流式细胞仪(FlowCytometer)基本原理汇总.
流式细胞仪工作原理
流式细胞仪工作原理流式细胞仪（Flow Cytometer）是一种广泛应用于生物医学研究和临床诊断的仪器，它可以快速、准确地分析和计数细胞、细胞群和微粒。
流式细胞仪的工作原理主要包括样本流动系统、激发光源、光学系统、信号检测系统和数据分析系统。
1. 样本流动系统：流式细胞仪的样本流动系统由进样装置、样本流路和废液收集系统组成。
样本通过进样装置被注入到流动细胞仪中，进入样本流路后以恒定的速度流动。
废液收集系统用于收集已经分析过的样本。
2. 激发光源：流式细胞仪通常使用激光器作为激发光源。
激光器产生的单色激光通过光纤传输到流式细胞仪中，激光的波长可以根据需要进行选择。
常用的激光器波长包括488nm、532nm和633nm等。
3. 光学系统：流式细胞仪的光学系统包括激发光源、光学滤光片、透镜、光电倍增管（PMT）和散射光探测器等。
激发光源照射样本时，样本中的细胞或微粒会发生荧光或散射现象。
光学滤光片用于选择特定波长的荧光信号或散射信号，透镜用于聚焦光线，PMT用于接收和放大荧光信号或散射信号。
4. 信号检测系统：流式细胞仪的信号检测系统主要由光电倍增管（PMT）和散射光探测器组成。
PMT是一种高灵敏度的光电探测器，能够将荧光信号或散射信号转换为电信号。
散射光探测器用于检测样本中的散射光信号，可以分析细胞的大小和形状等信息。
5. 数据分析系统：流式细胞仪的数据分析系统主要包括计算机和相关的数据分析软件。
通过数据分析软件，用户可以对采集到的数据进行处理、分析和图形展示。
常用的数据分析软件包括FlowJo、CellQuest和ModFit等。
流式细胞仪的工作原理是基于细胞或微粒在激光照射下发生荧光或散射现象，通过光学系统收集和检测这些信号，并通过数据分析系统对信号进行处理和分析。
流式细胞仪可以实现对细胞的表型、功能和数量等多个方面的分析，广泛应用于免疫学、细胞生物学、肿瘤学等领域。
以上就是流式细胞仪的工作原理的详细介绍。
简述流式细胞术的原理与应用
简述流式细胞术的原理与应用一、流式细胞术的原理介绍流式细胞术（Flow cytometry）是一种利用流式细胞术仪（Flow cytometer）对单个活细胞进行多参数分析的技术。
它基于细胞的光学性质和生物化学特性，通过探针标记、荧光染料和细胞表面抗原的相互作用，对细胞进行高速连续检测和分离。
流式细胞术的原理如下：1.细胞悬浮和样本处理：将细胞样品作为悬浮液，通过离心等方法将细胞分散在液体中，去除细胞的团块和碎片，保证单个细胞的流式检测。
2.细胞标记：采用流式细胞术特定的探针和染料对细胞进行标记，以便后续检测和分析。
常用的标记方法包括荧光染料标记、抗体标记和细胞分子探针标记。
3.细胞分离和传送：将标记的细胞悬浮液通过流式细胞术仪，以流速每秒数千个细胞的速度单个分子传送到探测点。
4.光散射与荧光探测：细胞经过流式细胞术仪后，以激光束照射细胞，通过散射光和荧光信号的检测，对细胞进行空间分布和化学信息的获得。
5.数据采集与分析：通过计算机系统采集和记录细胞经过流式细胞术仪后所产生的光散射和荧光信号，在分析软件中对数据进行处理和解读，获得有关细胞的信息。
二、流式细胞术的应用流式细胞术是一种广泛应用于生物医学研究和临床诊断的技术，它在细胞学、免疫学、血液学、肿瘤学等领域有着重要的应用价值。
下面列举几个流式细胞术的应用示例：1.血液学研究：流式细胞术结合细胞表面标记和荧光染料标记，可以对血液中的不同细胞类型进行快速的鉴定和数量分析。
例如，通过流式细胞术可对血液中的淋巴细胞、单核细胞和粒细胞等进行分类和计数，从而判断患者的免疫状态和疾病进展。
2.癌症诊断与治疗：流式细胞术对肿瘤细胞的检测和分析有着重要的作用。
通过流式细胞术，可以检测和定量肿瘤细胞的表面抗原和细胞内信号分子，进一步了解肿瘤细胞的类型、分化程度和增殖状态，为癌症的诊断和治疗提供指导。
3.免疫学研究：流式细胞术能够对免疫系统中的各种细胞类型进行鉴定、计数和功能分析。
流式细胞仪原理
流式细胞仪原理简介流式细胞仪是一种常用于细胞分析的仪器，它能够对单个细胞进行快速准确的分析。
通过流式细胞仪，我们可以得到细胞数量、大小、形状、颜色以及表面标记等信息。
流式细胞仪的原理基于流体力学原理、光学原理和电子学原理，下面将详细介绍其工作原理。
流体力学原理流式细胞仪利用流体力学原理将细胞单个地引入到流动液流中，并将其定位在光学路径中。
为了实现这一点，细胞悬浮液会通过一个注射器被推入到流式细胞仪的样本室中。
样本室内的液体流速是可调节的，通常设置为每分钟几百个微升。
液体通过一个窄的注射器喷嘴喷出，与环境空气接触，形成喷雾。
这个喷雾使得细胞在单个状态下被引入液滴，并将其带到一个称为流式细胞仪排样器的设备上。
光学原理流式细胞仪利用光学原理来测量细胞的性质。
