａ　ｌｅａｆ　ａｎｄｒｏｏｔ　ｐｒｏｔｅｏｍｅ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｂｙ　ｔｗｏ－ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ　ｅｌｅｃｔｒｏ－ｐｈｏｒｅｓｉｓ［Ｊ］．Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ　Ｐｌａｎｔ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，２０１０，５２（１０）：９３３－４０．［２２］　Ｃａｒｐｅｎｔｉｅｒ　Ｓ　Ｃ，Ｗｉｔｔｅｒｓ　Ｅ，Ｌａｕｋｅｎｓ　Ｋ，ｅｔ　ａｌ．Ｐｒｅｐａｒａ－ｔｉｏｎ　ｏｆ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｅｘｔｒａｃｔｓ　ｆｒｏｍ　ｒｅｃａｌｃｉｔｒａｎｔ　ｐｌａｎｔ　ｔｉｓ－ｓｕｅｓ：Ａｎ　ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｍｅｔｈｏｄｓ　ｆｏｒ　ｔｗｏ－ｄｉ－ｍｅｎｓｉｏｎａｌ　ｇｅｌ　ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ　ａｎａｌｙｓｉｓ［Ｊ］．Ｐｒｏ－ｔｅｏｍｉｃｓ，２００５，５（１０）：２４９７－２５０７．［２３］　Ｗｕ　Ｘ，Ｘｉｏｎｇ　Ｅ，Ｗａｎｇ　Ｗ，ｅｔ　ａｌ．Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ　ｓａｍｐｌｅｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ　ｍｅｔｈｏｄ　ｉｎｔｅｇｒａｔｉｎｇ　ｔｒｉｃｈｌｏｒｏａｃｅｔｉｃ　ａｃｉｄ／ａｃｅｔｏｎｅ　ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ　ｗｉｔｈ　ｐｈｅｎｏｌ　ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　ｆｏｒ　ｃｒｏｐｐｒｏｔｅｏｍｉｃ　ａｎａｌｙｓｉｓ［Ｊ］．Ｎａｔｕｒｅ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，２０１４，９（２）：３６２－３７４．［２４］　Ｃｉｌｉａ　Ｍ，Ｆｉｓｈ　Ｔ，Ｙａｎｇ　Ｘ，ｅｔ　ａｌ．Ａ　ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ　ｏｆ　ｐｒｏ－ｔｅｉｎ　ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　ｍｅｔｈｏｄｓ　ｓｕｉｔａｂｌｅ　ｆｏｒ　ｇｅｌ－ｂａｓｅｄ　ｐｒｏ－ｔｅｏｍｉｃ　ｓｔｕｄｉｅｓ　ｏｆ　ａｐｈｉｄ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ［Ｊ］．Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｍｏ－ｌｅｃｕｌａｒ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，２００９，２０（４）：２０１－２１５．［２５］　Ｄｅｌａｐｌａｃｅ　Ｐ，Ｗａｌ　Ｆｖｄ，Ｄｉｅｒｉｃｋ　Ｊ　Ｆ，ｅｔ　ａｌ．Ｐｏｔａｔｏ　ｔｕｂｅｒｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ：Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ　ｏｆ　ｔｗｏ　ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ　ｅｘ－ｔｒａｃｔｉｏｎ　ｍｅｔｈｏｄｓ　ｄｅｓｉｇｎｅｄ　ｆｏｒ　２－ＤＥ　ｏｆ　ａｃｉｄｉｃ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ［Ｊ］．Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ，２００６，２４（６）：６４９４－６４９７．（责任编辑　赵晓倩）５９。

TCA-丙酮沉淀法提取聚合草叶蛋白的研究

ｅｃｎｎｉｅｉｇＣｌｇ，ｈｎｉｇｃｌｒｌｎｖｒｔ，ａｇｈｎｉ３８１ｎｅａｄＥｇｅｒｏｌｅＳａｘＡｒｕｔａＵｉｓｙＴｉＳａｘ０００）ｎｎｅｉｕｅｉｕ
【ｂｔｃ］Ｏｂｅｔｅｏｓｄｅｅｔｃｉｆｅｆｒｅｆｙｐｙｕｅｅｒｕ．ｉＣＡｓｒｔａｊｃｉＴｕｙｈｘｒｔｎｏｌａｐｏｉｏｍｈｔｍＰｚｇｉｍＬｗｔＴＡｖｔｔａｏｔｎＳｎｈ
物活性肽的良好植物源蛋白，为此必须建立高效的
聚合草蛋白质提取方法，研究用ＴＡ一丙酮沉淀本Ｃ
机，兰州科近真空冻干技术有限公司；ＺＨＱ—Ｃ空气浴振荡器，哈尔滨市东明医疗仪器厂；Ｄ４Ｂ型ＴＬ一０台式离心机，上海安亭科学仪器厂等。３实验试剂：．牛血清白蛋白，ｍｅｏ公司；马Ａｒｓ考
聚合草属（ｙｐｙｕ，一种繁殖容易，长迅Ｓｍｈｔｍ）是生速，活力强，高度再生性，湿抗寒的丛生型植生具喜物 ¨ 。叶蛋白又称绿色蛋白浓缩物（ｅｆｐｏｅＬａｒｔｎｉｃｎｅｔｔｎＬＣ，ｏｃｎｒｉ，Ｐ）研究表明，蛋白原料丰富、ａｏ叶营养价值高、济效益高，一种具有开发利用价值经是
料提取蛋白时，取率和提取物纯度如表１所示，提可知从鲜叶中提取粗蛋白的得率和纯度均高于干叶。

TCA 蛋白沉淀方法

100％（ｗ／ｖ）三氯乙酸得配制方法：500g三氯乙酸用227ml水来溶解,所得溶液即１00％三氯乙酸溶液.避光,4度保存.(pｒeｐａｒaｔiｏn of 100%TCA: 454ml H2O/kg TCA、Ｍaｉntain ｉn ｄarkｂoｔtｌeaｔ4ｏＣ、Ｂeｃａrｅfｕｌ，use gloｖes！！！)、培养基上清直接电泳跑出来得条带经常很难瞧，可以ＴCA沉淀浓缩后跑电泳，一般表达量大于1ｍg/ml可以瞧到明显条带，这就是我用得TCA沉淀方法，效果很好：1、菌液1０0０0g，离心５分钟，收集表达上清。

