番茄愈伤组织培养课程设计

细胞工程课程设计番茄愈伤组织培养

学校：天津农学院

系别：食品科学系

专业：生物工程二班

姓名: 张倩

学号：1009034227

番茄愈伤组织培养

摘要：

番茄(tomato) 为茄科,一年生或多年生草本植物。是我们的大众食品，营养丰富。近年来最求无毒无公害蔬果成为一种健康的风向标。而番茄的在市场上的需求量越来越大，所以我们设计利用组织培养的基础知识，对番茄进行外植体的组织培养，以达到掌握外植体灭菌的基本方法以及无菌操作技术。本实验采用先对番茄种子进行培育，再利用培养的幼苗选取外植体进行愈伤组织培养，以诱发愈伤组织的生长为最终目的。

关键词：

愈伤组织；种子；外植体。

实验原理：

植物组织培养是指在无菌条件下，对离体植物组织（器官或细胞）分离并在培养基中培养，使其能够继续生长，甚至分化发育成一完整的植株的一门实验技术。组织培养的理论依据是植物细胞的全能性，即植物体的每个细胞携带着一套完整的基因组，因此具有发育成完整植株的潜在能力。植物组织当中原本已经分化的细胞，一旦脱离原有的机体环境，成为离体状态，在适宜的营养和外界条件下，就会表现出全能性，从已经分化定型的细胞，脱分化，成为恢复分裂能力的细胞，并能重新生长发育成完整的植株。

愈伤组织是指一个离体的细胞、一块组织或一个器官的细胞，通过脱分化不断分裂、增生子细胞，这些细胞胞分裂快，结构疏松，颜色浅而透明，逐渐形成了无序结构的一团细胞。在植物组织培养中，无菌培养是关键，所以我们为了减少被污染的几率，我们组选择了先用番茄种子培养生成完整的幼苗，然后再以幼苗为外植体，在无菌操作的条件下接种外植体进行第二次培养。

材料的准备：

1、前期器材准备：

烧杯（100ml 3个，用于放初步处理后的外植体；1L 1个，用作废液缸；250ml 3个，包好牛皮纸后灭菌，分别装酒精、升汞和无菌水）、电子天平、称量纸（若干）、钥匙（若干）、玻璃棒（一根）、量筒（100ml和10ml各1个），胶头滴管（1个）、陶瓷烧杯（1L 1个）、电炉（配有石棉网）、酸性ph试纸、锥形瓶（250ml 4个，用于配置专属培养基；500ml 2个，装无菌水；100ml 40个，用于接种）、皮筋（或棉绳，若干）、牛皮纸（40+2+2，按锥形瓶口和烧杯口大小裁好）、记号笔（或标签纸）、培养皿（10套）、铁质饭盒内装操作工具（手术刀柄2个、手术剪1个、长形镊子2个，小型镊子2个）、吸水纸（若干）、脱脂棉、滤纸（若干）、高压灭菌锅、超净工作台、保鲜膜、酒精灯、打火机、手术刀片（2片）、人工气候箱

2、前期药品配置：

75% 酒精、1mol/L HCl、1mol/L NaOH、大量元素母液、微量元素母液、有机物母液、铁盐母液、无菌水、0.1%HgCl2、乙醇、蔗糖、琼脂、6-BA、NAA

3、实验材料：番茄茎叶

实验步骤：

1、各种实验器材的准备及清洗

2、各种母液的配置：

表1、培养基的各种元素成分

类型成分培养基中配置母液母液体积配1L培养基扩大倍数

工作液称取量g ml 吸取量/ml

浓度mg/L

大量元素NH4NO3 1650 16500

KNO3 1900 19000

CaCl2·2H2O 440 4400 1000 100 100

MgSO4·7H2O 370 3700

KH2PO4 170 1700

微量元素KI 0.83 83

H3BO3 6.2 620

MnSO4·4H2O 22.3 2230

ZnSO4·7H2O 8.6 860 1000 10 100

Na2MoO4·2H2O 0.25 25

CuSO4·5H2O 0.025 2.5

CoCl2·6H2O 0.025 2.5

铁盐FeSO4·7H2O 27.8 2780 1000 10 100 Na2-EDTA 37.3 3730

有机物质肌醇100 5000

烟酸0.5 25

盐酸吡哆素0.5 25 500 10 50

盐酸硫胺素0.4 20

甘氨酸 2.0 100

3、MS培养基的配置：

取容量为1L的搪瓷杯，先加入600ml的蒸馏水，放在电炉上进行加热，后依次加入100ml 大量元素母液、10ml微量元素母液、5ml铁盐母液、10ml有机物母液、30g蔗糖和9g琼脂粉。