当细胞通过流动液体时，一束激光通过细胞，并被细胞的不同组分所散射。
流式细胞仪测量散射的角度和强度来确定细胞的大小和形状。
流式细胞仪上通常有两至三个激光器，每个激光器都有特定的波长。
这些激光器产生的光经过透镜和其他光学元件被聚焦为一束光束。
被聚焦的光束穿过流体中悬浮的细胞，并散射到一个或多个探测器上。
不同角度和强度的散射光被探测器捕获并记录下来。
流式细胞仪的探测器通常分为三种类型：前向散射（FSC）、侧向散射（SSC）和荧光散射（FL）。
前向散射探测器用于测量细胞的大小，侧向散射探测器用于测量细胞的复杂度和内部结构，而荧光散射探测器用于测量细胞的表面标记物。
通过同时测量这些散射光的强度，流式细胞仪可以提供关于细胞的详细信息。
电子学原理除了光学原理外，流式细胞仪还利用电子学原理来处理和分析测量得到的数据。
在流式细胞仪中，探测器将测量到的光信号转化为电流信号。
这些电流信号经过放大、数字化和处理后，可以被计算机分析和展示。
流式细胞仪通常配备有计算机软件，该软件可以解析和分析信号，提取有用的细胞信息。
通过设置特定的参数，我们可以选择性地分析并显示不同类型的细胞。
流式细胞仪(flowcytometer)基本原理
流式细胞仪(flowcytometer)基本原理，详细流式细胞仪（Flow Cytometer）是一种用于细胞计数、细胞分类和细胞特性分析的重要实验室装置。
它能够快速地对成千上万的细胞进行分析，并且可以同时对多种细胞特性进行检测。
流式细胞仪的基本原理涉及到光学和流体力学的结合，这里是一个详细的解释：流体系统（Fluidics）流式细胞仪的流体系统负责将样本中的细胞悬液通过一个狭窄的管道（通常称为流室或喷嘴）输送，使细胞单个通过。
为了实现单个细胞的流动，采用了水力聚焦技术（hydrodynamic focusing），即使用一个不含细胞的剪切流（通常为盐溶液）将细胞流包围起来，迫使它们以单列的形式通过检测区。
光学系统（Optics）当细胞单个通过检测区时，流式细胞仪的光学系统开始发挥作用。
它通常包含一个或多个激光，激光束照射穿过流室的细胞。
细胞对光的散射和吸收会产生前向散射光（Forward Scatter, FSC）和侧向散射光（Side Scatter, SSC），分别与细胞的大小和内部复杂性（如颗粒性或结构）相关。
荧光检测（Fluorescence Detection）除了散射光，如果细胞被荧光标记，那么激光也会激发荧光染料，细胞将发出荧光信号。
不同的染料可以被激发并发出不同波长的荧光，这些荧光通过光学滤镜和分光器被检测，使得可以同时检测多个不同的荧光标记。
数据采集与分析（Data Acquisition and Analysis）每个通过检测区的细胞都会产生散射光和荧光信号，这些信号被光电管或光电倍增管（PMTs）检测，并转换为电信号。
这些电信号随后被数字化，并由计算机软件分析。
软件可以根据用户的需要进行细胞的分类、计数以及各种参数的量化，如细胞大小、颗粒性、荧光强度等。
通过流式细胞仪，研究人员可以进行多种分析，包括但不限于细胞周期分析、活细胞和死细胞的鉴别、细胞亚群的鉴定以及细胞内信号传导的研究。
流式细胞仪工作原理
流式细胞仪工作原理流式细胞仪是一种广泛应用于生物医学研究和临床诊断的仪器，它能够对细胞进行快速、高通量的分析和分类。
流式细胞仪的工作原理涉及光学、流体力学和电子学等多个方面。
下面将详细介绍流式细胞仪的工作原理。
1. 光学系统流式细胞仪的光学系统主要包括激光器、光学滤波器、光学透镜和探测器等。
激光器产生高强度的单色激光束，常用的激光器有氩离子激光器、固态激光器和半导体激光器等。
光学滤波器用于选择所需的激发光和荧光信号，以提高检测的准确性和灵敏度。
光学透镜用于聚焦激光束和荧光信号，确保精确的光学成像。
探测器用于接收和转换荧光信号为电信号。
2. 流体力学系统流体力学系统主要包括进样系统、流动装置和排样系统。
进样系统通过吸管或自动进样器将待测样品引入流式细胞仪中。
流动装置通过泵浦将样品以恒定速度注入到流式细胞仪的流动池中。
排样系统则用于收集和处理已经分析过的样品。
3. 细胞分析过程当样品进入流动池后，流体力学系统将样品以单个细胞为单位依次通过激光束。
当细胞通过激光束时，激光束与细胞相互作用，产生散射光和荧光信号。
散射光包括前向散射光、侧向散射光和散射光散射光，用于测量细胞的大小、形状和复杂度。
荧光信号则用于测量细胞中的特定分子标记物，如细胞表面标记物或细胞内染色剂。
4. 探测和数据分析流式细胞仪的探测器会接收和转换散射光和荧光信号为电信号。
这些电信号经过放大和滤波处理后，通过模数转换器转换为数字信号。
数字信号经过计算机处理和分析，生成细胞的散射图和荧光图。
通过分析这些图像，可以得到细胞的特征参数，如细胞数量、大小、形态和荧光强度等。
