蜂蜜中氯霉素的检测

合集下载

蜂蜜中的氯霉素的测定

蜂蜜中的氯霉素的测定方法：SPE基质：蜂制品应用编号：101238化合物：氯霉素固定相：ProElut PLS色谱柱/前处理小柱：ProElut PLS 60mg / 3ml 50/pkg商品编号：68003样品前处理：1、提取称取10 g 蜂蜜于50 mL 离心管中，加入10 mL 水，于涡旋混合器上混合3 min，待样品完全溶解后加入20 mL 乙酸乙酯，高速涡旋混合5 min，3000rpm 下离心5 min，上层溶液转入100 mL 烧瓶中。

下层溶液再加入20 mL 乙酸乙酯，高速涡旋混合5 min，3000 rpm 下离心5 min，合并两次上层液于同一烧瓶中，减压浓缩至干，用3×1 mL 20% 的甲醇水溶液溶解残渣，待净化。

2、净化a 活化：依次用3 mL 甲醇和3 mL 水活化ProElut PLS 60 mg/3 mL (Cat.#68003)，流出液弃去；b 上样：将待净化的样品液加入柱中，流出液弃去；c 淋洗：用3 mL 20% 甲醇水溶液淋洗，淋洗液弃去，并将PLS 柱抽干；d 洗脱：用3 mL 甲醇洗脱，收集洗脱液；e 重新溶解：在40 ºC 下用氮气将洗脱液吹至近干，然后用1 mL 40% 甲醇水溶液定容，供HPLC 分析色谱条件：色谱柱：Diamonsil C18(2) 250 x 4.6 mm ID, 5 μm (Cat. #99603) HPLC应用101320作者：迪马科技文章出处：P109关键字：蜂蜜，氯霉素，SPE，ProElut PLS 摘要：适用于蜂蜜中氯霉素的测定。

图例： 1. 氯霉素。

WB02 蜂蜜中氯霉素残留快速检测背景知识概要

农产品与食品质量检测技术教学资源库
蜂蜜中氯霉素残留快速检测背景知识
1蜂蜜定义按世界卫生组织（WHO)和联合国粮农组织（FAO)所属的食品法典委员会（CAC)所下的定义：
蜂蜜是蜜蜂从活的植物蜜腺或其他部位采来的花蜜，经蜜蜂充分酿制、储存于巢房的甜蜜物质。

这个定义从蜂蜜的来源、蜂蜜的成熟过程和蜂蜜成品的性质来规定蜂蜜的含义：一是蜂蜜的来源系植物蜜腺的花蜜，也包括甘露蜜，但不包括味糖而产生的“糖蜜”；二是蜂蜜的成熟过程系蜜蜂经过酿制储存在蜂巢内，蜜蜂刚采集的花蜜不是蜂蜜，未成熟的也不是蜂蜜；三是蜂蜜成品系一种具有甜味的物质。

从这个定义可以看出，蜂蜜离不开蜜蜂、植物和蜜蜂的酿造，离开这几个条件就不能算是蜂蜜，所以蜂蜜是无法人造的。

2为什么蜂蜜中会含有氯霉素？
蜜蜂容易感染一种细菌从而产生“幼虫腐烂病”，这种病对蜂产业危害极大，可能导致整个蜂群死亡，而且这种细菌很难完全清除，需要不断处理。

氯霉素是一种强力抗生素，只允许作为药物用于人，而且只在其他手段都无效的情况下使用。

有的蜂场用它来处理蜂房控制幼虫腐烂病，就可能导致蜂蜜中检出氯霉素。

3氯霉素对人体有哪些影响？
氯霉素作为抗生素很高效，但是它可能带来严重的副作用。

有的人对它很敏感，只需要摄入很少的量，就能对骨髓造成伤害，不能产生足够的红细胞、白血细胞或血小板，也就是再生障碍性贫血。

广州市场润至园蜂蜜产品中检出含有氯霉素

广州市场润至园蜂蜜产品中检出含有氯霉素记者17日从广州市工商局获悉，该局近日对广州市场销售的主要品牌蜂蜜产品进行了抽检，其中，润至园等3个品牌的3批次样品被检出抗生素氯霉素，长期食用将导致人体再生障碍性贫血症，并可能引起人体体内菌群失调及产生耐药性。

