高效液相色谱法对化妆品中17种香豆素类化学成分的同时测定

高效液相色谱法对化妆品中17种香豆素类化学成分的同时测
定
席海为;马强;王超;白桦;刘茜;王烨
【摘要】建立了同时测定化妆品中17种香豆素类化学成分(双香豆素、7-羟基-6-甲氧基香豆素、8-羟基补骨脂素、香豆素、6,7-二甲氧基香豆素、二氢香豆素、7-甲氧基香豆素、7-甲基香豆素、补骨脂素、8-甲氧基补骨脂素、5-甲氧基补骨脂素、4-甲基-7-乙氧基香豆素、2',4,8-三甲基补骨脂素、欧前胡素、异欧前胡素、二氢欧山芹醇当归酸酯、环香豆素)的高效液相色谱分析方法.样品经甲醇超声提取,以8 000 r/min离心15 min,取上清液过滤后测定.采用Agilent Zorbax SB-Phenyl柱(4.6 mm × 250 mm,5 μm)分离,以水-甲醇-乙腈三元流动相梯度洗脱,流速1.0 mL/min,柱温30 ℃.采用二极管阵列检测器多波长检测(210、220、250 nm),外标法定量.17种香豆素类化合物的定量下限(LOQ)为1 mg/kg,线性范围为0.5～60 mg/L,相关系数(r)均大于0.999.在高、中、低3种加标水平下的平均加标回收率(n=6)为86%～106%,相对标准偏差为0.3%～3.6%.该方法准确、简便,适用于化妆品中17种香豆素类化合物的测定.
【期刊名称】《分析测试学报》
【年(卷),期】2010(029)012
【总页数】5页(P1168-1172)
【关键词】高效液相色谱;香豆素类化合物;化妆品
【作者】席海为;马强;王超;白桦;刘茜;王烨
【作者单位】中国检验检疫科学研究院,北京,100123;中国检验检疫科学研究院,北京,100123;中国检验检疫科学研究院,北京,100123;中国检验检疫科学研究院,北京,100123;中国检验检疫科学研究院,北京,100123;中国检验检疫科学研究院,北京,100123
【正文语种】中文
【中图分类】O657.72;O625.1
香豆素类化合物是一类具有芳香气味,母核为苯并α-吡喃酮结构的天然产物,广泛分布于植物界[1]。

在日用化妆品中,通常添加一定量的香料,以增强化妆品的香气,香料的安全性将直接影响化妆品的安全性[2]。

香豆素类化合物可被用于添加在香水、沐浴啫喱、除臭剂等日用品中,根据德国联邦风险评估研究所的研究结果,部分香豆素类化合物可引发肝损伤,在使用具有高含量香豆素类化合物化妆品的过程中,香豆素类化合物可通过皮肤接触方式进入体内,可能导致消费者达到或超过香豆素的每日耐受摄入量 0.1 mg/kg体重。

欧盟化妆品新法规 Regulation(EC)1223/2009与我国《化妆品卫生标准》、《化妆品卫生规范》中也多处限制或禁止香豆素类化合物的使用,其中双香豆素、环香豆素、醋硝香豆素、二氢香豆素、7-甲氧基香豆素、7-甲基香豆素、4-甲基-7-乙氧基香豆素、非天然的呋喃类香豆素等已被纳入禁止使用物质列表[3-5]。

目前报道的化妆品中香豆素类化学成分的检测方法主要为高效液相色谱法[6-7]、液相色谱 -质谱法[8-10]、气相色谱法[11]、气相色谱 -质谱法[12]、毛细管电色谱法[13]、毛细管电泳法[14]、微分脉冲伏安法[15]等。

其中气相色谱 -质谱法[16]可同时检测化妆品中的多种香豆素类物质,但气相色谱 -质谱法对沸点较高的香豆素成分检测时,易受色谱柱流失产生的噪音信号干扰,且对沸点相近的香豆素无法较好分离,因此定量准确性不佳。