5. 应用领域流式细胞仪广泛应用于生物医学研究和临床诊断领域。
在生物医学研究中，流式细胞仪可用于细胞免疫学、细胞生物学、肿瘤学和微生物学等方面的研究。
在临床诊断中，流式细胞仪可用于血液疾病的诊断、免疫表型分析和肿瘤细胞检测等。
总结：流式细胞仪通过光学、流体力学和电子学等原理，实现对细胞的快速、高通量分析和分类。
流式细胞仪(Flow_Cytometer)基础简介
●
FCM的定义
流式细胞仪是指，使细胞（或其 他粒子）以单个方式依次高速通过激 发光束，采集细胞被光照时产生的各 种信号，对信号进行处理，幵对各参 数进行关联分析的一种仪器。
对比
流式细胞仪是一种特殊的显微镜
流式细胞仪
流动的细胞
数量大 高速分选
显微镜
静止的细胞样本
数量少 样本难以再利用
细胞群体特征量分布
流式细胞仪（Flow Cytometer) 基础简介
中科院生物物理研究所 中国科学院蛋白质科学研究平台 2005年3月 刘春春
Hale Waihona Puke 主要内容
流式细胞仪概要 流式细胞仪的工作原理 流式细胞仪测量的对象
什么是流式细胞仪
●
流式细胞仪实物
BD-Calibur
BD FACSVantage
流式细胞仪基本结构
非荧光信号
颗粒度
细胞大小
散射光信号区分裂解后的外周血细胞群
荧光信号
荧光染料被激发而发射的光信号。 定量染色 荧光信号大小 被标记组分含量的定量
多荧光标记胞内多种组分，实现多参数测量
PI＋Annexin－V细胞凋亡检测
DNA 含 量 -PI Annexin-V
PE＋FITC荧光标记检测外周 血裂解后细胞群
光信号收集
光信号分离，导向，各探测通道PMT 接收幵转化为电信号。
激光束
侧向散射 光，荧光
1
二色镜 2
3
细胞
前向 散射 光
收集透镜
带通滤波片 光电倍增管
数据处理
光信号
FSC SSC FL1 FL2 FL3
电信号
对数 线性 线性 线性 对数
流式细胞仪工作原理
流式细胞仪工作原理流式细胞仪（Flow Cytometer）是一种用于细胞分析和排序的仪器。
它可以快速、高效地分析和计数细胞，同时还能够检测细胞的大小、形状、荧光强度等特征。
流式细胞仪的工作原理主要包括样本处理、细胞悬浮液注入、细胞流动、激发光源、荧光信号检测和数据分析等步骤。
1. 样本处理：在使用流式细胞仪之前，需要对样本进行处理。
通常，样本可以是细胞悬液、细胞培养物或者组织样本。
处理包括细胞的采集、离心、洗涤和染色等步骤，以确保样本中的细胞均匀分散并且具有所需的荧光标记。
2. 细胞悬浮液注入：处理后的样本被注入到流式细胞仪的样本室中。
样本室是一个细长的管道，具有一个小孔，称为流动汇聚点。
细胞悬浮液通过流动汇聚点进入流动汇聚室。
3. 细胞流动：细胞悬浮液在流动汇聚室中形成一个窄而稳定的流动柱。
这是通过使用压力或者重力来维持的。
细胞流动的速度可以根据需要进行调整。
4. 激发光源：流式细胞仪使用激光或者其他光源来激发细胞中的荧光物质。
激发光源通常是单色或者多色的，并且具有特定的波长。
当细胞通过激发光源时，荧光标记的份子会吸收光能并发射出特定的波长的荧光。
5. 荧光信号检测：流式细胞仪使用一组光学器件来检测细胞发出的荧光信号。
这些光学器件包括滤光片、光学透镜和光电倍增管。
滤光片用于选择特定波长的荧光信号，光学透镜用于聚焦荧光信号，光电倍增管用于将荧光信号转化为电信号。
6. 数据分析：流式细胞仪将检测到的荧光信号转化为数字信号，并将其传输到计算机上进行数据分析。
数据分析软件可以对细胞进行计数、分类和排序，同时还可以生成细胞分析报告。
流式细胞仪的工作原理基于细胞的荧光特性和光散射特性。
荧光标记的抗体、荧光染料或者荧光蛋白可以与特定的细胞成份结合，并通过检测发出的荧光信号来分析细胞的特征。
此外，细胞的大小、形状和复杂性也可以通过检测散射光来进行分析。
总结起来，流式细胞仪通过将样本中的细胞悬浮液注入到流动柱中，利用激发光源激发荧光标记物，通过荧光信号检测器检测荧光信号，并将其转化为数字信号进行数据分析。
流式细胞仪(Flow Cytometry) 原理简介
侧向散射光(linear)
CD14 PE (log) 前向散射光 (linear) CD45 FITC (log)
R1=单核细胞 (CD14+ve) R2=淋巴细胞 (CD45>单核细胞) R3=中性粒细胞 (CD45<单核细胞)
细胞分选
流式。 大小范围：0.2uM-300uM。 对象类型 细胞类型： （1） 高等真核细胞； （2）酵母； （3）细菌； （4）多细胞的聚集体，如胰岛等。 非生命颗粒： 细胞核、染色体、和其它细胞器以及乳化微球等。
●
FCM的定义
流式细胞仪是指，使细胞（或其 他粒子）以单个方式依次高速通过激 发光束，采集细胞被光照时产生的各 种信号，对信号进行处理，幵对各参 数进行关联分析的一种仪器。