记者在不合格产品名单中看到，3批次问题样品分别为：“润至园”老巢蜜膏、“千红”杂花蜜、“蜜蜂生活”高原雪苕蜜。

工商部门表示，是一种由委内瑞拉链丝菌产生的广谱抗生素，属抑菌剂，对很多不同种类的微生物均有作用。

按照《食品动物禁用的兽药及其它化合物清单》(农业部公告第193号)规定，氯霉素被禁止使用在食品、动物方面。

温总理前段时间说了一句话叫：“民以食为天，食以安为先！”温总理这句话，说得很透彻、很深邃。

“安”是什么，“安”代表的是一份安全、一份安定、一种和谐与祥和，对整个国家来说，吃的是这样，住的也是这样。

而如何“安”，怎么“安”，却任重而道远——“安”靠的是“足食”，“安”靠的是“足兵”，“安”更靠的是“民信”。

孔子说：“士不可以不弘毅，任重而道远。

仁以为已任，不亦重乎？死而后己，不亦远乎？”整个国家、整个社会的和谐，靠的是一份“仁”。

“仁”是什么，“仁”就是对别人，对外界的事物有着一份恻隐之心。

这些商贩对上千只生禽没有恻隐之心，只能说明，他们是对自己身边的人没有恻隐之心，他们由于利欲熏心，已丧失了最起码的是非观、道德观，不管是潜规则还是明规则，这种意识都是社会危险信号的一个缩影。

氯霉素是一种抑菌类抗生素，由大卫·戈特利布（David Gottlieb）于1947年从南美洲委内瑞拉的土壤内的委内瑞拉链霉菌（Streptomyces venezuelae）成功分离，再于1949年合成并引入临床试验。

是世界上首种完全由合成方法大量制造的广谱抗生素，对很多不同种类的微生物均起著作用。

它因价钱低廉的关系，现时仍然盛行于一些低收入国家；但在其他西方国家经已甚少使用，这是由于它的副作用的关系：会引致致命的再生不良性贫血。

蜂蜜中氯霉素含量标准

蜂蜜中氯霉素含量标准1. 范围本标准规定了蜂蜜中氯霉素含量的测定方法、限量规定、检验方法、检验规则、标识、标签和说明书的要求，以及包装、运输和贮存的要求。

2. 规范性引用文件本标准引用了下列文件：《食品安全国家标准食品中氯霉素残留量的测定方法》《食品安全国家标准食品中兽药最大残留限量》3. 术语和定义本标准采用下列术语和定义：氯霉素：是一种广谱抗菌药物，常用于治疗各种感染性疾病。

蜂蜜（Honey）：是一种天然甜味物质，主要由蜜蜂采集花蜜、花粉等原材料经过发酵、酿造而成。

氯霉素残留量：指在食品中检测到的氯霉素的含量。

4. 氯霉素含量的测定方法本标准采用《食品安全国家标准食品中氯霉素残留量的测定方法》中规定的方法，对蜂蜜中氯霉素含量进行测定。

该方法包括以下步骤：a. 样品处理：称取适量蜂蜜样品，加入适量的乙酸乙酯进行萃取，萃取液经旋转蒸发浓缩至干，用流动相溶解定容。

b. 色谱条件：采用高效液相色谱法，色谱柱为C18柱，流动相为甲醇-水（60:40），流速为1.0 mL/min，检测波长为280 nm，进样体积为20 μL。

c. 标准曲线的制作：分别配制不同浓度的氯霉素标准溶液，进样分析，以峰面积与浓度绘制标准曲线。

d. 样品测定：将处理后的样品进样分析，根据保留时间确定氯霉素的峰，通过峰面积计算样品中氯霉素的含量。

5. 氯霉素含量的限量规定根据《食品安全国家标准食品中兽药最大残留限量》的规定，蜂蜜中氯霉素残留量应不得超过0.1μg/kg。

6. 检验方法本标准采用《食品安全国家标准食品中氯霉素残留量的测定方法》所规定的检验方法对蜂蜜中氯霉素含量进行检验。

该方法包括以下步骤：a. 按照4.1.3的规定制备样品溶液。

b. 将样品溶液注入高效液相色谱仪中，按照4.1.4的规定进行色谱分析。

c. 根据保留时间确定氯霉素的峰，通过峰面积计算样品中氯霉素的含量。

d. 根据计算结果与限量规定进行比较，判断样品是否符合要求。

农产品快速检测技术W1302-4 速测卡快速检测蜂蜜中的氯霉素-微教材

《农产品/食品快速检测技术》课程-微教材知识讲解1、背景知识（1）蜂蜜定义：蜂蜜是蜜蜂从活的植物蜜腺或其他部位采来的花蜜，经蜜蜂充分酿制、储存于巢房的甜蜜物质。

从这个定义可以看出，蜂蜜离不开蜜蜂、植物和蜜蜂的酿造，离开这几个条件就不能算是蜂蜜，所以蜂蜜是无法人造的。

（2）为什么蜂蜜中会含有氯霉素？蜜蜂容易感染一种细菌从而产生“幼虫腐烂病”，这种病对蜂产业危害极大，可能导致整个蜂群死亡，而且这种细菌很难完全清除，需要不断处理。