2、取500－１000ul上清于EP管中，加入1/9体积得10０％TCＡ，颠倒10次混匀。

3、样品置于冰浴中大于0、5小时，过夜效果更好.４、15000g，离心10－2０分钟,可见有棕黑色沉淀,倒掉上清，将EP管倒扣在吸水纸上轻轻控几下，除去残余在管口得液体。

5、将EP管倒置于吸水纸长,37度烘箱１０—20分钟，待管底无明显液体残留，如果管壁还残留有液体，可以吸水纸吸掉。

可以改成室温或用电吹风，关键就是除去管底与管壁残余液体.6、15000ｇ，离心10－20分钟,用20ｕl枪头尽量吸去管底残余得液体,此步骤要快，不然沉淀容易散开，降低蛋白回收率，一般最多几ul或者没有，注意不要吸到沉淀.7、ＥP管倒置于吸水纸长,37度烘箱5分钟，确认管壁与管底没有液体残留。

8、加入2０－５0ul Lｏadｉｎg ｂｕｆｆer，9５度加热１0nｉm，一般沉淀会自动溶解,如果不溶,用手指轻弹管壁或用２0ul枪头轻轻吸打,注意整个操作尽量不要碰到管壁，因为管壁可能沾有残余ＴCA。

如果蓝色得Loadinｇbuｆｆer 不变成黄色，说明残余TCＡ吸弃了干净，如果变黄,一般不影响电泳。

此方法连丙酮洗这一步都省了,而且不影响电泳效果。

或者第５步与第6步改为丙酮洗：5、加入200ul冰冷得丙酮，用手指轻弹EP管,洗去管底与管壁残余得TCA.6、１50００g,离心10－20分钟，倒掉上清,将EP管倒扣在吸水纸上轻轻控几下,除去残余在管口得液体.ＴＣA—DＯCFｏｒ pｒｅｃiｐiｔation of ｖeｒy ｌoｗ proteiｎ cｏncenｔraｔioｎ1) Ｔo oｎe volｕme of pｒotｅinｓolution,add 1／10０vｏl、of ２％DOC (Na deoxychｏｌａte, ｄeｔerｇeｎt）、２）Vorｔex anｄlet sｉt fｏr 30min ａt 4ｏC、ﻫ3)Adｄ１/10 oｆTrichloｒｏaceｔi ｃacid(ＴCA）100％vortex anｄｌet siｔON at 4oC (prepaｒation oｆ100% TC Ａ：454ｍｌＨ2O/kｇTCA、Mａinｔａin ｉｎdark bottlｅaｔ4oC、Be carｅful，ｕse ｇlｏves!！!）、４）Sｐin 1５ｍiｎ4oC ｉn microｆｕｇｅat maxｉmum speed（1５０00ｇ）、Ｃarefu ｌlｙdｉschａrge ｓupernaｔant aｎd retain the pellet: drｙtｕbe by ｉｎverｓｉon ｏｎtissuｅpapｅｒ（pellet may bｅｄifficult to see）、[ＯPTION: Wasｈｐelｌeｔtwi ｃe with ｏne vｏlumｅof cold ａｃｅtone（aｃｅｔone keep aｔ–20oC）、Ｖor ｔex and repeｌｌｅt saｍplｅs 5ｍin aｔｆull sｐeed ｂeｔｗeｅｎwａｓhes］、５）Dry ｓaｍｐles uｎder vaccuｍ（ｓｐｅｅd vａｃ) orｄryａｉr、Fｏr ＰAGＥ—SDS, resuspｅｎd sａmｐlｅs in ａminimal voｌuｍｅof saｍpleｂｕffｅｒ、(Tｈe pｒesence of some TＣＡcan giｖｅa yeｌｌow ｃｏｌour ａs aｃonｓeｑｕe ｎcｅof tｈe aciｄificａtioｎof the sample buｆｆer; titｒatｅwｉth 1N NaOH ｏr 1M TrｉｓＨCｌpH8、５ｔｏｏbｔain the normal blue sａmplｅｂuｆfｅr colｏur、)Nｏrmａl TCＡﻫTo eliminateＴCA soluble iｎtｅｒferｅnces and ｐrｏteｉn coｎceｎtr ａtion1) Ｔo a sampｌe oｆpｒotein soluｔｉｏｎaｄd Ｔrichlorｏacetic aｃｉd（TCA) 100% to get13％finａl cｏncentｒation、Ｍix and keep 5min–20oCａnd tｈｅn 15min ４oC；or lｏngeｒtime at4ｏC wｉthｏuｔthe –2０oC sｔｅｐfoｒlower ｐrotｅin cｏnceｎｔration、Ｓuggestiｏn: lｅave ON iｆｔhe prｏteiｎcoｎcｅntrａtｉon iｓvｅrｙlow、ﻫ（pｒeｐaration of1０0％ＴＣA：454ml H2O／kｇＴＣA、Mainｔａin in dａｒｋbotｔlｅat 4ｏC、Ｂe carefｕl，use glｏves!!!)、2) Spin 1５min 4oC iｎmicｒofuge at mａｘiｍｕｍspeed (150０0g)、Carｅfully dｉｓcharge sｕpｅrnaｔaｎt and retａin ｔhe pellet: dry tubｅｂy inｖｅｒsion on tiｓsue papｅr （pellｅt may be difficｕlt tｏsｅe）、ﻫ3)Fｏr PAＧＥ—ＳＤS,ｒesuspenｄsampleｓiｎa minimal volumeｏf sａmple buｆfer、（Thｅpreｓence of some TCA can give aｙeｌlow cｏloｕｒasａcoｎｓｅquencｅｏf thｅacｉdificatiｏn oｆｔhe sampｌe bｕfｆｅr ; tiｔrａｔe with 1N NaOH or １M TrisＨCｌpH8、5 to obtａｉｎthe nｏrmal ｂlue samｐｌｅbuffｅｒcｏlouｒ、) ﻫAcetone PｒecipitationﻫTo eliminate acetone soｌｕble ｉntｅｒfｅrenceｓand ｐroteiｎcoｎcentratｉoｎ1) Ａｄd ｔo1vｏｌｕme ｏf ｐroteｉn ｓolｕtion 4 ｖoｌumeｓof ｃolｄａcetｏne、Mix aｎｄkeeｐaｔleast 20min –20oＣ、（Suｇgｅstion：leave OＮiｆthe pro ｔein conceｎtratioｎｉs very lｏｗ）、ﻫ2) Ｓpｉｎ15ｍiｎ４oC ｉｎmicrｏfugｅat maximuｍsｐeed （15000g)、Carｅｆulｌy ｄischarge suｐernaｔant and retaｉn tｈe pellet：ｄｒy ｔube byｉｎｖersｉoｎon ｔissuｅpａper （pellｅｔmayｂe dｉfficult to ｓee）、ﻫ3) Ｄｒy ｓａmpｌｅｓｕnｄer vａcｃｕｍ(speeｄ-vaｃ）ｏr ｄｒy ａir tｏeliｍｉnatｅａnｙaｃetｏｎe ｒesidue (smｅll ｔuｂeｓ)、Fｏr PAGＥ—SＤS, resuｓpend saｍples ｉn a ｍｉnimal vｏluｍe of samｐｌe ｂuｆfer、EthanoｌPrecｉｐitaｔiｏnＵseｆｕl methoｄto conｃenｔraｔｅproｔｅiｎｓanｄremoval of Ｇｕａｎiｄine Hydrocｈloｒide bｅfｏre ＰＡGE-SDS１)Aｄd ｔo 1 vｏlume oｆpｒoteiｎsolution 9 ｖoｌｕmes ｏf ｃold Ethanol1０0％、Mix andｋeｅp at leaｓt 10miｎ、at –２0ｏＣ、（Suggesｔiｏn: leave ＯN)、2）Sｐin 1５ｍin 4ｏC in micrｏcｅntrifｕge aｔmaximuｍｓpeeｄ(1５０0０g)、Carefully dｉscharｇe supｅｒｎataｎｔanｄｒetain the pellet: dｒy ｔuｂe by inｖersion oｎtissue paｐｅr(pelｌet ｍａｙbe diｆficult to sｅe）、３）Wash pelｌet with 90％cｏld eｔｈanol（keeｐａt–2０oC)、Ｖortex ａndrepelｌet samｐｌes ５mｉｎａt fuｌl