微生物学实验-1 口腔微生物的染色观察与显微镜油镜的使用;细菌的革兰氏染色

G-细菌
G+细菌
革兰氏染色机理
G+细菌由于细胞壁较厚、肽聚糖含量较高和其分子交联 度较紧密，故在用乙醇洗脱时，肽聚糖网孔会因脱水而 明显收缩，因不含脂类，故乙醇处理不能在壁上溶出缝 隙，因此，结晶紫与碘复合物仍牢牢阻留在其细胞内， 使其呈现紫色。 G-细菌因其壁薄、肽聚糖含量低和交联松散，故遇乙醇后， 肽聚糖网孔不易收缩，加上它的类脂含量高，所以当乙 醇把类脂溶解后，在细胞壁上就会出现较大的缝隙，结 晶紫与碘的复合物极易被溶出细胞壁，因此，通过乙醇 脱色后，细胞又呈无色。这时再经番红复染，就使G-细 菌染成红色，而G+细菌仍呈紫色。
实验二 口腔微生物的染色观察与 显微镜油镜的使用
思考题
实验目的
学习并初步掌握细菌的单染色法。
了解口腔内微生物的种类。
掌握油镜的使用方法。
实验原理
细菌的单染色法是微生物学中常用的一种染
色方法。
人体口腔中特别是在牙垢中，有细菌、真菌、 支原体、口腔原虫、病毒等数量众多的微生物， 用无菌牙签刮取少许牙垢，涂片染色后用显微 镜下即可观察到各类微生物的形态。
实验材料
试剂：
蒸馏水； 石碳酸复红染液；香柏油；
二甲苯
光学显微镜、灭菌牙签、载玻片
实验方法
滴水 刮取牙垢 涂片 自然干燥 火焰固定
革兰氏染色或 复红染色1分钟 水洗 干燥
镜检（油镜）
口腔微生物染色操作步骤
实验结果
注意事项
1. 载玻片要洁净无脂，否则菌液涂不开。
2. 取样时只需轻刮牙齿表面，肉眼可见少许牙垢 即可，滴水不宜过多，以免干燥时间过长；涂 片不宜过厚，以免水洗不完全造成背景杂乱。 3. 自然干燥后再进行火焰固定（以玻片不烫手为 宜）。 4. 染色过程中勿使染色液干涸。
结晶紫初染
碘液媒染
乙醇脱色
番红复染
全部细胞紫色
全部细胞紫色
G-Biblioteka Baidu菌无色 G+ 菌紫色
G- 菌红色 G+ 菌紫色
革兰氏染色各步骤时细菌的外观
结晶紫 碘液 乙醇 番红
结晶紫初染
碘液媒染
乙醇脱色
番红复染
实验材料
菌种 大肠杆菌 （Escherichia coli）
金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）
实验报告
口腔中的微生物 10×100
思考题
1．油镜观察时为何要使用香柏油？油镜的放 大原理是什么？为何要等载玻片上的水分完 全干燥后才进行油镜观察？ 2．谈谈本次实验过后，你对口腔中微生物的 认识。
涂片方法示意图
n=1.515 a 空气n=1
λ 分辨率 D= —— 2NA a 数值孔径 NA＝n×sin— 2
电源
电源
显微镜油镜的使用与保护
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
插上电源插头，打开显微镜电源开关。 调节显微镜光源。 先用低倍镜、高倍镜查找标本视野，下降载物台约2cm ， 加香柏油一滴于标本的待检部位，换用油镜观察。 换用油镜后，眼睛从侧面注视油镜头，缓慢上升载物台至 油圈不再扩大为止，此时镜头几乎与装片接触，但不可压 及装片。 观察标本时，双眼同时挣开，左眼观察，右眼画图。 油镜用毕，转动粗调将载物台下降，取下标本，用擦镜纸 沾少许二甲苯将镜头擦净，然后再用擦镜纸擦去二甲苯。 使各部分还原，物镜镜头呈八字形，光源强度调至最暗， 关闭电源，罩上防尘罩，收拾干净台面。
微生物学实验
微生物学实验应当掌握
1、微生物的观察方法（制片、染色、油 镜的使用）
2、微生物的培养方法（培养基配制、分 装、包扎、灭菌） 3、无菌操作技术（火焰灭菌、倒平板、 划线、涂平板、接种）
本课程的成绩考核：
基础实验：60%
由单个实验的成绩相加组成。每次实验由实验 指导老师根据出勤、实验操作、实验报告等进 行评定，具体比例为：实验出勤及实验态度占 20％；实际操作30％；实技能考核30％；实验 报告占20％。 自主设计实验：40% 设计实验方案 实验操作 总结
实验报告
Escherichia coli 10×100
Staphylococcus aureus 10×100
混合菌 10×100
思考题
1．通过本实验你认为哪些环节会影响革兰氏 染色结果的正确性？其中最关键的环节是什 么？
实验目的
实验原理
微生物学实验-1
实验材料
实验方法 实验结果 注意事项 实验报告
实验结果
大肠杆菌(G-)
金黄色葡萄球菌(G+)
大肠杆菌(G-) 和金黄色葡萄球菌(G+)
注意事项
1. 涂片不宜过厚，以免脱色不完全造成假阳性；自然干燥 后再进行火焰固定（以玻片不烫手为宜）。 2.染色过程中勿使染色液干涸。
3.乙醇脱色是革兰氏染色操作的关键环节，脱色不足阴性
菌被误染成阳性菌；脱色过度，会使阳性菌被误染成阴 性菌。 4. 选用培养18~24h菌龄的细菌为宜。若菌龄太老，由于菌 体死亡或自溶常使会使革兰氏阳性菌转成阴性反应。
试剂：
蒸馏水； 草酸铵结晶紫染液 ；卢戈氏碘液
95%乙醇； 番红复染液；香柏油；二甲苯 光学显微镜
实验方法
滴水 取菌 涂片 自然干燥 火焰固定
结晶紫染色1分钟 乙醇脱色 （20~30秒） 水洗 碘液1分钟
水洗
水洗
番红1分钟
水洗
干燥
镜检 （油镜）
革兰氏染色操作步骤
E.coli
混合菌
S. aureus
实验目的
实验原理
微生物学实验-1
实验材料
实验方法 实验结果 注意事项 实验报告
实验一 细菌的革兰氏染色
思考题
实验目的
1. 了解革兰氏染色法的原理及其在细菌 分类鉴定中的重要性。 2. 学习并掌握革兰氏染色技术，进一步 熟练光学显微镜油镜的使用技术。
实验原理
革兰氏染色法（Gram staining） 是微生物学中常用的一种染 色方法，该染色法由丹麦医 生（Christian Gram）于1884 年创立，故名。