氯霉素是一种强力抗生素，只允许作为药物用于人，而且只在其他手段都无效的情况下使用。

有的蜂场用它来处理蜂房控制幼虫腐烂病，就可能导致蜂蜜中检出氯霉素。

（3）氯霉素对人体有哪些影响？氯霉素作为抗生素很高效，但是它可能带来严重的副作用。

有的人对它很敏感，只需要摄入很少的量，就能对骨髓造成伤害，不能产生足够的红细胞、白血细胞或血小板，也就是再生障碍性贫血。

2、胶体金速测卡快速检测蜂蜜中氯霉素的原理蜂蜜样品复溶后滴入检测卡的样品孔中，与事先固定于硝酸纤维素膜测试区（T区）的抗原和控制区（C区）的Ⅱ抗反应，根据T区，C区的颜色深浅对比判读结果。

边学边练任务：速测卡快速检测蜂蜜中的氯霉素样品：蜂蜜参考资料：北京普析通用仪器有限公司氯霉素快速检测条（蜂蜜）产品编号：3C20205-001、列出你完成此任务的思路要点：物品准备，样品前处理，检测操作，结果判读2、列出物品准备清单设备：天平、蜗旋仪、离心机、氮吹仪、移液器等。

试剂：氯霉素快速检测试纸条、氯霉素微孔试剂、样品稀释液、乙酸乙酯等试剂。

3、完成样品前处理要点：离心管上做好标记，无结晶的蜂蜜样品，直接将其搅拌均匀，称取4g待检蜂蜜，加入2mL纯净水，完全振荡溶解。

酶联免疫法测定蜂蜜中氯霉素残留量(二)

酶联免疫法测定蜂蜜中氯霉素残留量（二）7.1 提取称取2g试样，精确到0.01g，置于25 mL具塞离心管中，加入4 mL水和4 mL(4.2)，在液体混匀器上充分混匀2 min，使试样彻低溶解。