speed、ﻫ４）Dry sａｍplｅs under vaccum (ｓpeedｖac) or drｙａir toｅliｍinａte ａny ethanoｌｒｅｓiduｅ(smell ｔｕｂes）、Ｆor PAGE－SDS, reｓuspenｄsａmples iｎ a miｎimal volｕme of sample buffer、ﻫTCＡ-DＯＣ／AcetoｎeﻫUseful mｅthoｄto concｅｎtrate ｐrｏteiｎs and ｒｅmoｖｅacetｏne aｎd TCA ｓolｕble inｔｅrfereｎces1、To oｎe vｏlume ｏｆｐｒotｅｉｎsoluｔion adｄ2％Ｎａdeoｘycｈolate （DO Ｃ) to 0、02% final（for１0０μl sａmple, aｄd 1 μｌ2% DＯＣ)、2、Mix ａnd keｅｐat ｒoｏm tｅmperａture for ａｔleast 15 min、3、100% triｃhｌｏroacetic ａcｉｄ(ＴCA) tｏget 10% fiｎａl concｅｎtratｉoｎ（pre ｐaration ｏｆ10０%TＣA:45４ml Ｈ2Ｏ/kｇTＣＡ、Mａiｎtaｉｎiｎdaｒk bottl ｅａt 4oC、Be carｅful, usｅgloves！!!）、ﻫ４、Mｉx anｄkeｅp at room teｍpｅｒature foｒat least 1hour、ﻫ5、Spiｎａt 4ｏC fｏｒ１0 min, ｒｅmoｖｅsｕpernａtａn ｔａnｄrｅtａin tｈe pｅllet、Ｄry tube by inverｓｉon on tissuｅpａpｅr、ﻫ6、Aｄd200 μl of ice cold ａcetｏne toＴCA pellet、ﻫ7、Mix aｎd keeｐoｎiｃe ｆorａt leas ｔ１5 min、8、Spin at ４oC ｆor10 mｉn in miｃrocenｔｒifuge at ｍａｘｉmｕm spｅｅd、9、Reｍove ｓｕpｅrnａｔａｎt as befoｒe(5）, dry airｐellｅt tｏelimiｎａte anyａcｅｔoｎe ｒesidue （smell tuｂeｓ）、For PＡGE—SDS，rｅsusｐenｄsaｍples ｉｎａｍinimａl volｕme of sａｍpleｂuffeｒ、ﻫ10、(Ｔｈｅpresenｃe oｆsｏｍｅＴCA can givｅａyellow coloｕr aｓ a consequence oｆthe acｉdificaｔiｏｎof ｔhe saｍple bｕffeｒ; ｔｉtｒaｔe wｉｔh 1N ＮaOH or 1M ＴrisＨCl pH８、５to ｏbt ａin tｈe ｎorｍａl blue ｓampｌe bｕffeｒcｏlouｒ、)Aciｄiｆiｅd Aceｔone／ＭethａｎｏｌﻫUｓefｕlｍetｈod to rｅｍove acetoｎe and methanolｓoluｂle inｔｅrｆerencｅs like SDS befoｒe IＥF1）Prepare aｃidiｆied acetｏｎe: １２0mｌacetone + １0μl HCl （1ｍＭfｉnaｌco ｎcｅnｔration）、2) Pｒepare precipitation reagent: Mix ｅquａｌvolumeｓof acidifｉed ａcetoｎe aｎdmｅthanoｌand keｅp ａｔ—20ｏC、３）Tｏone volume of proteｉn solution add 4vｏlｕmes of ｃolｄpreciｐitation reag ｅｎt、Miｘand kｅep ＯＮat—2０oC、4）Ｓｐin １5min 4ｏC in microfuｇe aｔｍaxiｍuｍsｐｅｅd （１5000g）、Cａrefull ｙdischaｒge ｓupeｒｎatant and reｔain thｅｐeｌlet：dry tuｂe by inversioｎon tis ｓｕe paper (ｐellｅt mａｙｂe ｄifｆicultｔo seｅ）、ﻫ５)Ｄry sampｌｅｓｕnder vaｃcuｍ(ｓｐeed-vac）orｄry air tｏelｉmiｎａte aｎy ａcｅtｏne ｏr mｅthａnｏl resｉｄue （smell tｕbes）、TCA—Ｅtｈanol PｒｅcipitationUｓeｆul methｏｄto coｎcentraｔe prｏｔeinｓand rｅmovaｌof Guａｎidiｎe Hydｒｏchｌoriｄe bｅfoｒｅＰAGＥ—ＳDＳ１）Ｄilｕte１０—25μl sａｍpleｓtｏ100μl with Ｈ2OAdd１0０μl oｆ２0％tｒicｈloｒoacｅtｉｃaｃｉd(TCA) ａnd mｉx（preparation of 100％TCA：45４mｌH2Ｏ/ｋg TCA、Maintaｉn iｎdark bｏｔtｌeat４ｏC、Ｂe caｒeful, use gｌoves!！!）、ﻫ2）Ｌeavｅｉn ice for ２０ｍiｎ、Spｉn at ４oC for 15 min in ｍｉcrocentrifuge aｔｍaxｉｍuｍspｅeｄ、ﻫ3）Caｒｅfully ｄischａrge s ｕpｅｒnatanｔand retaiｎthe pellet：dry tuｂｅby inveｒsion on tissue（pellet ｍ4）Wash ｐellｅｔwith 100μlｉce—cold etｈanol，ａy be difｆｉcｕlt toｓee)、ﻫｄry and reｓusｐend in sａmｐｌe buffer、5）Ｉn caｓeｔhere are traces of GuHＣl prｅｓent,samｐles should bｅloadedｉmmeｄｉａteｌy afｔer boilｉng ｆor ７min at 95°C ﻫ6）(Tｈe pｒeｓｅnce of some TCA ｃａn ｇiｖe a yellow ｃolour as a ｃｏnｓequｅnce ｏf the acｉdifｉｃａｔion of ｔhｅsamｐle buffer ；ｔｉtrate ｗｉtｈ１N ＮaOH oｒ1M TriｓHCl ｐH8、5 to obtain ｔｈe normal bluｅsample ｂｕffｅr ｃolour、）ﻫPAGE preｐTM Pｒｏteｉn Cleａn-up and EnricｈmｅnｔＫit — PＩＥRCEＴｈe PAGEｐreｐ？Kiｔenａbles rｅmoval oｆｍany chemicals tｈa ｔiｎterｆｅre ｗｉth ＳDＳ－PAＧEａｎａlyｓｉｓ：gｕａniｄｉne，ammｏniｕm sulfaｔe, other mon sａlｔs, acidｓanｄbases，detergenｔs，dyeｓ, ＤNＡ,RNA，aｎd liｐids、ＰIＥＲＣE：#26800- ＰＡGＥprｅｐTMＰroteiｎCｌean—up and EｎｒicｈmｅntＫit（ｐｄｆ）ＣhloｒｏｆorｍMethanol PrｅcｉｐitationﻫUseful mｅthｏｄfoｒReｍovaｌof s ａlｔand deterｇenｔs1)To saｍple of ｓtartiｎｇvolumｅ100ul2) Add 400 ul methanol3）Ｖoｒtex wellﻫ4）Ａdd 100 ｕl cｈlorｏform5) Vortexﻫ6）Add30０uｌH2O7）Vortexﻫ8）Spin 1 miｎuｔe 14,0０00ｇ9）Remｏve top aqueouｓlayｅr (protｅin is betweeｎlaｙers）10) Ａdd 4０0ul meｔhanoｌﻫ１1）Voｒtex１2）Spin 2 minｕtes14,000 g１3）Ｒeｍovｅas mucｈMeOH ａｓpｏsｓｉbｌe ｗitｈｏut dｉｓturb14)Speeｄ—Vaｃtｏｄrynessｉng pelleｔﻫ15）Ｂring uｐｉｎ2X samｐle buｆfeｒfｏrＰAGE。

