第十四章 电泳分离技术

影响泳动度的因素
2．溶液pH
溶液的pH值决定带电颗粒的解离程度，亦即决定
其所带电荷的多少。
对蛋白质而言，溶液pH值离等电点(pI)越远，则
颗粒所带的净电荷越多，泳动速度也越快；反之， 则越慢。
影响泳动度的因素
3．溶液的离子强度 缓冲液离子强度越高，则颗粒的电
动电势越小，泳动度也越小。一般最适合的离子强度在 O.02～O.2之间。
聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）原理 PAGE是根据被分离物质所带电荷的 多少及其分子大小、形状不同，在电 场作用下产生不同的移动速度而分离。 它具有电泳和分子筛双重作用.
聚丙烯酰胺凝胶构成

聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺(Acr)和 交联剂N,N-甲叉双丙烯酰胺(Bis)在加速剂 N,N,N,N-四甲基乙二胺(TEMED)和催化剂过硫酸铵(AP) 或核黄素(C17H2O6N4)的作用下聚合交联成三维网 状结构的凝胶，以此凝胶为支持物的电泳称为聚 丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)。
SDS (Sodium dodecyl sulfate)
十二烷基磺酸钠
凝胶的浓度和交联度
凝胶浓度： T（Acr和Bis总浓度）=(a+b)/m.100% 交联百分比： C（交联剂的百分比）=b/(a+b).100% a:Acr浓度；b: Bis浓度；m:缓冲液体积
凝胶的浓度和交联度
浓度和交联剂浓度决定胶的物理状 态及分子筛的孔径的大小
(一)、泳动度u
(迁移率):
带电质点在单位强度电场下的泳动速度
u:泳动度or泳动率(cm/
伏·秒or分)
d:泳动距离:cm t:电泳时间:秒/分
U:电压:常压(100—500v)
高压(500—10000v)仅需几分钟
V:泳动速度:cm/秒or分
E:电场强度:伏特/cm
l:支持场的长度
(有效长度)
不同分子在同一电场中可能具有不同的泳动度
连续胶与不连续胶:
连续胶：胶条(胶板)的浓度、pH值、组成 成份不变 不连续胶:胶条(胶板)的浓度、pH值、组成 成份变化
连续胶的制胶过程与点样过程
样本梳
间 隔 条
间 隔 条
玻璃板 (前,后)
不连续胶的制胶过程与点样过程
样本梳
浓缩胶 间 隔 条 间 隔 条
分离胶
玻璃板 (前,后)
■ 电泳凝胶系統的組成：
蛋白质进入pH8.9的同一孔径的分离胶后，分子小且为球 状的蛋白质分子所受阻力小，移动快，走在前面；反之， 则阻力大，移动慢，走在后面，从而通过凝胶的分子筛 作用将各种蛋白质分成各自的区带。
这种分子筛效应不同于柱层析中的分子筛效应，后者是 大分子先从凝胶颗粒间的缝隙流出，小分子后流出。
• 由多种具有不同等电点的载体两性电解质在电场中自动形成 pH梯度。被分离物则各自移动到其等电点而聚成很窄的区带， 分辨率很高。
混合
分立
稳态 时毗邻
移界
区带
等速
稳态 时分立静 止 等电聚焦
pH
AB
ABC
AB
B
B A B A
A B C
9
A
CBA
8 7 6
+
根据操作方式分类
1.连续系统： 缓冲液的离子成分、PH、凝胶浓度、电位梯度都
端点自由基 可再延续
丙烯酰胺 甲叉双丙烯酰胺
聚丙烯酰胺凝胶具 有一定的网状结构。 如果形成的孔径大小 接近于所分离样品分 子的平均半径，样品 分子在通过凝胶孔洞 时，所受到的阻力就 会和样品分子的大小 及形状有关。
聚丙烯酰胺凝胶的优点
①在一定浓度时，凝胶透明，有弹性，机械性能好；
②化学性能稳定，与被分离物不发生化学反应； ③对pH和温度变化较稳定；
琼脂
脱去SO42-丙酮酸酯基
琼脂胶
应用
由于孔径大，对大多数蛋白来说，其分子筛作用 微不足道。
因此广泛应用于核酸的研究，分离范围广 （200bp-50kb的DNA）.


琼脂凝胶电泳：常用pH6-9;离子强度 0.02-0.05;硼酸盐缓冲液和巴比妥缓冲液； 浓度常用1%-1.5%。 琼脂凝胶电泳的优点： 近似自由界面; 液固相间无明显界面，电泳速度快; 不吸收紫外线，可直接用紫外检测仪测定; 容易染色易洗脱.
