最新专题5-课题3-血红蛋白的提取与分离课件PPT
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血红蛋白的提取和分离PPT课件
血红蛋白的提取和分泳法
1、蛋白质特性的差异
(1)分子的形状和大小；
(2)所带电荷的性质和多少；
(3)溶解度；
(4)吸附性质；
(5)对其他分子的亲和力。
2、分离蛋白质的方法 (1)凝胶色谱法 ①概念：也称做分配色谱法，是根据相对分子质量的大 小分离蛋白质的有效方法。 ②凝胶：微小的多孔球体，大多数是由多糖类化合物构 成，内含许多贯穿通道,如葡聚糖或琼脂糖。
③电泳常用方法 a.琼脂糖凝胶电泳：由于琼脂糖本身不带电荷，各种分子 在电场中的迁移速率因各种分子带电性质的差异、分子大 小和形状的不同而不同，从而得以分离。 b.聚丙烯酰胺凝胶电泳 加入SDS作用：掩盖不同种蛋白质间的电荷差别，使电泳 迁移率完全取决于分子的大小。（原理：SDS使蛋白质发 生完全变性，解聚成单条肽链，并与其结合形成蛋白质— SDS复合物，SDS所带负电荷的量大大超过了蛋白质原有的 电荷量。测定的结果只是单条肽链的分子量）
以哺乳动物红细胞为材料，血红蛋白质的提取和分 离一般分为四步：样品处理、粗分离、纯化和纯度鉴定。
（一)样品处理及粗分离 1、红细胞的洗涤 (1)目的:去除杂蛋白； (2)过程：
(3)实验注意事项：为防止血液凝固，加入抗凝血剂柠檬 酸钠。生理盐水洗涤防止红细胞吸水涨破。低速短时 离心。如果离心速度过高和时间过高会使白细胞和淋巴细 胞一同沉淀，达不到分离的效果。④洗涤次数过少，无法 去除血浆蛋白,分层不明显⑤上清无黄色，表明细胞已洗净。
3、缓冲溶液 ①概念：在一定范围内，能够抵制外界的酸、碱对PH的 影响，维持pH基本不变的溶液。 ②缓冲溶液的配制 1～2种缓冲剂 调节使用比例控制pH范围
二、血红蛋白的提取和分离 血红蛋白由四条肽链组成，包括两条α-肽链和两条
1、蛋白质特性的差异
(1)分子的形状和大小；
(2)所带电荷的性质和多少；
(3)溶解度；
(4)吸附性质；
(5)对其他分子的亲和力。
2、分离蛋白质的方法 (1)凝胶色谱法 ①概念：也称做分配色谱法，是根据相对分子质量的大 小分离蛋白质的有效方法。 ②凝胶：微小的多孔球体，大多数是由多糖类化合物构 成，内含许多贯穿通道,如葡聚糖或琼脂糖。
③电泳常用方法 a.琼脂糖凝胶电泳：由于琼脂糖本身不带电荷，各种分子 在电场中的迁移速率因各种分子带电性质的差异、分子大 小和形状的不同而不同，从而得以分离。 b.聚丙烯酰胺凝胶电泳 加入SDS作用：掩盖不同种蛋白质间的电荷差别，使电泳 迁移率完全取决于分子的大小。（原理：SDS使蛋白质发 生完全变性，解聚成单条肽链，并与其结合形成蛋白质— SDS复合物，SDS所带负电荷的量大大超过了蛋白质原有的 电荷量。测定的结果只是单条肽链的分子量）
以哺乳动物红细胞为材料，血红蛋白质的提取和分 离一般分为四步：样品处理、粗分离、纯化和纯度鉴定。
（一)样品处理及粗分离 1、红细胞的洗涤 (1)目的:去除杂蛋白； (2)过程：
(3)实验注意事项：为防止血液凝固，加入抗凝血剂柠檬 酸钠。生理盐水洗涤防止红细胞吸水涨破。低速短时 离心。如果离心速度过高和时间过高会使白细胞和淋巴细 胞一同沉淀，达不到分离的效果。④洗涤次数过少，无法 去除血浆蛋白,分层不明显⑤上清无黄色，表明细胞已洗净。