TCA沉淀法

TCA沉淀法培养基上清直接电泳跑出来的条带经常很难看，可以TCA沉淀浓缩后跑电泳，一般表达量大于1mg/ml可以看到明显条带，这是我用的TCA沉淀方法，效果很好：1.菌液10000g,离心5分钟，收集表达上清。

2.取500-1000ul上清于EP管中，加入1/9体积的100％TCA，颠倒10次混匀。

3.样品置于冰浴中大于0.5小时，过夜效果更好。

4.15000g,离心10－20分钟,可见有棕黑色沉淀，倒掉上清，将EP管倒扣在吸水纸上轻轻控几下，除去残余在管口的液体。

5.将EP管倒置于吸水纸长，37度烘箱10－20分钟，待管底无明显液体残留，如果管壁还残留有液体，可以吸水纸吸掉。

可以改成室温或用电吹风，关键是除去管底和管壁残余液体。

6.15000g,离心10－20分钟,用20ul枪头尽量吸去管底残余的液体，此步骤要快，不然沉淀容易散开，降低蛋白回收率，一般最多几ul或者没有，注意不要吸到沉淀。

7.EP管倒置于吸水纸长，37度烘箱5分钟，确认管壁和管底没有液体残留。

8.加入20－50ul Loading buffer，95度加热10nim，一般沉淀会自动溶解，如果不溶，用手指轻弹管壁或用20ul枪头轻轻吸打，注意整个操作尽量不要碰到管壁，因为管壁可能沾有残余TCA。

如果蓝色的Loading buffer不变成黄色，说明残余TCA吸弃了干净，如果变黄，一般不影响电泳。

此方法连丙酮洗这一步都省了，而且不影响电泳效果。

或者第5步和第6步改为丙酮洗:5.加入200ul冰冷的丙酮，用手指轻弹EP管，洗去管底和管壁残余的TCA。

6.15000g,离心10－20分钟,倒掉上清，将EP管倒扣在吸水纸上轻轻控几下，除去残余在管口的液体。

TCA沉淀法定量DNA1. Dilute radioactive sample to a 100 ml volume2. Spot 5 ml of the sample onto the center of a 2.4 cm Whatman GF/C glass-fiber disc.3. Mix 5 ml of the sample with 100 ml Salmon sperm DNA (50 mg in 20 mM ED TA).4. Add 5 mL ice cold 10% Trichloroacetic acid (TCA). Mix well and incubate on ice for 15 min.5. Filter the solution through a separate GF/C glass-fiber disc.6. Wash the filter 6 times with 5 mL ice-cold 10% TCA.7. Wash filter once with 5 mL 95% Ethanol.8. Dry both filter under a heat lamp.9. When dry, count each in a scintillation counter.10. The first filter measures total radioactivity. The second filter measures radioactiv ity incorporated into DNA fragments greater than 20 nucleotides in length.。