注意：

1）要在前种物质全部溶解后才能加入后种物质。

2）加热过程中要不停地搅拌。

当半成品的溶液沸腾时立即从电炉上取下搪瓷杯，放在实验桌上，用玻璃棒沾取少量的液体滴在酸性ph试纸上，用0.1mol/L的NaOH或0.1mol/L的HCl调整液体的pH至5.6—5.8，最后在搪瓷杯中用蒸馏水定容至1L。

4、培养基的分装：

将1L的MS培养基分装到4个250ml的锥形瓶中，分别配成6个组的专属培养基，并各自倒入10个25ml的小锥形瓶中，用2层牛皮纸包好并用皮筋扎好，最后用记号笔做好记号

表2、不同浓度的植物生长调节物质

培养基编号6-BA(mg/L) NAA(mg/L) IBA(mg/L)

1 1.00 0.20 0.00

2 1.00 0.00 0.10

3 2.00 0.20 0.00

4 2.00 0.00 0.30

5 3.00 0.50 0.00

6 3.00 0.00 0.50

5、灭菌：

1）培养基及器具灭菌：

培养基、无菌水需要在高压灭菌锅中灭菌。灭菌作用取决于温度，常用的灭菌

温度为121℃，时间为30min，灭菌结束后待温度下降到50℃以下，才能取出

已灭菌的培养基。可用同样方法对器具同时进行灭菌，包括：培养皿、解剖刀、

剪子、滤纸、镊子等。

2）工作环境灭菌：

接种前1ｈ打开超净工作台和棚面的紫外灯照射40min。杀菌结束后，先关掉

棚面的紫外灯，再打开风机，最后关掉超净工作台上的紫外灯。在接种后休息

时，要先打开台面的紫外灯，再关风机，最后打开棚面紫外灯。不能将风机与

台面上的紫外灯同时关闭或先关闭风机再开紫外灯。

6、材料预处理：

（1）、种子处理：自来水冲洗种子20min；0.1%氯化汞的浸泡5~10min，依照种皮硬

度而定，所以番茄种子我们只消毒5min；然后用无菌水冲洗4次；进行胚培养。

7、接种：

1）将所需物品放入超净工作台：

三种实验材料、灭菌好的培养基、无菌水、培养皿、吸水纸、操作工具、空烧

杯、75%酒精、0.1%升汞溶液、废液缸、刀片、酒精灯、打火机2）进入接种室前，需要洗净手和手腕。进入超净工作台内需用75%酒精纱布擦拭手、手腕，再擦培养基瓶和超净工作台。

3）剪、镊消毒：

接种前剪、镊应插入75%酒精瓶中，取出后置于酒精灯外焰上彻底灼烧，灼烧

时应将剪口、镊口张开，烧至剪、镊上火焰熄灭为止，冷却后方可进行接种。

接种后仍需灼烧并插回75%酒精的磨口瓶待用。注意每次取出时剪口并拢，不

可接触磨口瓶和其它器皿，并保持尖端向下。

4）种子接种：将处理好的种子无菌操作放进准备好的果酱瓶培养基中，一般放2~3颗。

5）外植体的接种：无菌工作台上，挑选培养好的植物种子（一般是长出两片子叶即可），小心用剪刀剪去外植体，移植到新的培养基中（表2中的各类培养基）。

左手拿三角瓶，解开封口膜，将三角瓶几乎水平拿着，靠近酒精灯焰，将瓶口外部在酒精灯火焰上燎数秒钟，使瓶口的水气散发掉。用右手拇指、食指、中指拿消毒过的镊子夹一块外植体（种子）送入瓶内轻轻的插入培养基上，镊子灼烧后放回磨口瓶，再把封口膜在酒精灯火焰上燎数秒，灼燎时应旋转，避免烧坏，盖好封口膜，扎紧皮筋，便完成了第一瓶的操作，接着再做第二瓶，如此直到外植体全部接完。