3、缓冲溶液 ①概念：在一定范围内，能够抵制外界的酸、碱对PH的 影响，维持pH基本不变的溶液。 ②缓冲溶液的配制 1～2种缓冲剂 调节使用比例控制pH范围
二、血红蛋白的提取和分离 血红蛋白由四条肽链组成，包括两条α-肽链和两条
专题5：课题3 血红蛋白的提取和分离.ppt
√ √ √
√
√
√ √
(三)电泳
（2）分离方法：
琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳等。
（3）分离过程：
在一定pH下，使蛋白质基团带上正电或负电；
加入带负电荷多的SDS，形成“蛋白质－SDS复 合物”，使蛋白质迁移速率仅取决于分子大小。
电泳检测结果
琼脂糖凝胶电泳
二、实验操作
蛋白质的提取和分离一般分为四步： （1）样品处理：包括洗涤红细胞；血红蛋白 释放；离心分离等操作收集到的血红蛋白溶 液。 （2）粗分离：透析除去分子较小的杂质。 （3）纯化：通过凝胶色谱法将分子量较大的 杂质蛋白质除去。 （4）纯度鉴定：通过聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴 定。
2. 为了加速释放过程，采取了什么措施？ ①目的分析： 使红细胞大量吸水胀裂 ②蒸馏水的作用是______________________________ 。
③加入甲苯的作用是____________________________ 溶解红细胞的细胞膜 。 加速红细胞的破裂 ④充分搅拌的目的是____________________________ 。
多孔性的多糖类化合物，如葡聚糖、琼脂糖。
(一)凝胶色谱法
（3）分离过程
混合物 上 柱 洗 脱 大分子流动快 小分子流动慢
收 集 大分子
收 集 小分子
洗脱：从色谱柱上端不断注入缓冲液， 促使蛋白质分子的差速流动。
(一)凝胶色谱法
㈠
凝胶色谱法（分配色谱法）：
学生活动2:
1、什么是凝胶？ 2、什么是凝胶色谱法？ 3、凝胶色谱法的原理是什么？ 4、请用自己的话总结出凝胶色谱法分离 相对分子质量不同蛋白质的具体过程。
磁力搅拌器
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3.分离血红蛋白
血红蛋白的提取和分离PPT课件
(2)血红蛋白的释放（使用蒸馏水和甲苯）
磁力搅拌器
搅拌器转子
搅拌器正在工作
严格执行突发事件上报制度、校外活 动报批 制度等 相关规 章制度 。做到 及时发 现、制 止、汇 报并处 理各类 违纪行 为或突 发事件 。
(3)分离血红蛋白溶液：
甲苯层（无色透明）； 脂溶性物质沉淀层（白色薄层固体）； 血红蛋白的水溶液层（红色透明液体）； 杂质沉淀层（暗红色）。
2、主要原理：①凝胶色谱法分离蛋白质的原理 ②电 泳法分离样品的原理 ③缓冲溶液的组成和作用机理
3、课题重点：凝胶色谱法的原理和方法
4、课题难点：①样品的预处理 ②色谱柱填料的处理 和色谱柱的装填。
严格执行突发事件上报制度、校外活 动报批 制度等 相关规 章制度 。做到 及时发 现、制 止、汇 报并处 理各类 违纪行 为或突 发事件 。
思考
血液有哪些成分？
水分 血浆
固体物质
血
液
白细胞
血浆蛋白 无机盐 磷脂 葡萄糖等
血细 胞
血小板
红细胞
两个α—肽链
血红蛋白 两个β—肽链
（最多）
四个亚铁红素基团
严格执行突发事件上报制度、校外活 动报批 制度等 相关规 章制度 。做到 及时发 现、制 止、汇 报并处 理各类 违纪行 为或突 发事件 。