蛋白质沉淀浓缩方法

蛋白质沉淀浓缩方法tca-doc沉淀的蛋白质含量非常低1)一个卷的蛋白质溶液,嵌入2%的1/100vol.doc(na鸟苷胆酸盐、洗涤剂)。

2)漩涡,使挤30分钟在4摄氏度。

3)添加1/10的三氯乙酸(tca)100%的漩涡,让坐在在4摄氏度(制备100%柠檬酸:454毫升水柠檬酸/公斤。

保持在黑暗bottleat4摄氏度。

小心,使用手套)4)转动15分钟4摄氏度在microfuge最小速度(15000克)。

认真振动沉在表面的颗粒和留存:潮湿管通过反演薄纸(颗粒可能将很难看见)。

(挑选:用一个卷热丙酮冲洗球两次(丙酮维持在-20oc)。

极速涡和repellet样本5分钟洗脸)之间。

5)真空下潮湿的样品(速度放假)或潮湿的空气。

page-sdsresuspend样品在样品的最轻体积缓冲器。

(一些柠檬酸的存有可以给一个黄色的颜色由于样本的酸化缓冲器;电解1n氢氧化钠或1mtrishclph8.5赢得正常的蓝色样品缓冲器颜色。

)正常的柠檬酸消解tca可溶性阻碍和蛋白质浓度1)样本的蛋白质溶液添加三氯乙酸(tca)100%13%最终浓度。

混合和保持5分钟-20oc 然后15分钟4摄氏度,或长时间在4摄氏度-20oc一步降低蛋白质浓度。

建议:如果走蛋白质浓度很低。

(制取100%柠檬酸:454毫升水柠檬酸/公斤。

维持在黑暗bottleat4摄氏度。

小心,采用手套)2)转动15分钟4摄氏度在microfuge最小速度(15000克)。

认真振动沉在表面的颗粒和留存:潮湿的玻璃管反演在薄纸(颗粒可能将很难看见)。

3)page-sds,resuspend 样本的最轻体积样品缓冲器。

(一些柠檬酸的存有可以给一个黄色的颜色由于样本的酸化缓冲器;电解1n氢氧化钠或1mtrishclph8.5赢得正常的蓝色样品缓冲器颜色。

)丙酮沉淀消解丙酮氢氧化物阻碍和蛋白质浓度1)增加1卷的蛋白质溶液4卷冷丙酮。

混合和保持至少20分钟-20oc。

沉淀蛋白质的常用方法(TCA、乙醇、丙酮沉淀蛋白操作步骤)

沉淀蛋白质的常用方法（TCA、乙醇、丙酮沉淀蛋白操作步骤）TCA-DOCFor precipitation of very low protein concentration1) To one volume of protein solution, add 1/100 vol. of 2% DOC (Na deoxycholate, detergent).2) Vortex and let sit for 30min at 4oC.3) Add 1/10 of Trichloroacetic acid (TCA) 100% vortex and let sit ON at 4oC (preparation of 100% TCA: 454ml H2O/kg TCA. Maintain in dark bottleat careful, use gloves).4) Spin 15min 4oC in microfuge at maximum speed (15000g). Carefully discharge supernatant and retain the pellet: dry tube by inversion on tissue paper (pellet may be difficult to see). [OPTION: Wash pellet twice with one volume of cold acetone (acetone keep at –20oC). Vortex and repellet samples 5min at full speed between washes].5) Dry samples under vaccum (speed vac) or dry air. For PAGE-SDS, resuspend samples in a minimal volume of sample buffer. (The presence of some TCA can give a yellow colour as a consequence of the acidification of the sample buffer ; titrate with 1N NaOH or 1M TrisHCl to obtain the normal blue sample buffer colour.)Normal TCATo eliminate TCA soluble interferences and protein concentration1) To a sample of protein solution add Trichloroacetic acid (TCA) 100% to get 13% final concentration. Mix and keep 5min –20oC and then 15min 4oC; or longer time at 4oC without the –20oC step for lower protein concentration. Suggestion: leave ON if the protein concentration is very low.(preparation of 100% TCA: 454ml H2O/kg TCA. Maintain in dark bottleat careful, use gloves).2) Spin 15min 4oC in microfuge at maximum speed (15000g). Carefully discharge supernatant and retain the pellet: dry tube by inversion on tissue paper (pellet may be difficult to see).3) For PAGE-SDS, resuspend samples in a minimal volume of sample buffer. (The presence of some TCA can give a yellow colour as a consequence of the acidification of the sample buffer ; titrate with 1N NaOH or 1M TrisHCl to obtain the normal blue sample buffer colour.)Acetone PrecipitationTo eliminate acetone soluble interferences and protein concentration 1) Add to 1 volume of protein solution 4 volumes of cold acetone. Mix and keep at least 20min –20oC. (Suggestion: leave ON if the protein concentration is very low).2) Spin 15min 4oC in microfuge at maximum speed (15000g). Carefully discharge supernatant and retain the pellet: dry tube by inversion on tissue paper (pellet may be difficult to see).3) Dry samples under vaccum (speed-vac) or dry air to eliminate any acetone residue (smell tubes). For PAGE-SDS, resuspend samples in a minimal volume of sample buffer.Ethanol PrecipitationUseful method to concentrate proteins and removal of Guanidine Hydrochloride before PAGE-SDS1) Add to 1 volume of protein solution 9 volumes of cold Ethanol 100%. Mix and keep at least –20oC. (Suggestion: leave ON).2) Spin 15min 4oC in microcentrifuge at maximum speed (15000g). Carefully discharge supernatant and retain the pellet: dry tube by inversion on tissue paper (pellet may be difficult to see).3) Wash pellet with 90% cold ethanol (keep at –20oC). Vortex and repellet samples 5min at full speed.4) Dry samples under vaccum (speed vac) or dry air to eliminate any ethanol residue (smell tubes). For PAGE-SDS, resuspend samples in a minimal volume of sample buffer.TCA-DOC/AcetoneUseful method to concentrate proteins and remove acetone and TCA soluble interferences1. To one volume of protein solution add 2% Na deoxycholate (DOC) to % final (for 100 μl sample, add 1 μl 2% DOC).2. Mix and keep at room temperature for at least 15 min.3. 