对比
流式细胞仪是一种特殊的显微镜
流式细胞仪
流动的细胞
数量大 高速分选
显微镜
静止的细胞样本
数量少 样本难以再利用
细胞群体特征量分布
非荧光信号
颗粒度
细胞大小
散射光信号区分裂解后的外周血细胞群
荧光信号
荧光染料被激发而发射的光信号。 定量染色 荧光信号大小 被标记组分含量的定量
多荧光标记胞内多种组分，实现多参数测量
PI＋Annexin－V细胞凋亡检测
DNA 含 量 -PI Annexin-V
PE＋FITC荧光标记检测外周 血裂解后细胞群
G1
G2
1 DNA含量
2
1
S
G2/M
细胞周期时相
染色体组型测定
2
1
白血病患者 1/3
4
5
3
Hoechst 33258 （AT）
流式细胞仪原理
流式细胞术简介一、流式细胞术发展简史流式细胞术(FlowCytometry,FCM)是一种可以对细胞或亚细胞结构进行快速测量的新型分析技术和分选技术。
其特点是：①测量速度快，最快可在1秒种内计测数万个细胞；②可进行多参数测量，可以对同一个细胞做有关物理、化学特性的多参数测量，并具有明显的统计学意义；③是一门综合性的高科技方法，它综合了激光技术、计算机技术、流体力学、细胞化学、图像技术等从多领域的知识和成果；④既是细胞分析技术，又是精确的分选技术。
概要说来，流式细胞术主要包括了样品的液流技术、细胞的分选和计数技术，以及数据的采集和分析技术等。
FCM目前发展的水平凝聚了半个世纪以来人们在这方面的心血和成果。
1934年，Moldavan1首次提出了使悬浮的单个血红细胞等流过玻璃毛细管，在亮视野下用显微镜进行计数，并用光电记录装置计测的设想，在此之前，人们还习惯于测量静止的细胞，因为要使单个细胞顺次流过狭窄管道容易造成较大的细胞和细胞团块的淤阻。
1953年Crosland–Taylor根据雷诺对牛顿流体在圆形管中流动规律的研究认识到：管中轴线流过的鞘液流速越快，载物通过的能力越强，并具有较强的流体动力聚集作用。
于是设计了一个流动室，使待分析的细胞悬浮液都集聚在圆管轴线附近流过，外层包围着鞘液；细胞悬浮液和鞘液都在作层液。
这就奠定了现代流式细胞术中的液流技术基础。
1956年，Coulter在多年研究的基础上利用Coulter效应生产了Coulter计数器。
其基本原理是：使细胞通过一个小孔，只在细胞与悬浮的介质之间存在着导电性上的差异，便会影响小孔道的电阻特性，从而形成电脉冲信号，测量电脉冲的强度和个数则可获得有关细胞大小和数目方面的信息。
1967年Holm等设计了通过汞弧光灯激发荧光染色的细胞，再由光电检测设备计数的装置。
1973年Steinkamp设计了一种利用激光激发双色荧光色素标记的细胞，既能分析计数，又能进行细胞分选的装置。
流式细胞仪工作原理
流式细胞仪工作原理流式细胞仪（Flow Cytometer）是一种广泛应用于生物医学研究和临床诊断的仪器。
它通过将细胞悬浮液以单个细胞为单位通过流动细胞流进行检测和分析，能够快速准确地获取细胞的多个参数信息，如细胞数量、大小、形态、表面标记物的表达情况、细胞内分子的含量等，从而为细胞学研究提供了重要的数据支持。
流式细胞仪的工作原理主要包括细胞悬浮液的进样、细胞的定位与聚焦、激发光源的照射、细胞信号的收集和数据分析等几个关键步骤。
1. 细胞悬浮液的进样：将待检测的细胞悬浮液通过注射器或自动进样系统引入流式细胞仪的进样口。
为了避免细胞凝聚在一起，通常需要事先对细胞进行适当的处理，如酶消化、细胞分离等。
2. 细胞的定位与聚焦：进样后的细胞悬浮液通过微细管道进入流式细胞仪的流动细胞流中，细胞在流动细胞流中以单个细胞为单位依次通过激光束的照射区域。
通过调节流速和流体压力，使细胞在流动细胞流中保持分散状态，并且细胞以单个细胞的形式通过激光束，以确保每个细胞都能被准确地检测和分析。
3. 激发光源的照射：流式细胞仪通常使用激光器作为光源。
激光器发出的单色或多色激光经过适当的光学元件（如透镜、滤光片等）聚焦成一个细束，然后照射到流动细胞流中的细胞上。
不同的激光波长对应不同的荧光染料，可以用于标记不同的细胞成分或特定的细胞表面分子。
4. 细胞信号的收集：当激光照射到细胞上时，细胞内的荧光染料会受到激发并发射出特定的荧光信号。
流式细胞仪通过一组光学元件（如物镜、滤光片、光电倍增管等）收集并分离这些荧光信号，然后将其转化为电信号。
5. 数据分析：流式细胞仪将收集到的荧光信号转化为电信号后，通过连接到计算机的数据采集系统进行数字化处理和分析。
数据采集系统可以记录细胞的特定参数，如荧光强度、散射光强度等，并将其以图像或数值的形式显示出来。
研究人员可以根据需要对数据进行进一步的分析和解读，如细胞分类、细胞计数、表达量的定量等。
流式细胞仪的原理介绍
Peng zhang; Free Radical Research,2009,43(3):224-233.