二、缓冲溶液
1.概念: 在一定的范围内，凡是能够抵制外加 少量强酸或强碱的影响使原来溶液pH 值基本保持不变的混合溶液。
2.缓冲溶液的组成举例：
H2CO3 —— NaHCO3、CH3COOH —— CH3COONa NaH2PO4 —— Na2HPO4、KH2PO4 —— K2HPO4
3.缓冲溶液的配制
不同物理或化学性质的生物大分子。
磁力搅拌器
搅拌器转子
搅拌器正在工作
严格执行突发事件上报制度、校外活 动报批 制度等 相关规 章制度 。做到 及时发 现、制 止、汇 报并处 理各类 违纪行 为或突 发事件 。
(3)分离血红蛋白溶液：
甲苯层（无色透明）； 脂溶性物质沉淀层（白色薄层固体）； 血红蛋白的水溶液层（红色透明液体）； 杂质沉淀层（暗红色）。
2、主要原理：①凝胶色谱法分离蛋白质的原理 ②电 泳法分离样品的原理 ③缓冲溶液的组成和作用机理
3、课题重点：凝胶色谱法的原理和方法
4、课题难点：①样品的预处理 ②色谱柱填料的处理 和色谱柱的装填。
严格执行突发事件上报制度、校外活 动报批 制度等 相关规 章制度 。做到 及时发 现、制 止、汇 报并处 理各类 违纪行 为或突 发事件 。
思考
血液有哪些成分？
水分 血浆
固体物质
血
液
白细胞
血浆蛋白 无机盐 磷脂 葡萄糖等
血细 胞
血小板
红细胞
两个α—肽链
血红蛋白 两个β—肽链
（最多）
四个亚铁红素基团
严格执行突发事件上报制度、校外活 动报批 制度等 相关规 章制度 。做到 及时发 现、制 止、汇 报并处 理各类 违纪行 为或突 发事件 。
二、缓冲溶液
1.概念: 在一定的范围内，凡是能够抵制外加 少量强酸或强碱的影响使原来溶液pH 值基本保持不变的混合溶液。
2.缓冲溶液的组成举例：
H2CO3 —— NaHCO3、CH3COOH —— CH3COONa NaH2PO4 —— Na2HPO4、KH2PO4 —— K2HPO4
3.缓冲溶液的配制
不同物理或化学性质的生物大分子。
专题5课题3血红蛋白的提取与分离PPT课件
(三)电泳
1、概念：带电粒子在 电场 的作用下发生迁移的过程。 2、原理：许多重要的生物大分子，如多肽、核酸 等 都具有 可解离的基团 ， 在 一定的PH 下，这些 基团会带上正电或负电 。在电场的作用下，这些带 电分子会向着与其 所带电荷相反的电极移动。电泳利 用了待分离样品中各种分子 带电性质的差异 以及分 子本身 大小 、 形状 的不同使带电分子产生不同 的 迁移速度 ，从而实现样品中各种分子的分离。
③缓冲溶液的组成和作用机理
3、课题重点：凝胶色谱法的原理和方法 4、课题难点：
①样品的处理 ②色谱柱填料的处理和色谱柱的装填。
知识回顾--------有关蛋白质的几个问题： 1、含量
占细胞干重的50％以上，细胞中含量最多的有机物
2、组成元素 C、H、O、N (大多数含S) 3、相对分子质量 高分子化合物
实验操作
（一）蛋白质提取和分离步骤
样品处理→粗分离→纯化→纯度鉴定
（二）操作过程
1.样品处理：
可选用猪、牛、羊或其他脊椎动物的血 液来分离血红蛋白。
1、人们用鸡的红细胞提取DNA，用猪、牛、羊 的红细胞提取血红蛋白的原因是什么？
鸡的红细胞具有细胞核，含有DNA，便于进行DNA的提取； 猪牛羊（哺乳动物）成熟的红细胞无细胞核，血红蛋白含 量丰富便于提取血红蛋白。
9 、蛋白质的鉴定方法 10、生理功能