100% trichloroacetic acid (TCA) to get 10% final concentration (preparation of 100% TCA: 454ml H2O/kg TCA. Maintain in dark bottleat careful, use gloves).4. Mix and keep at room temperature for at least 1 hour.5. Spin at 4oC for 10 min, remove supernatant and retain the pellet. Dry tube by inversion on tissue paper.6. Add 200 μl of ice cold acetone to TCA pellet.7. Mix and keep on ice for at least 15 min.8. Spin at 4oC for 10 min in microcentrifuge at maximum speed.9. Remove supernatant as before (5), dry air pellet to eliminate any acetone residue (smell tubes). For PAGE-SDS, resuspend samples in a minimal volume of sample buffer.10. (The presence of some TCA can give a yellow colour as a consequence of the acidification of the sample buffer ; titrate with 1N NaOH or 1M TrisHCl to obtain the normal blue sample buffer colour.)Acidified Acetone/MethanolUseful method to remove acetone and methanol soluble interferences like SDS before IEF1) Prepare acidified acetone: 120ml acetone + 10μl HCl (1mM final concentration).2) Prepare precipitation reagent: Mix equal volumes of acidified acetone and methanol and keep at -20oC.3) To one volume of protein solution add 4 volumes of cold precipitation reagent. Mix and keep ON at -20oC.4) Spin 15min 4oC in microfuge at maximum speed (15000g). Carefully discharge supernatant and retain the pellet: dry tube by inversion on tissue paper (pellet may be difficult to see).5) Dry samples under vaccum (speed-vac) or dry air to eliminate any acetone or methanol residue (smell tubes).TCA-Ethanol PrecipitationUseful method to concentrate proteins and removal of Guanidine Hydrochloride before PAGE-SDSO1) Dilute 10-25μl samples to 100μl with H2Add 100μl of 20% trichloroacetic ac id (TCA) and mix (preparation of 100% TCA: 454ml HO/kg TCA. Maintain in dark bottleat careful, use2gloves).2) Leave in ice for 20min. Spin at 4oC for 15 min in microcentrifuge at maximum speed.3) Carefully discharge supernatant and retain the pellet: dry tube by inversion on tissue (pellet may be difficult to see).4) Wash pellet with 100μl ice-cold ethanol, dry and resuspend in sample buffer.5) In case there are traces of GuHCl present, samples should be loaded immediately after boiling for 7 min at 95°C6) (The presence of some TCA can give a yellow colour as a consequence of the acidification of the sample buffer ; titrate with 1N NaOH or 1M TrisHCl to obtain the normal blue sample buffer colour.)PAGE prep TM Protein Clean-up and Enrichment Kit - PIERCEThe PAGEprep Kit enables removal of many chemicals that interfere with SDS-PAGE analysis: guanidine, ammonium sulfate, other common salts, acids and bases, detergents, dyes, DNA, RNA, and lipids.PIERCE: #26800 - PAGE prep TM Protein Clean-up and Enrichment Kit (pdf)Chloroform Methanol PrecipitationUseful method for Removal of salt and detergents1) To sample of starting volume 100 ul2) Add 400 ul methanol3) Vortex well4) Add 100 ul chloroform5) Vortex6) Add 300 ul H2O7) Vortex8) Spin 1 minute @ 14,0000 g9) Remove top aqueous layer (protein is between layers)10) Add 400 ul methanol11) Vortex12) Spin 2 minutes @ 14,000 g13) Remove as much MeOH as possible without disturbing pellet14) Speed-Vac to dryness15) Bring up in 2X sample buffer for PAGEReference: Wessel, D. and Flugge, U. I. Anal. Biochem. (1984) 138, 141-143蛋白质浓缩——方法很全1130徐炉李2011-05-28 14:35楼主蛋白质浓缩——方法很全 - 丁香园论坛-医学/药学/生命科学论坛蛋白质浓缩方法总结一个简便的方法你可以试试：找一透析袋，底部扎紧，袋口扎一去底的塑料或玻璃试管，将待浓缩的液体从管口灌入透析袋中，将整个装置挂在冰箱中，或者用电风扇吹，液体干后可再继续加入，直至样品浓缩至所需体积。