6）后期工作：

将接种好的锥形瓶放到培养室内，用保鲜膜包好后用皮筋扎好，再用记号笔注明接

种的日期，最好按一定的顺序排好。将超净台整理干净，废物废液倒到相应地方，

各类实验器具清洗干净后摆放到指定地方。

7）注意事项：

①操作人员的头、胳膊等不得进入台内

②操作人员不得随意谈话、说笑，以免造成污染

③用酒精对双手消毒时，务必待酒精彻底挥发后再靠近酒精灯火焰，以免火焰伤

④台外人员走动要轻、动作要小

8、培养：

培养室的温度应控制在25~28℃，每日光照时间为10~12h，光照强度为1600~2000lx。

此外还要定期观察是否出现污染。

9、结果的观察及记录：

在接种后的一周、两周和三周，分别观察各锥形瓶内愈伤组织的形成情况和污染情况，做好记录工作。在三次记录工作完成之后对结果进行分析，计算出诱导率和污染率，并做相应的实验结果分析。

诱导率（%）=形成愈伤组织数/总接种数×100

污染率（%）=污染数/总接种数×100

（3）、种子培养的萌发率与污染率

表3、种子培养的萌发率与污染率的统计

消毒方法萌发率% 污染率

第5天第10天第12天第15天

0.1%氯化汞18.3 88.6 100 100 0

(4)番茄的愈伤组织的萌发率与污染率

表4、番茄外植体培养的萌发率与污染率的统计

消毒方法萌发率% 污染率

第5天第10天第12天第15天

无12.1 43.3 55.2 55.2 44.8

（5）结果与分析

我们是利用了番茄种子先培育成幼苗，再选取外植体移植到新的培养基中培育。这样可以较大程度的减少污染率。如表3显示种子的污染率为0，萌发率也为100%，这个结果我们很满意。但是在番茄幼苗选取外植体移植后，其污染率也达到了44.8%。

组员们觉得原因可能是我们移植外植体的时候并没有进行消毒，但我觉得这个并不是主要原因，因为幼苗在原先的培养基中并没有显示有污染迹象，所以幼苗应该没有携带其它的微生物。而我觉得主要是我们使用的无菌室无菌工作台并不是绝对无菌，只是相对外界来说比较少而已，所以在操作过程中会受到二次污染，这应该是导致番茄外植体培养的污染率几乎达到一般的主要原因。

另外，有一部分愈伤组织出现玻璃化的情况，原因可能是培养基问题，和光照温度问题。培养基配备的时候不是很精密，造成C a+与M n+离子有所改变。而我们的培养室中几乎一天24小时都是开光照，控制不恰当。加上室内的温度不能适度调节，温度升高。以上原因造成了许多没有被污染的愈伤组织玻璃化。

实验总结

本次实验首先第一感觉是很难，因为教学与实验之间相隔一个很大的空白期，所以实验的时候并没有很好的运用理论课的只是，而是盲目的跟随他人的操作，导致污染率其高。有些组的外植体完全被污染了，所以实验失败。

我们实验也是失败过一次，刚开始的时候我们并不是用培育番茄种子的方式做实验，而是直接采摘番茄外植体培育。这样有两个缺点：1、自然环境中采集的番茄外植体，含有的皱褶多，易藏菌难消毒，所以会导致外植体的培育的污染率奇高；2、对于番茄的外植体消毒不熟悉，时间控制不好易造成外植体细胞的严重损害，最终导致实验的失败。幸运的是在第一次失败后我们吸取教训，并寻找其它路径，利用种子易消毒和不易污染的优势先培育种子，再利用没污染的幼苗去二次培植。这样就大大的减少被污染的可能。

【参考文献】

[1]雷0柱，胡0荣生物工程下游技术实验手册北京.科学出版社

［2］薛殿恩．浅谈无公害番茄的栽培技术［J］．农村经济与科技

［3］陆云华，张新，马立新．蕃茄叶片再生系统建立的研究［J］．江西农业学报［4］刘庆昌，吴国良．植物细胞组织培养［M］．北京: 中国农业大学出版社［5］潘瑞炽，王小菁，李娘辉．植物生理学［M］．北京: 高等教育出版社