流式细胞仪结果分析

层流水力聚焦技术
光学系统
—Light scattering at FSC represents the particle size and area
—Light scattering at SSC depends on granularity and complexity of the particle
红 色 荧 光 强 度
绿色荧光强度
双参数直方图点图
2. 二维等高图
• 由类似地图上的等高线组成，其本质也是双参数直方图。 • 等高图上每一条连续曲线上具有相同的细胞相对或绝对数，即“等
胞等粒子的表面属性，信号强弱与细胞体积大小成正比。
前向散射光示意图
Laser
FALS Sensor
侧向散射光（side scatter, SS）：激光束照射细 胞时，光以90°角散射的讯号，用于检测细胞内部 结构属性。
侧向散射光示意图
Laser
FALS Sensor
90LS Sensor
测得的FS与SS信 号通过计算机处理， 可得到FS-SS图，由此 可仅用散射光信号对 未染色的活细胞进行 分析或分选。
荧光染料的特性
•激发波长(EXCITING) •发射波长(EMISSION)
荧光补偿
四、细胞分选原理
通过流式细胞仪进行细胞分选 主要是在对具有某种特征的细胞需 进一步培养和研究时进行的。
Байду номын сангаас
（一）分选基本原理
细胞悬液形成液流柱 压电晶体 产生机械振动
流动室振动
液流断裂成液滴
空白液滴 不充电
弃去
计算机系统 分析结果
二、散射光的测定
细胞在液柱中与激光束相交时 向周围360°立体角方向散射的光线 信号，它的强弱与细胞的大小、形 状、胞内颗粒折射等有关，主要分
为前向散射光和侧向散射光。
前向散射光（forward scatter, FS）：激光束照射细胞时，光 以相对轴较小角度(0.5°～10°)向前方散射的讯号用于检测细
特点：检测速度快、检测通量高、单细胞多参数的检测
流式流式细胞仪仪
流式细胞仪 流式细胞仪 流式细胞仪
流式细胞仪是测量染色细胞标记物荧光强度的细胞
分析仪，是在单个细胞分析和分选基础上发展起来
的对细胞的物理或化学性质（如大小、内部结构、
DNA、RNA、蛋白质、抗原等）进行快速测量并可分
类收集的高技术。
流式细胞仪可以做什么？
含细胞的液滴 充电
偏转落入收集器
（二）分选的技术要求
• 分选速度：单位时间内分选的细胞数量。与悬液中 细胞的含量成正比。 • 分选纯度：分选出的目的细胞占所有收获细胞的百 分率。 • 分选收获率：实际收获的分选细胞与设定通过测量点 的分选细胞之间的比率。与纯度成反比。 • 分选得率：从一群体细胞悬液中分辨出目的细胞的 总量，再经分选后得到目的细胞的实际得率。与 分选速度成反比。
• 单参数直方图 • 双参数直方图:点图
二维等高图 假三维等高图 • 三参数直方图 • 多参数分析
设门分析:REGION和GATE设置
（一）单参数直方图
由一维参数(散射光或荧光)与颗粒计数(COUNT)构成，反映 同样散射光或荧光强度的颗粒数量的多少。
细 胞 相 对 数 量
信道 (channel )
此为血细胞分类 的基本原理，但不能 分析表面分子。
单核细胞
中性粒细胞
淋巴细胞
光散射测量最有效用途：从非均一群体中鉴别出某些亚群
三、荧光测量
• 荧光信号由被检细胞上标记的特异性荧光染料受激发 后产生，发射的荧光波长与激发光波长不同。 • 每种荧光染料会产生特定波长的荧光和颜色，通过波 长选择通透性滤片，可将不同波长的散射光和荧光信 号区分开，送入不同的光电倍增管。 • 选择不同的单抗及染料就可同时测定一个细胞上的多 个不同特征。 • 线性放大器和对数放大器
单参数直方图
（二）双参数直方图
• 双参数直方图：纵轴和横轴分别代表被测量细胞的两个测量参数， 根据这两个参数就可以确定细胞在图上的表达位置。
• 双参数信号通常采用对数信号，最常用的是点密图，在图中，每 个点代表一个细胞，点图利用颗粒密度反映同样散射光或荧光强 度的颗粒数量的多少。
1.双参数直方图点图
流式细胞术
流式细胞术(flow cytometry, FCM)是以流式细胞仪为检测手段的 一项能快速、精确的对单个细胞理化特性进行多参数定量分析 和分选的新技术。
流式细胞术的特点
流式细胞术最大的特点是能在保持细胞及 细胞器或微粒的结构及功能不被破坏的状态下， 通过荧光探针的协助，从分子水平上获取多种 信号对细胞进行定量分析或纯化分选。
样本来源：各种细胞（如外周血，骨髓， 实体组织、悬浮或贴壁培养的细胞），微 生物，人工合成微球等。 检测大小：一般是0.5um～40um
流式细胞仪的组成
液流系统 光学系统 数据处理系统
分选系统
分析型流式细胞 仪
分选型流式细胞仪
（1液）液流流 系统
流动室
流动室（Flow cell）是液流系统的核心部件，流动室是 由石英玻璃制成，单细胞悬液在流动室里被鞘液流包绕 通过流动室内一定孔径的孔，检测区在该孔的中心，细 胞在此与激光垂直相交。
SS and FL Detector
FS Detector
Laser
（3）数据处理系统
主要由计算机及其软件组成
基本工作原理
基本过程
已标记的单细 硅化管 胞悬液和鞘液
流动室 形成稳态 喷嘴 水平激光与之 荧光染料被
单细胞液柱
垂直相交 激发发光
荧光检测系统和
收集光信号 光电倍增管
放大 脉冲信号
散射光感受系统
第二节 数据的显示与分析
• 参数：FS,SS,FL • 数据显示方式 （单参数直方图 、双参数散点图 、二维
等高图 、假三维等高图 、三参数散点图 ） • 设门分析技术
一、 参数
FS：反映颗粒的大小 SS：反映颗粒的内部结构复杂程度 FL：反映颗粒被染上的荧光数量多少
二、数据显示方式
直分析方图
光学系统
• 激光光源：气冷式氩离子激光器
• 分色反光镜：反射长/短波长，通过短/长波长
• 光束成形器：两十字交叉放置的透镜
• 透镜组：形成平行光，除去室内光
• 滤片：长通、短通、带通
• 光电倍增管：FS, SS（散射光）， （荧光）
FL1, FL2, FL3, FL4
光学系统示意图
Flow Tip