沉淀蛋白质的通用方法(TCA,乙醇,丙酮沉淀蛋白操作技巧步骤)

沉淀蛋白质的常用方法（TCA、乙醇、丙酮沉淀蛋白操作步骤）TCA-DOCFor precipitation of very low protein concentration1) To one volume of protein solution, add 1/100 vol. of 2% DOC (Na deoxycholate, detergent).2) Vortex and let sit for 30min at 4oC.3) Add 1/10 of Trichloroacetic acid (TCA) 100% vortex and let sit ON at 4oC (preparation of 100% TCA: 454ml H2O/kg TCA. Maintain in dark bottleat 4oC.Be careful, use gloves).4) Spin 15min 4oC in microfuge at maximum speed (15000g). Carefully discharge supernatant and retain the pellet: dry tube by inversion on tissue paper (pellet may be difficult to see). [OPTION: Wash pellet twice with one volume of cold acetone (acetone keep at –20oC). Vortex and repellet samples 5min at full speed between washes].5) Dry samples under vaccum (speed vac) or dry air. For PAGE-SDS, resuspend samples in a minimal volume of sample buffer. (The presence of some TCA can give a yellow colour as a consequence of theacidification of the sample buffer ; titrate with 1N NaOH or 1M TrisHCl pH8.5 to obtain the normal blue sample buffer colour.)Normal TCATo eliminate TCA soluble interferences and protein concentration1) To a sample of protein solution add Trichloroacetic acid (TCA) 100% to get 13% final concentration. Mix and keep 5min –20oC and then 15min 4oC; or longer time at 4oC without the –20oC step for lower protein concentration. Suggestion: leave ON if the protein concentration is very low.(preparation of 100% TCA: 454ml H2O/kg TCA. Maintain in dark bottleat 4oC.Be careful, use gloves).2) Spin 15min 4oC in microfuge at maximum speed (15000g). Carefully discharge supernatant and retain the pellet: dry tube by inversion on tissue paper (pellet may be difficult to see).3) For PAGE-SDS, resuspend samples in a minimal volume of sample buffer. (The presence of some TCA can give a yellow colour as a consequence of the acidification of the sample buffer ; titrate with 1NNaOH or 1M TrisHCl pH8.5 to obtain the normal blue sample buffer colour.)Acetone PrecipitationTo eliminate acetone soluble interferences and protein concentration 1) Add to 1 volume of protein solution 4 volumes of cold acetone. Mix and keep at least 20min –20oC. (Suggestion: leave ON if the protein concentration is very low).2) Spin 15min 4oC in microfuge at maximum speed (15000g). Carefully discharge supernatant and retain the pellet: dry tube by inversion on tissue paper (pellet may be difficult to see).3) Dry samples under vaccum (speed-vac) or dry air to eliminate any acetone residue (smell tubes). For PAGE-SDS, resuspend samples in a minimal volume of sample buffer.Ethanol PrecipitationUseful method to concentrate proteins and removal of Guanidine Hydrochloride before PAGE-SDS1) Add to 1 volume of protein solution 9 volumes of cold Ethanol 100%. Mix and keep at least 10min.at –20oC. (Suggestion: leave ON).2) Spin 15min 4oC in microcentrifuge at maximum speed (15000g). Carefully discharge supernatant and retain the pellet: dry tube by inversion on tissue paper (pellet may be difficult to see).3) Wash pellet with 90% cold ethanol (keep at –20oC). Vortex and repellet samples 5min at full speed.4) Dry samples under vaccum (speed vac) or dry air to eliminate any ethanol residue (smell tubes). For PAGE-SDS, resuspend samples in a minimal volume of sample buffer.TCA-DOC/AcetoneUseful method to concentrate proteins and remove acetone and TCA soluble interferences1. To one volume of protein solution add 2% Na deoxycholate (DOC) to 0.02% final (for 100 μl sample, add 1 μl 2% DOC).2. Mix and keep at room temperature for at least 15 min.3. 100% trichloroacetic acid (TCA) to get 10% final concentration(preparation of 100% TCA: 454ml H2O/kg TCA. Maintain in dark bottleat 4oC.Be careful, use gloves).4. Mix and keep at room temperature for at least 1 hour.5. Spin at 4oC for 10 min, remove supernatant and retain the pellet. Dry tube by inversion on tissue paper.6. Add 200 μl of ice cold acetone to TCA pellet.7. Mix and keep on ice for at least 15 min.8. Spin at 4oC for 10 min in microcentrifuge at maximum speed.9. Remove supernatant as before (5), dry air pellet to eliminate any acetone residue (smell tubes). For PAGE-SDS, resuspend samples in a minimal volume of sample buffer.10. (The presence of some TCA can give a yellow colour as a consequence of the acidification of the sample buffer ; titrate with 1N NaOH or 1M TrisHCl pH8.5 to obtain the normal blue sample buffer colour.)Acidified Acetone/MethanolUseful method to remove acetone and methanol soluble interferences like SDS before IEF1) Prepare acidified acetone: 120ml acetone + 10μl HCl (1mM final concentration).2) Prepare precipitation reagent: Mix equal volumes of acidified acetone and methanol and keep at -20oC.3) To one volume of protein solution add 4 volumes of cold precipitation reagent. Mix and keep ON at -20oC.4) Spin 15min 4oC in microfuge at maximum speed (15000g). Carefully discharge supernatant and retain the pellet: dry tube by inversion on tissue paper (pellet may be difficult to see).5) Dry samples under vaccum (speed-vac) or dry air to eliminate any acetone or methanol residue (smell tubes).TCA-Ethanol PrecipitationUseful method to concentrate proteins and removal of Guanidine Hydrochloride before PAGE-SDS1) Dilute 10-25μl samples to 100μl with H2OAdd 100μl of 20% trichloroacetic acid (TCA) and mix (preparation of 100% TCA: 454ml H2O/kg TCA. Maintain in dark bottleat 4oC.Be careful, use gloves).2) Leave in ice for 20min. Spin at 4oC for 15 min in microcentrifuge at maximum speed.3) Carefully discharge supernatant and retain the pellet: dry tube by inversion on tissue (pellet may be difficult to see).4) Wash pellet with 100μl ice-cold ethanol, dry and resuspend in sample buffer.5) In case there are traces of GuHCl present, samples should be loaded immediately after boiling for 7 min at 95°C6) (The presence of some TCA can give a yellow colour as a consequence of the acidification of the sample buffer ; titrate with 1N NaOH or 1M TrisHCl pH8.5 to obtain the normal blue sample buffer colour.)PAGE prep TM Protein Clean-up and Enrichment Kit - PIERCEThe PAGEprep? Kit enables removal of many chemicals that interfere with SDS-PAGE analysis: guanidine, ammonium sulfate, other common salts, acids and bases, detergents, dyes, DNA, RNA, and lipids.PIERCE: #26800 - PAGE prep TM Protein Clean-up and EnrichmentKit (pdf)Chloroform Methanol PrecipitationUseful method for Removal of salt and detergents1) To sample of starting volume 100 ul2) Add 400 ul methanol3) Vortex well4) Add 100 ul chloroform5) Vortex6) Add 300 ul H2O7) Vortex8) Spin 1 minute @ 14,0000 g9) Remove top aqueous layer (protein is between layers)10) Add 400 ul methanol11) Vortex12) Spin 2 minutes @ 14,000 g13) Remove as much MeOH as possible without disturbing pellet14) Speed-Vac to dryness15) Bring up in 2X sample buffer for PAGEReference: Wessel, D. and Flugge, U. I. Anal. Biochem. (1984) 138, 141-143蛋白质浓缩——方法很全1130徐炉李2011-05-28 14:35楼主蛋白质浓缩——方法很全- 丁香园论坛-医学/药学/生命科学论坛蛋白质浓缩方法总结一个简便的方法你可以试试：找一透析袋，底部扎紧，袋口扎一去底的塑料或玻璃试管，将待浓缩的液体从管口灌入透析袋中，将整个装置挂在冰箱中，或者用电风扇吹，液体干后可再继续加入，直至样品浓缩至所需体积。

TCA-丙酮沉淀法浓缩蛋白

TCA-丙酮沉淀法浓缩蛋白TCA-丙酮蛋白浓缩TCA protein precipitation protocolStock Solutions: 100% (w/v) Trichloroacetic acid (TCA)recipe: dissolve 500g TCA (as shipped) into 350 ml dH2O, store at RT.Precipitation Protocol:1. Add 1 volume of TCA stock to 4 volumes of protein sample.i.e. in 1.5ml tube with maximum vol., add 250μl TCA to 1.0ml sample.2. Incubate 10 min at 4°C.3. Spin tube in microcentrifuge at 14K rpm, 5 min.4. Remove supernatant, leaving protein pellet intact. Pellet should be formed from whitish,fluffy ppt.5. Wash pellet with 200μl cold acetone.6. Spin tune in microfuge at 14K rpm, 5min.7. Repeat steps 4-6 for a total of 2 acetone washes.8. Dry pellet by placing tube in 95°C he at block for 5-10 min to drive off acetone.9. For SDS-PAGE, add 2X or 4X sample buffer (with or without bME) and boil smaple for10 min in 95°C herat block before loading smaple onto polyacrylamide gel.TCA蛋白浓缩步骤：储存液：100%（W/V）三氯乙酸（TCA）配制：将500g TCA溶解到350ml dH2O中，室温储存。