细胞和生物体的结构物质，是一切生命活动的主要承担者。
基础知识
问：依据什么来分离和提取蛋白质 根据蛋白质各种特性的差异，
如分子的形状和大小、所带电荷的性质和多少、溶解度和 吸附的性质和对其他分子的亲和力等等，可以用来分离不 同蛋白质。
基础知识 （一） 凝胶色谱法
3、分类：琼脂糖凝胶电泳和聚丙稀酰胺凝胶电泳。 测定蛋白质相对分子质量通常用十二烷基硫酸钠 （SDS）—聚丙稀酰胺凝胶电泳
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（2）离心分层后，各层的成分
（3）滤纸过滤，除去 脂溶性沉淀层， 于分液漏斗静置片刻，分出下层的
红色透明液体 。
甲苯层
脂溶性沉淀层
4.透析
（二）粗分离
问：透析过程及透析目的？
取1mL的血红蛋白溶液装入透析袋中，将透析袋放 入盛有300mL的物质的量浓度为20mmol/L的磷酸 缓冲液中（pH为7.0），透析12h。
2、血液有哪些成分？
血浆
血
液
白细胞
血细胞 血小板
红细胞 （最多）
血红蛋白 （90％）
（一）样品处理
1、红细胞的洗涤
（1）洗涤的目的： 除去杂蛋白（血浆蛋白） （2）洗涤方法：
生理盐水
（3）洗涤干净的标志：上清液不再呈现黄色。
（一）样品处理
1、红细胞的洗涤 2、血红蛋白的释放 3、分在离蒸血馏红水蛋和白甲溶苯液的作用下，红细胞破裂， （释1）放方出法血：红离蛋心白。
③缓冲溶液的组成和作用机理
3、课题重点：凝胶色谱法的原理和方法 4、课题难点：
①样品的处理 ②色谱柱填料的处理和色谱柱的装填。
知识回顾--------有关蛋白质的几个问题： 1、含量
占细胞干重的50％以上，细胞中含量最多的有机物
2、组成元素 C、H、O、N (大多数含S) 3、相对分子质量 高分子化合物
（一） 凝胶色谱法
原理： 当不同的蛋白质通过凝胶
时，相对分子质量 较小 的蛋白质 容易进入凝胶内部的通道，路程较 长，移动速度较慢，而相对分子质 量 较大 的蛋白质无法进入凝胶 内部的通道，只能在 凝胶外部 移 动，路程较短，移动速度较快，相 对分子质量不同的蛋白质因此得以 分离。
分离出 相对分子质量较大 的蛋白质。
3、分类：琼脂糖凝胶电泳和聚丙稀酰胺凝胶电泳。 测定蛋白质相对分子质量通常用十二烷基硫酸钠 （SDS）—聚丙稀酰胺凝胶电泳
琼脂糖凝胶电泳示意图
在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带 电荷相反的电极移动
电泳检测结果
琼脂糖凝胶电泳
实验操作
阅读课本66页-67页相关内容，思考以下问题： 1、蛋白质的提取和分离一般分成几步？ 2、洗涤红细胞的目的是什么？怎样洗涤？洗涤干净的 标志是什么？ 3、采用什么方法分离血红蛋白？离心分层后，各层的 成分各是什么？用滤纸过滤，去掉什么成分？ 4、透析目的？
(三)电泳
1、概念：带电粒子在 电场 的作用下发生迁移的过程。 2、原理：许多重要的生物大分子，如多肽、核酸 等 都具有 可解离的基团 ， 在 一定的PH 下，这些 基团会带上正电或负电 。在电场的作用下，这些带 电分子会向着与其 所带电荷相反的电极移动。电泳利 用了待分离样品中各种分子 带电性质的差异 以及分 子本身 大小 、 形状 的不同使带电分子产生不同 的 迁移速度 ，从而实现样品中各种分子的分离。
专题5-课题3-血红蛋白的提取 与分离
本课题学习目标