分子量小，阻力小，移动快；分子量大，阻
力大，移动慢。
电荷效应：电荷量不同，迁移率不同。
㈠、凝胶电泳
琼脂糖凝胶电泳 凝胶电泳 聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE)
1、琼脂糖凝胶电泳
琼脂糖是从海藻中提取出来的一种线状高 聚物，是由 D— 半乳糖和 3 、 6— 脱水 —L— 半 乳糖结合的链状多糖。
琼脂糖
影响泳动度的因素
4．电渗 电泳缓冲液相对于固体支持物的移动称电渗。 如纸电泳时，滤纸吸附OH-带负电荷，与纸接触的 缓冲液带正电荷向负极移动。
影响泳动度的因素
5．温度 电泳时会产生焦耳热，使介质黏度下降， 分子运动加快，迁移率增加，同时温度过高会使 样品中的生物大分子变性失活。 因此电泳时，要控制电压或电流，也可安装冷却 散热装置。 6．支持物 要求是均匀，吸附力和电渗小，机械 性能好，便于染色或紫外光下检测，故最好透明， 无紫外吸收。
一般浓缩胶：2-5%，a:b=20 分离胶：7-10%，a:b=40 标准胶浓度：7%
在浓度为7.5% 的凝胶中，大多数生物体 内的蛋白质能得到满意的分离效果。因 此，把浓度为7.5% 凝胶称为标准胶。
对于一个未知样品，常用7.5%的标准胶 或4%-10% 的凝胶梯度来测试，而后选出 适宜的凝胶浓度。
■ 凝胶的聚合反应：
Ammonium persulfate (free radical initiator)过硫酸铵
(O4S-SO4 )
2-
2 SO4
1 1
自由基的生成者 Acrylamide (monomer) Bis(acrylamide) (bridge)
交联使聚合产生分枝:甲叉丙烯酰胺
凝胶的基本單位:丙烯酰胺
电泳技术概述
70年以来，电泳技术围绕制胶、电泳、染色三个技术 环节，不断改进，以实现下列目标： 1、提高分辨率及灵敏度。 2、简化操作，缩短电泳时间。 3、扩大应用范围。
目前，电泳技术已成为生物化学与分子生物学以及与其密 切相关的医学、农、林、牧、渔、制药及某些工业分析中 必不可少的手段。
相同，带电颗粒电泳时仅具有电荷效应、分子筛效应。
2.不连续系统： 缓冲液离子成分、pH、凝胶浓度、电位梯度不连 续，带电颗粒电泳时具有浓缩效应、电荷效应、分子 筛效应。
电泳作用效应
分子筛效应：分子量或分子大小和形状不同的
蛋白质通过一定孔径分离胶时，受阻滞的程度不
同而表现出不同的迁移率，这就是分子筛效应。
琼脂糖凝胶电泳的基本操作
１、配制缓冲液贮备液 ２、水平型琼脂糖凝胶制备 ３、样品的制备与点样 ４、电泳 ５、染色 ６、样品回收
紫外
+
-
水平板式电泳槽
垂直板式电泳槽
﹣
﹣
﹢
﹢
在凝胶电泳中，一般加入溴化乙锭（EB）-ethidium bromide染色，此时，核酸分子在紫外 光下发出荧光，肉眼能看到约50ng DNA所形成
在电场作用下，样品颗粒在大孔胶中泳动的阻力
小，移动速度快；当进入小孔胶时，受到的阻力
大，移动速度减慢。
因而在两层凝胶交界处，样品迁移受阻而压缩成
很窄的区带。
■ 浓缩胶对蛋白质分子的集焦作用：
A
样 本
B
C
8.3
浓 缩 胶
6.9
离子缺乏空间
分 离 胶
8.9
+
+
⑵．分子筛效应
大小和形状不同的蛋白质通过一定孔径分离胶时，受阻 滞的程度不同而表现出不同的迁移率，这就是分子筛效 应。
2 1 2 CH2=CH-CO-NH2
Acrylamide 有毒性！
TEMED (catalyst):四乙基乙二胺 帮助传递自由基的催化剂
核黄素-TEMED系统与过硫酸铵-TEMED系统
■ 联丙烯酰胺单体聚合过程： 聚 合 反 应
交联剂造成分枝
聚合反应 free radical
Bis
交錯连結
Bis
• 支持介质：电渗作用，吸附作用
• 温度
影响泳动度的因素
1．电场强度 是指每厘米的电位降，也称电位梯度(电势
梯度)。电场强度越高，则带电颗粒泳动越快。根据电场 强度的不同，电泳可分为两种。
(1)常压(100～500 V)电泳 其电场强度为2～10 V／cm。 分离时间较长，从数小时到数十小时，适合于分离蛋白质 等大分子物质。 (2)高压(2000～10000 V)电泳 其电场强度为50～200V／ cm，电泳时间很短，有时只需几分钟。多用于分离氨基酸、 多肽、核苷酸、糖类等小分子物质。