选择高效液相色谱法测定能弥补气相色谱 -质谱检测法
的缺陷,并能准确和灵敏地检测更多种的香豆素。

因此,本文建立了一种可同时测定
化妆品中 17种香豆素类成分的高效液相色谱法,该法准确、简便,满足化妆品的实
际检验要求,提高了现有化妆品的检测水平。

1.1 仪器与试剂
Agilent 1200型高效液相色谱仪,配在线脱气机、二元泵、自动进样器、柱温箱、二极管阵列检测器 (美国 Agilent公司);Milli-Q超纯水器 (美国Milli-Q公司);KQ-600B型超声波清洗器 (昆山市超声仪器有限公司);CR 21G型高速冷冻离心机 (日
本Hitachi公司)。

双香豆素、7-羟基-6-甲氧基香豆素、8-羟基补骨脂素、香豆素、6,7-二甲氧基香豆素、二氢香豆素、7-甲氧基香豆素、7-甲基香豆素、补骨脂素、8-甲氧基补骨脂素、5-甲氧基补骨脂素、4-甲基-7-乙氧基香豆素、2′,4,8-三甲基
补骨脂素、环香豆素 (购于美国 Sigma公司),欧前胡素、异欧前胡素、二氢欧山芹醇当归酸酯 (购于中国药品生物制品研究所);乙腈、甲醇、无水乙醇 (色谱纯,美国Fisher公司);其他试剂均为分析纯。

1.2 色谱条件
色谱柱:Agilent Zorbax SB-Phenyl柱(4.6 mm ×250 mm,5μm);流动相:水 (A)、甲醇 (B)和乙腈 (C),梯度洗脱程序:0～3 min,8%～14%B,8%～14%C;3～5
min,14%～23%B,14%～23%C;5～11 min,23%～24%B,23%～24%C;11～20 min,24%～28%B,24%～28%C;20～30 min,28%～34%B,28%～34%C;30～32 min,34%～35%B,34%～35%C;流速:1.0 mL/min;进样量:10μL;检测波长:210
nm(双香豆素、7-羟基-6-甲氧基香豆素、香豆素、6,7-二甲氧基香豆素、二氢香
豆素、7-甲氧基香豆素、7-甲基香豆素、补骨脂素、二氢欧山芹醇当归酸酯、环
香豆素)、220 nm(8-羟基补骨脂素、4-甲基-7-乙氧基香豆素、欧前胡素、异欧前胡素)、250 nm(8-甲氧基补骨脂素、5-甲氧基补骨脂素、2′,4,8-三甲基补骨脂素);柱温:30℃。

1.3 标准溶液的配制
分别准确称取 17种香豆素类化合物标准品各 50.0 mg(精确至 0.1 mg)于 50 mL 容量瓶中,用乙腈溶解并定容(双香豆素采用体积比为100∶1的乙腈 -吡啶混合溶液定容)。

分别配成 1 000 mg/L的标准储备液。

将标准储备液配制成混合标准溶液再将其稀释成系列混合标准工作溶液,4℃避光保存。

1.4 样品前处理
称取化妆品试样 0.5 g(精确至 1 mg),置于 100 mL具塞三角瓶中,加甲醇 10 mL,充分混匀后,密封,置超声波清洗器中提取 30 min,以 8 000 r/min离心 15 min,上清液过0.45μm微孔滤膜,滤液供高效液相色谱测定。

2.1 前处理条件的优化
2.1.1 提取溶剂的选择香豆素类成分在甲醇等有机溶剂中均有较好的溶解度,实验分别考察了甲醇、无水乙醇、乙腈、水以及这 3种有机溶剂与水混合液的提取效率,经过比较发现,甲醇的提取回收率最高,故选择甲醇为最佳提取溶剂。