蛋白质提取方法比较

蛋白质定量
1.采用Bradford方法测定蛋白质的含量。 2.将待测蛋白的OD值，与标准蛋白绘制的标准曲线比对，根据标准曲线查得待分析蛋白提取液中蛋白质的浓度。
电泳析
1.取少量琼脂糖封胶液封底； 2.随后加入聚丙烯酰胺凝胶( 分离胶),插入梳子，继续添加浓缩胶,待胶体凝固后拔出梳子； 3.每一点样孔中点样； 4.以冰醋酸溶液作为电解液，电泳仪设定为恒流25 mA，电泳100 min 左右。
1.参照苏源等人的方法提取总蛋白。 2.分别取处理和对照植物各2 g 利用液氮，研磨，将其悬浮于TCA/丙酮溶液, -20℃过夜沉淀。 3.次日混均匀后,15 000 r/min、4℃离心20 min, 弃上清重复上述操作,直至试管中无绿色为止。 4.在-20℃静置15min, 15000 r/min、4℃条件下离 15min弃上清液，将试管中的沉淀用手指弹出离心管，以便丙酮挥发，在自然条件下吹干成粉末即得到粗蛋白。
（二）. Tris-HCl 缓冲液
1.参照谷瑞升等人的方法。 2.选取新鲜植物0.3 g。 3.加入少许石英砂和0聚乙烯吡咯烷酮(PVPP)置于预冷的研钵中，用液氮迅速将其研磨成粉末状，移入离心管中， Tris-HCl缓冲液，涡旋混匀提取。 4.12 000 r/pm、4℃离心15 min，去除组织及细胞碎片。 5.取上清，作为粗样品-70℃保存备用。
胶体染色
1.凝胶染色采用胶体考马斯亮蓝染色法； 2.首先将凝胶至于蒸馏水中漂洗三次，每次不得超过1秒，然后至于固定液（40%甲醇，10%冰乙酸）中染色30min； 3.然后至于胶体考马斯亮蓝染色液（0.12% 考马斯亮蓝 G-250， 10% 硫酸铵，10%磷酸，20%甲醇）中染色； 4.过夜，期间要将凝胶及其染色液放在摇床上轻轻摇荡； 5.第二日用蒸馏水清洗到蛋白质点清晰可见为止，记录并照相留底。

蛋白浓度的方法

蛋白浓缩的方法
（因为百度文库下载要积分，所以把自己在生物论坛写的帖子上传换点积分）
常规方法有：丙酮沉淀法，TCA沉淀法，还有浓缩柱浓缩法，柱浓缩法用到浓缩柱，可能有点小贵，但是效果很好。

下面介绍下具体过程：
丙酮沉淀法，TCA沉淀法见《蛋白技术手册》P60，提供一个直接有的群共享：HelixNet4群毕赤酵母 53074791 在群共享里有，
在此不写了。

浓缩柱浓缩+TCA法【本人原创、供大家参考】
1、取诱导表达菌液1ml
2、离心取上清400ul加到浓缩柱中，离心至剩余约100ul
3、将100ul剩余液体加入10ulTCA【过程参考《蛋白技术手册》P60，本人做了一些改进】
4、冰上放置20-30min
5、离心，弃上清，洗涤后，37度烘干
6、加入10ulPBS溶解，再加10ulbuffer，沸水5min
7、上样，其余都一样。

补充：浓缩柱：Ultracel YM-10 1包￥450。

【我的蛋白大概20KD，所以选用了10KD的柱子】
部分问题汇总：
Q: 我就用TCA 浓缩的，浓缩50倍也没有看见条带，准备放弃了
A：有的时候不见得是没有表达，有可能是表达量低检测不到
Q: 柱浓缩在哪个公司买的，之前用透析袋浓缩过，效果都不好
A: Ultracel YM-10 1包￥450 分子公用
Q: Ultracel YM-10、YM-30 配合用来超滤上清获得20KD是不是更好啊？
A:建议用分子量小的，比如分子量20KD，有可能有糖基化，或者几聚体什么的超过30KD
Q：我的蛋白17KD可以用多大的
A:10KD甚至更小。

真菌蛋白提取方法

真菌蛋白提取方法一TCA/丙酮法1 液氮将菌体研磨为粉末；2 向匀浆中加入10倍体积的丙酮（含13.3% (w/v) TCA和0.093% β巯基乙醇），过夜沉降；3 4 度20,000g 离心15 min；4 移处上清，用冰冷的含0.07% (v/v) β－巯基乙醇的丙酮清洗沉淀两次；5 离心后，沉淀干燥至丙酮挥发完全。

二酚抽提法1 在液氮中将 1g 菌体研磨为粉末2 加入 6 ml 水饱和酚（buffer-saturated phenol）和 2 ml提取液（20mMTris-Cl, pH 7.5, 0.5% Triton X-100 (v/v), 0.5M EDTA, pH 7.5, pH 8.0,0.07% β－巯基乙醇, protease inhibitors）。

3 在4度混合30分钟。

4 12000 rmp 离心1min，使两相分开。

5 弃沉淀，吸取上层的苯酚相，加入5倍体积的冷丙酮，-20度沉降2h。

6 12000 rmp，4度，离心15分钟沉淀蛋白，弃去上清。

7 沉淀干燥至丙酮挥发完全。

三提取液抽提丙酮沉淀法1 预先将研钵置于－20℃的冰箱内冷冻。

2 取液氮冻存的菌体，放入预冷的研钵内研磨至粉末状。

3 向匀浆中加入2倍体积的抽提液（20mM Tris-Cl, pH 7.5, 0.5% Triton X-100(v/v), 0.5M EDTA, pH 7.5, pH 8.0, 0.07% β－巯基乙醇, protease inhibitors）。

4 混匀后4度震荡30分钟，以便蛋白溶解。

5 12000 rmp，4度，离心15分钟，吸取上清于另一EP管中。

7 向上清液中加入5倍体积的预冷丙酮（含有0.07％β－巯基乙醇），混匀，－20℃，2小时沉淀蛋白质。

8 12000 rmp，4度，离心15分钟沉淀蛋白。

弃去上清，沉淀用乙醇洗三次，自然干燥蛋白沉淀。

四甲醇氯仿水沉淀法Chloroform /Methanol/Water Precipitation1 预先将研钵置于－20℃的冰箱内冷冻。