细胞凋亡的检测
细胞形态及细胞膜通透性的变化(Hoechest
七、流 式 细 胞 仪 的 科 研 应 用
树突细胞研究 干细胞研究 癌症病人的多药耐药性 细胞动力学功能研究 环境微生物分析 流式细胞术与分子生物学研究 流式细胞术在免疫检验中的应用
FCM 在 细 胞 生 物 学 中 的 应 用
DNA 细 胞 周 期 分 析
G1
M (mitosis)
红色荧光强 度
双参数直方图点图
绿色荧光强 度
（三）设 门 分 析 技 术 1.Gate设置：指根据该图的细胞群分 布选定其中想要分析的特定细胞群。
根据门的形状又分为了线性门、矩形门、圆形门、多 边形门、任意形状门和十字门。
A 淋巴细胞 B 单核细胞 C 中性粒细胞
A、B、C均为 任意门
线性门
吸取100ul的细胞(1 x 105)至试管中。 加进适量的荧光标记的annexin-V试剂和PI。 混匀后避光室温下孵育15分钟。（必须在室
温下进行） 孵育后加进400ul染色缓冲液，立即上流式细
胞仪分析。
Annexin-V和PI双染的特点和注意事项
利用荧光染料与单克隆抗体技术结合的标记技术， 保证检测的灵敏度和特异性；
用计算机系统对流动的单细胞悬液中单个细胞的多 个参数信号进行数据处理分析，保证了检测速度与 统计分析精确性。
1.流式细胞仪的基本结构
（1） 液流系统 （2） 光学系统 （3） 数据处理系统
流式细胞仪(Flow Cytometer)原理及应用-12.4
7 recip 9-22 9-12
Chromomycin A3
（GC）
结束语
流式细胞术是一种应用范围极广、灵活性很 强、技术含量较高、具有众多开发潜能、富有挑 战性的技术，需要掌握很多交叉学科知识，在科 研领域灵活运用这项技术，报告最科学、最真实 的客观数据，是我们的目标。
单参数直方图（Histogram）
二维等高图和密度图
Pseudo 3D Plot
3D Plot
便于数据统计 不同的细胞群 可以用不同的颜 色标记 主要表达方式
二维点图Dot Plot
光谱交叉
4 colors - simultaneous collection
FITC PE PETR
PE-CY5
侧向散射光(linear) 侧向散射光
前向散射光 (linear)
CD14 PE (log) CD45 FITC (log)
R1=单核细胞 (CD14+ve) R2=淋巴细胞 (CD45>单核细胞) R3=中性粒细胞 (CD45<单核细胞)
细胞分选
流式细胞仪的测量对象
大小 悬浮在溶液中的相互离散颗粒。 悬浮在溶液中的相互离散颗粒。 大小范围： 大小范围：0.2uM-300uM。 。 对象类型 细胞类型： 细胞类型： 高等真核细胞； （1） 高等真核细胞； 酵母； （2）酵母； 细菌； （3）细菌； 多细胞的聚集体，如胰岛等。 （4）多细胞的聚集体，如胰岛等。 非生命颗粒： 非生命颗粒： 和其它细胞器以及乳化微球等。 细胞核、染色体、和其它细胞器以及乳化微球等。
流式细胞术操作流程
样品 培养细胞 新鲜组织 石蜡包埋 标记 单细胞 悬液 检测 荧光抗体
流式细胞仪工作原理
流式细胞仪工作原理流式细胞仪是一种广泛应用于生物医学研究和临床诊断的仪器，它可以对细胞和微粒进行高速、连续的检测和分析。
它的工作原理基于光学原理和流体动力学原理，下面将详细介绍流式细胞仪的工作原理。
1. 光学系统流式细胞仪的光学系统由激光器、光学镜头、滤光片、光散射器和光电探测器等组成。
激光器产生一束高能量、单色、相干的光束，经过光学镜头聚焦后照射到待测样品上。
样品中的细胞或微粒与激光相互作用后，会发生光散射、荧光发射等现象。
2. 流体系统流式细胞仪的流体系统由进样系统、流速控制装置和废液排放系统组成。
待测样品通过进样系统进入流动细胞仓，并在流速控制装置的控制下以稳定的速度通过激光束。
废液排放系统用于收集经过检测的样品。
3. 光散射检测光散射是流式细胞仪最常用的检测方式之一。
当细胞或微粒经过激光束时，光线会被散射。
光散射信号分为前向散射和侧向散射。
前向散射与细胞或微粒的大小和形状相关，侧向散射与细胞或微粒的复杂度和粒子表面的结构相关。
流式细胞仪通过收集和测量光散射信号的强度和角度，可以获取细胞或微粒的大小、形状、复杂度等信息。
4. 荧光检测荧光检测是流式细胞仪另一种常用的检测方式。
通过给待测样品添加荧光染料或标记抗体，当激光照射到样品时，荧光染料或标记抗体会发出特定波长的荧光信号。
流式细胞仪通过滤光片选择性地收集特定波长的荧光信号，并通过光电探测器转换为电信号。
荧光检测可以用于检测细胞表面标记物、细胞内某种分子的含量等。
5. 数据分析流式细胞仪通过光电探测器将光信号转换为电信号，并将其转化为数字信号进行处理和分析。
流式细胞仪配备了专业的数据分析软件，可以对收集到的数据进行多参数分析、绘制直方图、散点图等，以获取更多关于细胞或微粒的信息。
总结：流式细胞仪的工作原理基于光学原理和流体动力学原理，通过光散射和荧光检测来获取细胞或微粒的相关信息。
它可以用于细胞表面标记物的检测、细胞内某种分子的含量分析、细胞周期和凋亡的研究等。
流式细胞仪FlowCytometry原理简介
核酸：DNA含量，DNA成分，DNA合成，RNA，染色质结构等
总蛋白质 蛋白质分子间相互作用 抗原
细胞骨架成分
受体
功能属性： 酶活性 细胞凋亡 细胞坏死 细胞活性 氢硫基 凝血素结合位点
药物动力学 ……………………..
