医疗器械微生物基础知识及操作

第四节 细菌的人工培养

按培养基状态可分为下列3类。
1、固体培养基(solid medium) 在液体培养基中加入一定量凝固剂，使其成为固体状态即为固体培养基。 固体培养基常用来进行微生物的分离、鉴定、活菌计数及菌种保藏等。 2、半固体培养基(semisolid medium) 半固体培养基中凝固剂的含量比固体培养基少，培养基中琼脂含量一般为 0.2%～0.7%。半固体培养基常用来观察微生物的运动特征、分类鉴定 及噬菌体效价滴定等。 3、液体培养基(liquid medium) 液体培养基中未加任何凝固剂。在用液体培养基培养微生物时，通过振荡 或搅拌可以增加培养基的通气量，同时使营养物质分布均匀。液体培 养基常用于大规模工业生产以及在实验室进行微生物的基础理论和应 用方面的研究。
报告方式
16000 or 1.6×104 38000 or 3.8×104 27000 or 2.7×104 51000 or 5.1×104 270 or 2.7×102 31000 or 3.1×104
第二节 细菌的形态和基本结构

一、细菌的形态与大小
细菌在一定的条件下，可分为球菌、杆菌、弧菌或螺形菌， 见图1。其体积微小，但大小不一。通常以μ m作为测量单位。一 般球菌的直径约为0.8～1.2μ m，大球菌的直径可达2μ m；杆菌 长约2～3μ m，宽0.3～0.5μ m；螺形菌长1～50μ m，宽0.3-1μ m。 能产生芽胞的菌比一般不产芽胞菌要大些。
第一节 微生物及其种类
一、微生物 在自然界里，有许多肉眼看不到的、需用 光学显微镜或电子显微镜才能观察到的微小 生物，这类生物称为微生物。 尽管微生物很小，但均有其一定的形态结 构和生理功能，对外环境适应性极强，生长 繁殖迅速，且广泛存在于空气、土壤、水及 动植物的有机体中。
第一节 微生物及其种类
第四节 细菌的人工培养
(三)细菌在培养基中的生长情况 将细菌接种到液体培养基中，大多数的细菌生 长呈现均匀浑浊的状态，少数呈链状的细菌可呈沉 淀生长，专性需氧菌多生长在液体表面，形成菌膜。 在半固体培养基上，无动力(无鞭毛)的细菌可 沿穿刺线生长，呈明显的线形，周围培养基仍透明 澄清。有鞭毛的细菌可向穿刺线四周运动弥散，呈 羽状或云雾状浑浊生长，穿刺线模糊不清。故半固 体培养基可用于检查细菌有无动力。
细菌以无性分裂方式繁殖，1个细菌分裂成2个细胞，2个细 胞互相脱离为2个个体，再由2个分裂为4个，4个分裂成8个，如 此连续不断裂殖。1个菌在十几分钟或1～2 h就分裂1次。因此细 菌接种在含有营养成分的固体培养基上，经过18～24h的生长繁 殖，即有几十亿个菌云集在一起，出现称为肉眼可见的菌落群体 （CFU）。
稀释度选择及菌落总数报告方式
10-1
1 2 3 4 5 6 1365 2760 2890 无法 计数 27 无法 计数
10-2
164 295 271 4650 11 305
10-3
20 46 60 513 5 12
两稀释 度之比
— 1.6 2.2 — — —
总数
16400 37750 27100 51300 270 30500
菌落形成单位（CFU，Colony-Forming Units）指 单位体积中的细菌群落种数。
第四节 细菌的人工培养
第四节 细菌的人工培养
第四节 细菌形态的检查
根据细菌形态、结构和染色反应性可大致决定 其种属，因此，细菌形态学检查是细菌分类和鉴 定的基础。如革兰染色后，可分辨出细菌是革兰 阳性菌还是阴性菌，是球菌还是杆菌，能否形成 芽胞(因芽胞壁厚、折光性强、不易着色等，故可 在显微镜下加以识别)。所以，此法可协助查明车 间、医疗用品及各种操作环节的常见污染菌。如 污染了形成芽胞的细菌，由于该型菌类抵抗力强， 必须采用灭菌剂进行灭菌处理。
第四节 细菌的人工培养
2、 营养培养基：在基础培养基中加入特殊营养物 质，如血液、腹水、葡萄糖等，以供某些细菌的特 殊营养要求。如血平板等。 3、选择培养基：利用细菌对某类化学物质敏感性不 同，选择性抑制某些细菌，而有利于欲选细菌的生 长，从而达到分离的目的。如水质检查中的品红亚 硫酸钠培养基，伊红美蓝培养基等。 4、鉴别培养基：各细菌具不同的生化反应特性，可 利用鉴别培养基加以区别，如糖发酵试验用的含糖 含指示剂培养基，硫化氢生成试验用的醋酸铅培养 基等。
第二节 细菌的形态和基本结构
(五)细胞壁外部结构 有些细菌细胞壁外有多种结构，主要包括荚 膜、菌毛、鞭毛和芽胞等，其功能主要是提供保 护、黏附物体和细胞运动。在无菌医疗器械生产 中具有意义的是芽胞结构。
第二节 细菌的形态和基本结构
某些细菌，生长到一定时期或当外环境条件 恶劣时，菌体失去大部分水分，细胞浆逐渐浓缩， 形成圆形或椭圆形的特殊结构，称芽胞。芽胞可 位于中央或末端，有的比菌体大，有的比菌体小， 这些特征在产芽胞的菌中具有鉴别意义。
第四节 细菌的人工培养
(一) 培养方法 细菌的培养只需提供充分的营养，合适的pH、 温度和必要的气体环境，细菌即可生长繁殖。通 常培养的方法是将细菌接种适当的培养基上， 37℃温箱培养18～24 h，即可用肉眼观察细菌生 长的情况。 用固体培养基分离纯培养 1、稀释倒平板法(pour plate method) 2、涂布平板法(spread platemethod) 3、平板划线分离法(streak plate method) 4、稀释摇管法(dilutlon shake culture method)
第二节 细菌的形态和基本结构
(四)核质 细菌的细胞核沒有核膜、核仁，沒有固定形态， 这是原核生物和真核生物的主要区别。 由于细菌的核比较原始, 故一般细菌的核称原 始形态的核戓称拟(类)核。细菌核物质的主要成分 是脱氧核糖核酸(DNA), 它实际上是与高等生物细胞 核功能相似的核物质, 故又称染色质体或细菌染色 体, 还有蛋白质、磷脂、糖元和酶类等。它控制着 细菌的各种遗传性状，在繁殖活动中起着重要作用， 细菌的裂殖，首先从细胞核开始，然后再形成细胞 膜和细胞壁。
第四节 细菌的人工培养
一、微生物的分离和纯培养 了解了细菌生长的条件，即可采用人工的方法培养细菌， 以利更好地研究、控制微生物。如车间内空气中微生物的测 定，医疗用品初始污染菌的计数，生产人员手等卫生学调查 以及制造环境的菌谱调查，即是利用细菌的生长条件和特性， 进行的人工培养。 微生物通常是肉眼看不到的微小生物，而且无处不在。 因此，在微生物的研究及应用中，不仅需要通过分离纯化技 术从混杂的天然微生物群中分离出特定的微生物，而且还必 须随时注意保持微生物纯培养物的“纯洁”，防止其他微生 物的混入。在分离、转接及培养纯培养物时防止其被其他微 生物污染的技术被称为无菌技术(aseptic technique) 它是 保证微生物学研究正常进行的关键。
第三节细菌的生长条件、代谢与营养
(三)温度 温度是细菌生长的重要因素之一，各种 细菌的适宜温度范围相差很大，据此而有嗜 热(52℃)、嗜温及嗜冷菌之分。大多为嗜温 菌(15～40℃)，一般细菌的培养采用37℃。 各国药典规定需氧、厌氧菌30-35 ℃;霉菌 20-25 ℃ 。我国药典2015版终于与国际接 轨。 (四)气体 与细菌生长繁殖有关的气体主要有氧气 和二氧化碳。
医疗器械检测微生物基础知识 及操作
品管部
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前言
微生物广泛存在于自然界中，可谓是到处有
菌。在无菌医疗器械的生产过程中，由于医疗
器械的多样性与复杂性，即使在标准制造状态 下生产的产品，仍可能有微生物的污染。因此， 了解和掌握微生物方面的有关知识，将有助于 生产过程中微生物的控制和医疗用品质量的提 高。
第四节 细菌的人工培养
(二)培养基 按其用途可分为下列4大类。 1、基础培养基：含细菌所需要的基本营养成分， 可供多数细菌使用。主要有牛肉膏(0.3％)、蛋 白胨(1％)、氯化钠 (0.5％)、磷酸盐和水等配 制而成，pH 7.2～7.6，此为液体培养基。若加 入凝固剂，如2～3％琼脂，使其固态化，即为固 体培养基，细菌经接种后可形成肉眼可见的菌落。 如营养琼脂培养基。 若加0.1～0.5％琼脂，则为半固体培养基。 常用于观察细菌动力或保存菌种；如普通肉汤胶状态，为细菌进行新陈 代谢的重要场所。基本成分为水(细菌质量70%是水)、蛋白质、 核酸（核糖核酸及去氧核糖核酸）和脂类，也含有少量的糖和 无机盐。并含有一系列的酶系统。进行合成、分解、氧化、还 原反应，更新细胞内部结构和成分，维持菌体的生长、代谢等 活动。
二、微生物五大共性 体积小，面积大； 吸收多，转化快； 生长旺，繁殖快； 适应强，异变异； 分布广，种类多。