的条带。
核酸构型与琼脂糖凝胶电泳分离的关系: 共价闭环
超螺旋结构DNA>直线DNA >双链环状DNA
2、聚丙烯酰胺凝胶电泳
聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE)早在1959年由 Raymends和 Weintraub．L建立。1964年， 此法进一步从理论和实验技术上得到改进并推 广应用。由于具有较高的分辨率和灵活性，目 前已被广泛应用于蛋白质等生物大分子的分离 和分析。
第十四章 电泳分离技术
一、电泳技术概述
1937年，瑞典科学家Tiselius设计了世界上第一台电 泳仪，建立了移界电泳法，并于1948年荣获诺贝尔奖。
20世纪50年代，许多科学家着手改进电泳仪，寻找合适的 电泳支持介质，先后找到滤纸、醋酸纤维素薄膜、淀粉及 琼脂作为支持物。 60年代，Davis等科学家利用聚丙烯酰胺凝胶作为电泳支 持物，在此基础上发展了SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、等电 聚焦电泳、双向电泳和印迹转移电泳等技术。这些技术具 有设备简单，操作方便，分辨率高等优点。
三、电泳的分类
按形状分类：U型管电泳、柱状电泳、平 板电泳；
按载体分类：滤纸电泳、琼脂电泳、聚丙 烯酰胺电泳、自由电泳；
按分离原理分类
• 移界电泳（moving boundary EP） 不同的离子成分在均一的缓冲液系统中分离成独立的区带， 可以用染色等方法显示出来，如果用光密度计扫描可得出— 个个互相分离的峰; • 区带电泳(zone EP)
• 只能起到部分分离的作用，如将浓度对距离作图，则得出一 个个台阶状的图形; • 等速电泳(isotachophoresis) • 在电泳达成平衡后，各区带相随，分成清晰的界面，以等速 移动。按浓度对距离作图也是台阶状，但不同于上述移界电 泳，它的区带没有重叠，而是分别保持; • 等电聚焦 (isoelectricfocusing)
④几乎无电渗作用；
⑤样品不易扩散，其灵敏度可达10-6g； ⑥凝胶孔径可通过选择单体及交联剂的浓度调节； ⑦分辨率高； PAGE应用范围广，可用于蛋白质、酶、核酸等生物分子的 分离、定性、定量及少量的制备，还可测定相对分子质量、 等电点等。
一些概念
凝胶浓度和交联度 不连续胶与连续胶 变性胶及非变性胶
二、电泳技术的基本原理
电泳是指带电粒子在电场的作用下，向着与其 电性相反的电极移动的现象。 电泳技术指利用电泳现象对混合物进行分离分 析的技术。
蛋白质分子在不同pH下的解离状态
NH3+ P COOH P COONH3+ P COONH2
pH＜pI
pH＝pI
pH＞ pI
pH>pI 分子带负电荷，在电场中向正极移动; pH<pI分子带正电荷，在电场中向负极移动;
泳动度
泳动度与带电颗粒来自百度文库带净电荷的数量、颗粒大 小和形状有关。
被分离的球形分子在电场中所受的力(F)为：
F = E Q 式中 E：电场强度，即每厘米支持物的电位 降；Q为被分离物所带净电荷。
（二）、影响电泳速度的因素
• 样品本身：带电量，分子大小，形状
• 电场强度：电压
• 缓冲液：成分， pH ，离子强度
电泳系統 缓冲液 pH
8.3 8.3 6.9 8.3 8.3
胶体浓度
5% 7.5~20% -
1 上层 (负极) 缓冲液 Tris-glycine 2 样品溶液 3 4
胶 体 浓缩胶 分离胶 Tris-glycine Tris-HCl Tris-HCl
5 下层 (正极) 缓冲液 Tris-glycine
● 不连续胶有聚焦样品的作用
聚丙烯酰胺凝胶电泳原理
三种物理效应
⑴样品浓缩效应 ⑵分子筛效应 ⑶电荷效应
三种物理效率使样品分离效果好，分辨率高
（1）样品浓缩效应：由凝胶系统的不连续性产生。
①凝胶孔径不连续性
②缓冲液离子成份的不连续性
③pH的不连续性
⑴．样品浓缩效应
凝胶孔径的不连续性 分离胶为小孔胶。 样品胶及浓缩胶为大孔胶；