●FCM的定义
流式细胞仪是指，使细胞（或其 他粒子）以单个方式依次高速通过激 发光束，采集细胞被光照时产生的各 种信号，对信号进行处理，并对各参 数进行关联分析的一种仪器。
对比
流式细胞仪是一种特殊的显微镜
流式细胞仪
流动的细胞
显微镜
静止的细胞样本
数量大
数量少
高速分选
样本难以再利用
细胞群体特征量分布 可以揭示细胞内部结构信息
64839306 或 ： 64862503 电子邮件 lcc@
Y 18
14
15
21 20
16 17
19 Ph 22
9-12
白血病患者
Chromomycin A3 （GC）
生物物理所现有流式细胞仪
型号：BD FACSVantage SE
参数：分析10，000个/ 秒，分选7，000个/秒； 激光：488nm，UV；四 色荧光通道。
地点：1406 联系方式：电话
流式细胞仪（Flow Cytometer) 基础简介
中科院生物物理研究所 中国科学院蛋白质科学研究平台
2005年3月 刘春春
主要内容
流式细胞仪概要 流式细胞仪的工作原理 流式细胞仪测量的对象
什么是流式细胞仪
●流式细胞仪实物
流式细胞术的基本原理
流式细胞术的基本原理流式细胞术（Flow cytometry）是一种被广泛用于生物学和医学领域的细胞分析和排序技术。
该技术采用激光离子流和散射光学的原理，快速测定单个细胞的生物学和物理特性。
该技术不仅可以进行细胞计数、大小、形态特征、表面结构、细胞周期、代谢活性、细胞分化和生长状态等分析，还可以进行单细胞分选和纯化以及细胞染色体分析等研究。
基本原理流式细胞术的原理是通过射流将单个细胞迅速送入激光束中，该激光束激发细胞中的荧光染料和标记物或散射光学特性，进而检测细胞的光学信号，并进行信号转换和数字化处理，最终得到单个细胞的特异性指标。
流式细胞术的主要组成部分包括样品处理系统、流式细胞分析系统和数据分析系统。
样品处理系统：将细胞样品经过预处理、染色或标记，使其适用于流式细胞分析。
常用的样品预处理方法包括：细胞分离、染色、去除细胞碎片和去除红细胞等。
对于需要分选的细胞，还需要使用细胞排序技术分离目标细胞。
流式细胞分析系统：该系统包括激光、光电倍增管、光学透镜、光学滤波器、样品输送系统和电子系统等。
通过激光激发样品中的荧光染料或标记物，分析细胞的光学特性。
常用的荧光染料包括：FITC、PE、APC、PerCP、Cy5等。
常用的标记物包括：抗体、细胞因子、小分子荧光探针、DNA荧光探针等。
通过修改流式细胞分析仪的配置，可实现不同荧光染料和标记物的测定。
数据分析系统：流式细胞仪测定数据的处理和分析是采用计算机系统完成的。
数据分析的常用指标包括：细胞计数、细胞孔径（大小）、荧光强度（比例和强度）、散射特性等。
一般情况下，在细胞的某个特定荧光标记物上测定的强度与其他群体相比，该指标被用来区分并描述细胞。
流式细胞术的应用流式细胞术被广泛应用于生物医学研究和诊断中。
以下是一些常见的应用领域：1. 分析细胞表面和胞内蛋白表达：通过荧光共轭的抗体和标记物来测定单个细胞膜和胞内蛋白的表达量和分布，从而确定细胞分化状态和生理状态。
流式细胞仪(FlowCytometer)基本原理汇总.