第一节 微生物及其种类
三、微生物的种类 微生物的种类有10万种以上。按其结构、组成等差异，可 分为3大类 （一）非细胞型微生物 体积微小，能通过滤菌器；只能在活细胞内生长繁殖。如病毒， 就是形体最微小，结构最简单的微生物。 （二）原核细胞型微生物 仅有原始核，无核仁和核膜；缺乏完整的细胞器。这类微生物有 细菌、衣原体、立克次体、螺旋体和放线菌。 （三）真核细胞型微生物 细胞核的分化程度较高，有核膜、核仁和染色体；胞浆内有完整 的细胞器。真菌是真核型微生物。霉菌属此类型。
第二节 细菌的形态和基本结构

特 征 两类细胞壁的特征比较 肽聚糖 类脂 外膜 壁质间隙
G+细菌 层厚 极少 缺 很薄
G－细菌 层薄 脂多糖 有 较厚
细胞状态
酸消化的效果
僵硬
原生质体
僵硬或柔韧
原生质球
对染料和抗生素的敏感性
很敏感
中度敏感
第二节 细菌的形态和基本结构
第二节 细菌的形态和基本结构
(二)细胞膜 细胞膜又称细胞质膜, 位于胞壁之内，紧包于细胞质，它 由双层磷脂和蛋白质镶嵌排列而成。其化学组成主要为脂类、 蛋白质和核糖核酸。它具有半透性，与细胞壁一起维持细胞的 通透性，具有物质转运与营养、调节菌体内外环境平衡的功能。