体验从复杂体系中提取生物大分子的基本过程和方法，并了 解色谱法、电泳法等分离生物大分子的基本原理。
1、主要概念：①凝胶色谱法 ②电泳法 ③缓冲溶液 ④ 它们在血红蛋白的提取中分别起到什么作用。
2、主要原理：①凝胶色谱法分离蛋白质的原理
②电泳法分离样品的原理
2、缓冲溶液作用
能够抵制外界的酸或碱的对溶液的PH值的影响，维 持PH基本不变。
3、缓冲溶液配制
通常由1－2种缓冲剂溶解于水中配制而成。调节 缓冲剂的使用比例就可以制得在不同PH范围内使 用的缓冲液。
思考：说出人体血液中缓冲液。
NaH2PO4 / Na2HPO4
H2CO3 / NaHCO3
在血红蛋白整个实验室中用的缓冲 液是磷酸缓冲液，目的是利用缓冲液模 拟细胞内的PH环境，保证血红蛋白的正 常结构和功能，便于观察（红色）和材 料的科学研究（活性）
透析目的是：除去样品中分子量较小的杂质。
说明：透析袋是一种半透膜，能使小分子自由 进出，而大分子不能通过。
实验操作
4.透析
（二）粗分离
实验操作
（二）凝胶色谱操作
阅读课本P67-69，了解凝胶色谱的操作过程。
1、凝胶色谱柱的制作 2、凝胶色谱柱的装填 3、样品的加入和洗脱
2.实验操作
(1)样品处理：通过红细胞的洗涤、 搅拌 、 离心 等
蛋白质则溶于酒精
凝胶色谱法、电泳 法
①根据相对分子质 量的大小 ②各种分子带电性 质差异
①溶解在2 mol/L的NaCl溶
液中
步骤
②加水稀释至0.14 mol/L NaCl溶液使DNA析出过滤
③2mol/L NaCl溶解
4.凝胶色谱法分离蛋白质的原理和具体过程
凝胶色谱法分离蛋白质过程的动画演示
（二）缓冲溶液
1、缓冲物质有哪些？ 2、缓冲溶液的作用是什么？ 3、怎样配制缓冲溶液？
基础知识
（二）缓冲溶液
1、缓冲溶液概念
在一定的范围内，能对抗外来少量强酸、强碱或稍加稀 释不引起溶液PH发生明显变化的作用叫做缓冲作用，具 有缓冲作用的溶液叫做缓冲溶液。
实验操作
（一）蛋白质提取和分离步骤
样品处理→粗分离→纯化→纯度鉴定
（二）操作过程
1.样品处理：
可选用猪、牛、羊或其他脊椎动物的血 液来分离血红蛋白。
1、人们用鸡的红细胞提取DNA，用猪、牛、羊 的红细胞提取血红蛋白的原因是什么？
鸡的红细胞具有细胞核，含有DNA，便于进行DNA的提取； 猪牛羊（哺乳动物）成熟的红细胞无细胞核，血红蛋白含 量丰富便于提取血红蛋白。
操作收集到血红蛋白溶液。
相对分
(2)粗分离：通过透析去除血红蛋白溶液中的子质量 较
小的杂质。
(3)纯化：通过 凝胶色谱法 分离相对分子质量不同的
蛋白质。
(4)纯度鉴定：用 SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳 进行
样品纯度鉴定。
DNA粗提取与血红蛋白提取的比较
提取 物质
DNA
血红蛋白
提取 方法
盐析法
①DNA在不同浓度的NaCl溶 提取 液中溶解度不同 原理 ②DNA不溶于酒精，但某些
4、基本组成单位： 氨基酸
H
结构通式：
种类：
RC
5、氨基酸连接方式
脱水缩合
NH2
COOH
（一） 凝胶色谱法
1、别名：分配色谱法 是根据 相对分子质量的大小，利用具有网状结构的凝
胶的分子筛作用分离蛋白质的有效方法。
2、依据的特性: 蛋白质相对分子质量的大小
3、凝胶 ①性质：一些微小的 多孔球体 ，球内含许多贯穿的通道； ②化学本质：多糖类化合物 ③实例：葡聚糖、琼脂糖