Counts
Event #
FL1 FITC
1
10
2 700
3 720
4
15
……
0…………10…………100…………1000 FITC荧光强度
直方图 Histogram
横坐标既可以是线性的，也可以是对数的。
DNA倍体分析
抗原表达分析
Overlay图
散点图 Dot Plot
散点图中每个点代表一个细胞，X轴与Y轴分别代表一种参 数，优点是比直方图直观。
FL-2(-)
FITC 单标
PE 单标
FL-2(PE)
FL2 - %FL1 FL-1(FITC)
FL1 - %FL2 FL-1(ion
FL-1(FITC)
After Compensation
FL-1(FITC)
什么样的补偿最合适？
单染管的阴性群体和阳性群体在所需调节通道的荧光Median 值相等时为最合适的补偿。
Hoechst（343, 450）常见为Hoechst33342和Hoechst33258，非嵌入的方 式与DNA链上的A-T碱基对结合。能对活细胞染色，用于活细胞DNA定量分 析，如精子分选；还用于侧群细胞的分选。
PY（派若宁 560, 573） RNA染料，能进入活细胞。
AO（吖啶橙 509, 525） DNA、RNA染料，染色后DNA呈黄绿色荧光，RNA呈 橙黄色荧光，可进行DNA/RNA双参数分析。
5% 默认阈值
32% 升高阈值后
荧光素和荧光信号
荧光： 荧光素的电子吸收光的能量由低能态转变为高能态， 再回到低能态时释放出的光。
＜ 激发波长
Excitation wavelength
流式细胞术原理
流式细胞术原理流式细胞术（flow cytometry）是一种常用的细胞分析和分选技术，通过对悬浮细胞进行连续的、高通量的单细胞多参数分析，能够准确地获得细胞的多种信息，如大小、形态、表面标记物、蛋白质表达水平、细胞周期等。
流式细胞术的原理基于光学系统和流式细胞仪的相互配合。
其基本原理如下：1. 细胞样品制备：将待分析的细胞样品进行预处理，如去除细胞碎片、异物、血细胞混杂等，使其成为适合流式细胞仪分析的单细胞悬浮液。
2. 光源和染料：流式仪器利用一束单色、高能、激光光源对悬浮细胞进行照射。
细胞内染料的选择取决于研究目的，如荧光染料可用于标记特定蛋白质、细胞器或细胞表面受体。
3. 光学系统：经过光源照射后，激光光线经过特定的滤光片进行滤波，以选择特定波长的荧光信号。
光线通过一个透镜经过流式细胞仪的进样通道瞬间击中正在流动的细胞。
击中细胞的激光光线会被散射，产生前向散射光和侧散射光。
4. 散射光检测：前向散射光（FSC）和侧向散射光（SSC）是流式细胞仪最基本的检测参数。
FSC反映细胞的大小和形态，SSC则反映细胞的复杂度和内部结构。
5. 荧光信号检测：流式细胞仪在经过细胞后会收集产生的荧光信号。
通过特定的荧光滤光片，选择出目标染料所发射的波长范围，并通过光电倍增管转化为电信号。
这些电信号被记录下来，并转化为数据。
6. 数据分析：流式细胞术生成的数据会在计算机中进行分析和解读。
通常会用分析软件对荧光信号进行解析，进一步分析细胞表型、蛋白质表达、细胞周期等信息。
通过上述原理，流式细胞术能够快速准确地进行细胞的高通量分析和分选，为生物学、医学等领域的研究提供了重要工具。
流式细胞仪原理
流式细胞术简介一、流式细胞术发展简史流式细胞术(Flow Cytometry, FCM)是一种可以对细胞或亚细胞结构进行快速测量的新型分析技术和分选技术。
其特点是：①测量速度快，最快可在1秒种内计测数万个细胞；②可进行多参数测量，可以对同一个细胞做有关物理、化学特性的多参数测量，并具有明显的统计学意义；③是一门综合性的高科技方法，它综合了激光技术、计算机技术、流体力学、细胞化学、图像技术等从多领域的知识和成果；④既是细胞分析技术，又是精确的分选技术。
概要说来，流式细胞术主要包括了样品的液流技术、细胞的分选和计数技术，以及数据的采集和分析技术等。
FCM目前发展的水平凝聚了半个世纪以来人们在这方面的心血和成果。
1934年，Moldavan1首次提出了使悬浮的单个血红细胞等流过玻璃毛细管，在亮视野下用显微镜进行计数，并用光电记录装置计测的设想，在此之前，人们还习惯于测量静止的细胞，因为要使单个细胞顺次流过狭窄管道容易造成较大的细胞和细胞团块的淤阻。
1953年Crosland –Taylor根据雷诺对牛顿流体在圆形管中流动规律的研究认识到：管中轴线流过的鞘液流速越快，载物通过的能力越强，并具有较强的流体动力聚集作用。
于是设计了一个流动室，使待分析的细胞悬浮液都集聚在圆管轴线附近流过，外层包围着鞘液；细胞悬浮液和鞘液都在作层液。
这就奠定了现代流式细胞术中的液流技术基础。
1956年，Coulter在多年研究的基础上利用Coulter效应生产了Coulter 计数器。
其基本原理是：使细胞通过一个小孔，只在细胞与悬浮的介质之间存在着导电性上的差异，便会影响小孔道的电阻特性，从而形成电脉冲信号，测量电脉冲的强度和个数则可获得有关细胞大小和数目方面的信息。
1967年Holm等设计了通过汞弧光灯激发荧光染色的细胞，再由光电检测设备计数的装置。
1973年Steinkamp设计了一种利用激光激发双色荧光色素标记的细胞，既能分析计数，又能进行细胞分选的装置。
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散射光的作用
实验中，常利用FSC和SSC这两种参数的组合，区分不同的细 胞群体，去除碎片、死细胞和粘连细胞的干扰。
红细胞、死细胞和碎片
粒细胞 单核细胞 淋巴细胞
