最新专题5-课题3-血红蛋白的提取与分离课件PPT

(三)电泳
1、概念：带电粒子在 电场 的作用下发生迁移的过程。 2、原理：许多重要的生物大分子，如多肽、核酸 等 都具有 可解离的基团 ， 在 一定的PH 下，这些 基团会带上正电或负电 。在电场的作用下，这些带 电分子会向着与其 所带电荷相反的电极移动。电泳利 用了待分离样品中各种分子 带电性质的差异 以及分 子本身 大小 、 形状 的不同使带电分子产生不同 的 迁移速度 ，从而实现样品中各种分子的分离。
2、血液有哪些成分？
血浆
血
液
白细胞
血细胞 血小板
红细胞 （最多）
血红蛋白 （90％）
（一）样品处理
1、红细胞的洗涤
（1）洗涤的目的： 除去杂蛋白（血浆蛋白） （2）洗涤方法：
生理盐水
（3）洗涤干净的标志：上清液不再呈现黄色。
（一）样品处理
1、红细胞的洗涤 2、血红蛋白的释放 3、分在离蒸血馏红水蛋和白甲溶苯液的作用下，红细胞破裂， （释1）放方出法血：红离蛋心白。
实验操作
（一）蛋白质提取和分离步骤
样品处理→粗分离→纯化→纯度鉴定
（二）操作过程
1.样品处理：
可选用猪、牛、羊或其他脊椎动物的血 液来分离血红蛋白。
1、人们用鸡的红细胞提取DNA，用猪、牛、羊 的红细胞提取血红蛋白的原因是什么？
鸡的红细胞具有细胞核，含有DNA，便于进行DNA的提取； 猪牛羊（哺乳动物）成熟的红细胞无细胞核，血红蛋白含 量丰富便于提取血红蛋白。
（2）离心分层后，各层的成分
（3）滤纸过滤，除去 脂溶性沉淀层， 于分液漏斗静置片刻，分出下层的
红色透明液体 。
甲苯层
脂溶性沉淀层
4.透析
（二）粗分离
问：透析过程及透析目的？
取1mL的血红蛋白溶液装入透析袋中，将透析袋放 入盛有300mL的物质的量浓度为20mmol/L的磷酸 缓冲液中（pH为7.0），透析12h。
透析目的是：除去样品中分子量较小的杂质。
说明：透析袋是一种半透膜，能使小分子自由 进出，而大分子不能通过。
实验操作
4.透析
（二）粗分离
实验操作
（二）凝胶色谱操作
阅读课本P67-69，了解凝胶色谱的操作过程。
1、凝胶色谱柱的制作 2、凝胶色谱柱的装填 3、样品的加入和洗脱
源自文库
2.实验操作
(1)样品处理：通过红细胞的洗涤、 搅拌 、 离心 等
4.凝胶色谱法分离蛋白质的原理和具体过程
凝胶色谱法分离蛋白质过程的动画演示
（二）缓冲溶液
1、缓冲物质有哪些？ 2、缓冲溶液的作用是什么？ 3、怎样配制缓冲溶液？
基础知识
（二）缓冲溶液
1、缓冲溶液概念
在一定的范围内，能对抗外来少量强酸、强碱或稍加稀 释不引起溶液PH发生明显变化的作用叫做缓冲作用，具 有缓冲作用的溶液叫做缓冲溶液。
专题5-课题3-血红蛋白的提取 与分离
本课题学习目标
体验从复杂体系中提取生物大分子的基本过程和方法，并了 解色谱法、电泳法等分离生物大分子的基本原理。
1、主要概念：①凝胶色谱法 ②电泳法 ③缓冲溶液 ④ 它们在血红蛋白的提取中分别起到什么作用。
2、主要原理：①凝胶色谱法分离蛋白质的原理
②电泳法分离样品的原理
2、缓冲溶液作用
能够抵制外界的酸或碱的对溶液的PH值的影响，维 持PH基本不变。
3、缓冲溶液配制
通常由1－2种缓冲剂溶解于水中配制而成。调节 缓冲剂的使用比例就可以制得在不同PH范围内使 用的缓冲液。
思考：说出人体血液中缓冲液。
NaH2PO4 / Na2HPO4
H2CO3 / NaHCO3
在血红蛋白整个实验室中用的缓冲 液是磷酸缓冲液，目的是利用缓冲液模 拟细胞内的PH环境，保证血红蛋白的正 常结构和功能，便于观察（红色）和材 料的科学研究（活性）
操作收集到血红蛋白溶液。
相对分
(2)粗分离：通过透析去除血红蛋白溶液中的子质量 较
小的杂质。
(3)纯化：通过 凝胶色谱法 分离相对分子质量不同的
蛋白质。
(4)纯度鉴定：用 SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳 进行
样品纯度鉴定。
DNA粗提取与血红蛋白提取的比较
提取 物质
DNA
血红蛋白
提取 方法
盐析法
①DNA在不同浓度的NaCl溶 提取 液中溶解度不同 原理 ②DNA不溶于酒精，但某些
蛋白质则溶于酒精
凝胶色谱法、电泳 法
①根据相对分子质 量的大小 ②各种分子带电性 质差异
①溶解在2 mol/L的NaCl溶
液中
步骤
②加水稀释至0.14 mol/L NaCl溶液使DNA析出过滤
③2mol/L NaCl溶解
4、基本组成单位： 氨基酸
H
结构通式：
种类：
RC
5、氨基酸连接方式
脱水缩合
NH2
COOH
（一） 凝胶色谱法
1、别名：分配色谱法 是根据 相对分子质量的大小，利用具有网状结构的凝
胶的分子筛作用分离蛋白质的有效方法。
2、依据的特性: 蛋白质相对分子质量的大小
3、凝胶 ①性质：一些微小的 多孔球体 ，球内含许多贯穿的通道； ②化学本质：多糖类化合物 ③实例：葡聚糖、琼脂糖
③缓冲溶液的组成和作用机理
3、课题重点：凝胶色谱法的原理和方法 4、课题难点：
①样品的处理 ②色谱柱填料的处理和色谱柱的装填。
知识回顾--------有关蛋白质的几个问题： 1、含量
占细胞干重的50％以上，细胞中含量最多的有机物
2、组成元素 C、H、O、N (大多数含S) 3、相对分子质量 高分子化合物
3、分类：琼脂糖凝胶电泳和聚丙稀酰胺凝胶电泳。 测定蛋白质相对分子质量通常用十二烷基硫酸钠 （SDS）—聚丙稀酰胺凝胶电泳
琼脂糖凝胶电泳示意图
在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带 电荷相反的电极移动
电泳检测结果
琼脂糖凝胶电泳
实验操作
阅读课本66页-67页相关内容，思考以下问题： 1、蛋白质的提取和分离一般分成几步？ 2、洗涤红细胞的目的是什么？怎样洗涤？洗涤干净的 标志是什么？ 3、采用什么方法分离血红蛋白？离心分层后，各层的 成分各是什么？用滤纸过滤，去掉什么成分？ 4、透析目的？
（一） 凝胶色谱法
原理： 当不同的蛋白质通过凝胶
时，相对分子质量 较小 的蛋白质 容易进入凝胶内部的通道，路程较 长，移动速度较慢，而相对分子质 量 较大 的蛋白质无法进入凝胶 内部的通道，只能在 凝胶外部 移 动，路程较短，移动速度较快，相 对分子质量不同的蛋白质因此得以 分离。
分离出 相对分子质量较大 的蛋白质。