2.1.2 提取时间的选择在空白化妆品中添加相同量的 17种香豆素类成分,分别超声提取 10、15、20、25、30、35、40 min,结果表明,随着提取时间的增加,提取率逐渐增加,但当提取时间超过 30 min后,提取率下降,原因可能是超声提取时间过长导致香豆素类化学成分挥发所致。

因此确定最佳超声提取时间为 30 min。

2.2 色谱条件的优化
2.2.1 色谱柱的选择分别考察了不同品牌的 C18柱 (Elite Kromasil C18、Waters Symmetry C18、PhenomenexLuna C18、Agilent Zorbax Extend C18)、C8 柱 (Elite Kromasil C8、Agilent Zorbax Eclipse XDBC8)、苯基柱 (Agilent Zorbax SB-Phenyl)的分离效果。

结果表明,17种致敏原成分在不同固定相的色谱柱上表现出显著的分离选择性差异,且在不同品牌的同种固定相色谱柱上分离选择性也有明显差异。

综合考虑分离度和分析时间,实验选择 Agilent Zorbax SB-
Phenyl(4.6 mm×250 mm,5μm)柱为最佳色谱柱。

2.2.2 检测波长的选择分别对 17种致敏原成分的标准溶液进行 190～800 nm紫
外 -可见光波长扫描分析,考虑到过低的波长会造成较大的基线漂移,影响定量的准
确性。

因此,综合考虑各化合物的紫外光谱特性,确定采用 210、220、250 nm为
检测波长 (见表 1)。

2.2.3 流动相的选择比较了不同组成的流动相,考虑到香豆素类化合物的色谱行为
极其相似,分离困难,故采用甲醇 -乙腈 -水三元洗脱系统。

通过比较不同比例的甲醇-乙腈 -水洗脱条件的色谱图,确定采用乙腈 -甲醇(1∶1,体积比)作为有机相。

经过
实验优化,确定“1.2”所示的梯度洗脱条件。

优化实验条件下,17种致敏原混合标准溶液各检测波长下的色谱图见图1。

2.3 方法的稳定性考察
称取化妆品试样 0.5 g(精确至 1 mg),添加同等水平的 17种香豆素类混合标准品,
分别按照“1.4”方法操作。

考虑样品分析的全程可在一日内完成,在 24 h内考察
香豆素类成分的稳定性。

分别于室温下放置 0、3、6、9、12、24 h,再依据“1.2”色谱条件进行测定。

结果表明,17种香豆素类成分的 RSD为 0.3%～1.6%,表明此17种香豆素类成分稳定。

本方法能满足含量测定的要求。

2.4 方法的线性关系、定量下限与回收率
配制质量浓度分别为 0.5、1.0、5.0、10.0、20.0、40.0、60.0 mg/L 的混合标准工作溶液依次进行测定,以色谱峰面积(y)对相应的质量浓度 x(mg/L)绘制标准曲线,17种香豆素类成分在 0.5～60 mg/L范围内线性关系良好 (见表 2),相关系数均大于 0.999,17种香豆素成分的定量下限 (LOQ,S/N=10)均为 1 mg/kg。

分别对散粉类化妆品空白样品添加不同浓度的标准溶液,依据本实验方法进行测定。

在高、中、低 3个加标水平下,每个水平平行测定 6次,17种香豆素类成分的平均
回收率为 86%～106%,相对标准偏差为 0.3%～3.6%,结果见表 2。

2.5 样品的测定
应用本方法分别对清洁类、膏霜类、水剂类、粉类、唇膏类等不同类型的进口化妆品和国产化妆品样品各 15件进行测定,均未检出含有香豆素类化学成分。

本文建立了高效液相色谱法测定化妆品中 17种香豆素类成分的检测方法。

研究结果表明,该方法具有操作简便、回收率高、精密度好和灵敏度高等特点,为不同种类的化妆品中香豆素类化学成分的检验提供了实用有效的方法。

【相关文献】
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