通过FSC/SSC散点图，gate出目标细胞进行分析。
1、流式细胞术简介
流式细胞术（Flow Cytometry，FCM）是以流式细胞仪为检 测手段的一项能快速、精确的对单个细胞(或生物学颗粒)的 理化特性进行多参数定量分析和分选的技术。
流式细胞仪（Flow Cytometer ）是集细胞与分子生物学、 流体力学、激光技术、光电子技术、计算机技术、细胞荧光 化学技术、单克隆抗体技术为一体的一种高科技仪器。
FL1
5% 默认阈值
32% 升高阈值后
荧光素和荧光信号
荧光： 荧光素的电子吸收光的能量由低能态转变为高能态， 再回到低能态时释放出的光。
＜ 激发波长
Excitation wavelength
发射波长(荧光波长) Emission wavelength
常用荧光素
<499nm ：蓝色荧光（Blue）；
流式细胞术的特点
检测对象：单细胞悬液或生物颗粒； 检测参数：多参数； 检测特点：单细胞水平分析； 检测速度：高速，最高达上万个细胞/秒； 检测结果：精度高、准确性好； 可对目标细胞进行分选；
2、流式细胞术光信号检测
光信号的类型 散射光信号：与标记荧光素无关，
是细胞的固有参数。 前向散射光(forward scatter, FSC)； 侧向散射光(side scatter, SSC)。
7-AAD（7-氨基放线菌素D 545, 647 ） 以插入的方式与DNA链的G-C碱基 对结合，不能透过活细胞膜，常用于鉴定死细胞。
DAPI（4,4,6-二脒基二苯基吲哚 358, 456） 可以非嵌入方式与DNA链上 的A-T碱基对特异性结合。变异系数明显小于其他染料，一种理想的DNA 定量染料。
标记抗体的荧光素
激发光波长 （nm）
490
发射光波长 （nm）
520
488
575
490
675
650
660
496/546
670
496/546
767
495
519
650
665
中文名
异硫氰酸荧光素 藻红蛋白 多甲藻叶绿素蛋白 别藻青蛋白 藻红蛋白-花青素5 藻红蛋白-花青素7
核酸荧光染料
PI（碘化丙啶 535, 623） 可选择性的插入核酸双螺旋碱基对中。常用 于DNA分析，需要用RNase处理细胞排除RNA对DNA荧光定量的影响；PI不 能透过活细胞膜，常用于鉴定死细胞。
500-549nm：绿色荧光（Green）；
550-584nm：黄色荧光（Yellow）； 585-615nm：橙色荧光（Orange）；
616-700nm：红色荧光（Red）；
≥700nm：远红外荧光（Far-Red）。
荧光素分子
FITC PE PerCP APC PE-Cy5 PE-Cy7 Alexa Flour 488 Alexa Flour 647
Counts
Event #
FL1 FITC
1
10
2 700
3 720
4
15
……
0…………10…………100…………1000 FITC荧光强度
直方图 Histogram
横坐标既可以是线性的，也可以是对数的。
DNA倍体分析
抗原表达分析
Overlay图
散点图 Dot Plot
散点图中每个点代表一个细胞，X轴与Y轴分别代表一种参 数，优点是比直方图直观。
散点图(Dot Plot) 伪彩图(Pseudo-color Plot) 等高线图(Contour Plot) 密度图(Density Plot) 假三维图(Pseudo 3D Plot)
• 三维图(3D Plot)
直方图 Histogram
细胞的某一单参数数据的统计分布图，横坐标表示荧光信号 或散射光信号相对强度的值，单位是道数，纵坐标一般是细 胞数。4、 流式图和流式结果
流式数据的存储：列表模式（list mode），记录了每个细 胞的所有参数的信息。
Event # FSC
SSC
FL1 FITC
FL2 PE
FL3 APC
1 100 500 10 650 4 2 110 505 700 700 6
3
90 480 720 670 10
4
95 490 15 720 15
死细胞 或碎片
粘连 细胞
死细胞
肿瘤细胞株FSC/SSC散点图
加药处理后FSC/SSC散点图
阈值：Threshold/Trigger
阈值：溶液中的杂质或者死细胞，很容易产生微小的干扰信号，所以必 须设置阈值，排除杂质、细胞碎片或体积较小的死细胞。
FSC反映细胞体积的大小，FCM应用时常选取FSC设定阈值。
Hoechst（343, 450）常见为Hoechst33342和Hoechst33258，非嵌入的方 式与DNA链上的A-T碱基对结合。能对活细胞染色，用于活细胞DNA定量分 析，如精子分选；还用于侧群细胞的分选。
PY（派若宁 560, 573） RNA染料，能进入活细胞。
AO（吖啶橙 509, 525） DNA、RNA染料，染色后DNA呈黄绿色荧光，RNA呈 橙黄色荧光，可进行DNA/RNA双参数分析。
……
每个细胞检测5个参数，那么获取10000个细胞，容量为 5×10000（字或双字）。
流式数据的显示方式
• 常用分析软件
– MACSQuantify – CellQuest – Diva – FlowJo – WinMDI – FCS Express
• 单参数直方图(Histogram) • 双参数数据显示：
荧光信号
自发荧光：微弱（核黄素、色素分子等）； 特异荧光：荧光素分子发出的的荧
光比自发荧光强很多倍。
前向散射光FSC
激光器正前方1 -6度方向上有比较强的衍射光，即前向散射 光，FSC强度是d/λ的函数( λ表示波长，d指细胞大小)， 所以FSC反映被测细胞的体积大小和活力。
侧向散射光SSC