在振荡器上振荡10 min，以4000r/min离心10 min,精确吸取上层1 mL于10 mL具塞试管(5.7)中，用氮气吹干仪在50℃吹干。

加入0.5mL缓冲溶液(4.1.8)溶解残渣，供酶标仪测定。

此溶液含试样量0.5g，稀释系数为1。

7.2 测定条件以下全部操作应在20℃～24℃室温下举行。

7.2.1 酶标仪测定条件：酶标仪测定波长为450 nm。

7.2.2 洗板条件如下： 7.2.2.1 洗板机洗板条件：采纳条式抽干和注满，洗涤次数八次，每次注水量为250uL～350uL。

7.2.2.2 入工洗板条件：洗涤次数五次以上，每次注水量为250 uL。

7.2.3 氯霉素试剂盒中全部试剂的温度均应回升至室温(20℃～24℃)后方可用法。

标准溶液(4.1.2),氯霉素酶标志物溶液(4.1.3)和氯霉素抗体溶液(4.1.4)等均按1份试剂＋10份缓冲溶液举行稀释与制备。

每次测定所用的稀释液均应现配现用。

7.2.4 将测定需用的微孔板备齐并插入微孔架上，记录标准及样品等在微孔架上的位置(模板图)。

7.3 测定测定中吸取不同的试剂和样品溶液时应更换吸头。

7.3.l 分离吸取50uL稀释的酶标志物、氯霉素标准溶液、样品溶液和氯霉素抗体等按模板图位置，依次加入各自的微孔底部，然后，用封口膜密封孔条以防溶液挥发。

持微孔板在台面上以圆周运动方式混匀后，于20℃～24℃避光孵育2h。

7.3.2 将微孔架置于洗板机上，按设定的洗板程序洗板后，将微孔架反扣在吸水纸上并反复拍打。

此步骤既要去除微孔中过多的残液，又不能使微孔干燥。

7.3.3 快速加入50uL酶基质和50uL发色剂于微孔底部，然后，持微孔板在台面上以圆周运动方式混匀后，于20℃～24℃避光孵育30min。

液相色谱-串联质谱测定蜂蜜中的氯霉素残留

液相色谱-串联质谱测定蜂蜜中的氯霉素残留刘谦;颜红;王雪涛;淑英;王锋;刘丽丽【摘要】建立肠衣中氯霉素残留的高效液相色谱-串联质谱联用测定方法.该方法经乙酸乙酯和氨水提取样品,以XTerra MS C18柱(100 mm× 2.1mm,3μm)分离,流动相为乙腈-水(33∶67,V/V),电喷雾负离子模式,多反应监测采集模式(MRM)下检测.该法的检出限为0.1 μg/kg,添加水平为0.1～1.0μg/kg时,加标回收率在99.4～115％之间,相对标准偏差为3.34％.【期刊名称】《中国蜂业中旬刊（学术）》【年(卷),期】2012(063)002【总页数】3页(P73-75)【关键词】高效液相色谱—串联质谱法;氯霉素;残留;蜂蜜【作者】刘谦;颜红;王雪涛;淑英;王锋;刘丽丽【作者单位】保定出入境检验检疫局,保定071051;保定出入境检验检疫局,保定071051;保定出入境检验检疫局,保定071051;保定出入境检验检疫局,保定071051;保定出入境检验检疫局,保定071051;保定出入境检验检疫局,保定071051【正文语种】中文【中图分类】S896.8蜂蜜是由蜜蜂采集植物蜜腺分泌的汁液酿成。

中国大部分地区均有生产。

以稠如凝脂、味甜纯正、清洁无杂质、不发酵者为佳。

蜂蜜的主要成分为糖类，其中60～80%是人体容易吸收的葡萄糖和果糖，主要作为营养滋补品、药用和加工蜜饯食品及酿造蜜酒之用，也可以替食糖作调味品。

氯霉素(Chloramphenicol)作为一种广谱的抗生素药，对需氧菌、厌氧菌、衣原体、支原体、立克次氏体等有效，且价格较低，因此早期曾被广泛用于人、畜多种传染性疾病的治疗。

经临床研究发现，氯霉素对人体有严重的副作用，它能抑制人体骨髓造血功能而引起再生障碍性贫血、粒状白细胞缺乏症和血小板减少症等疾病，它在人体、动物肌体中蓄积的时间较长，若长期使用还会出现视神经炎或末梢神经炎等，因此对人类的健康构成了潜在的危害。

WB01 蜂蜜中氯霉素残留的快速检测操作说明概要

蜂蜜中氯霉素残留的快速检测操作说明1样品前处理无结晶的蜂蜜样品，直接将其搅拌均匀，有结晶的样品，在密闭状态下，于50～80℃水浴，待结晶全部融化后搅匀。

称取4g待检蜂蜜，加入2mL纯净水，完全振荡溶解后加入8mL乙酸乙酯，振荡5min，静置分层。

转移5mL上层乙酸乙酯于干净离心管中，若上层乙酸乙酯不足5mL，则可先3000r/min 离心5min后取上层乙酸乙酯，然后50℃下氮气吹干乙酸乙酯。

加入600μL样品稀释液于离心管中，涡旋振荡，直至完全溶解管壁残留，待检。

2检测步骤使用前将试纸条、微孔试剂和待检样本恢复至室温（20℃～25℃）。

将所需微孔试剂置于空微孔板架中。

用移液器移取200μL待检样本于微孔试剂中，缓慢抽吸至检测样品与微孔试剂充分混匀，大约5～6次，使用计时器，开始计时。

室温（20℃～25℃）孵育2min，从试剂桶中取出所需数量的试纸条并插入微孔试剂中，使印有LOGO手柄端向上，另一端向下并充分浸入溶液中，开始计时。

再次室温（20℃～25℃）反应5min，取出试纸条并在2min内进行结果判读，其他时间判读结果无效。

3 结果判读阴性：T线比C线显色深或一样深，表示样品中待检测物质浓度低于检测限，或不含待检测物质。

阳性：T线比C线浅或T线无显色，则表示样品中待检测物质浓度高于检测限。

无效：C线不显色，无论T线是否显色，该检测均判为无效。

4注意事项打开微孔试剂时，请轻轻揭开密封膜，切勿用力迅速揭开，以免有粉末飞出；微孔试剂打开后请在一个小时内使用完，否则失效，影响检测效果；在产品未使用完之前，切勿将桶中干燥剂丢弃；检测时避免阳光直射和风扇直吹；所检测牛奶样品必须为均匀液体，不能有结块、发酸和沉淀等现象；本检测方式为筛选方法，如遇阳性样本，请按照规定的标准进行取样，用确证法进行确证。

蜂蜜中喹诺酮类、四环素类、氯霉素类抗生素的液相色谱-串联质谱测定法

蜂蜜中喹诺酮类、四环素类、氯霉素类抗生素的液相色谱-串联质谱测定法杜洪淼(北京市产品质量监督检验院，北京101300)[摘要]建立同时测定蜂蜜中喹诺酮类、四环素类、氯霉素的液相色谱-串联质谱法。

样品以乙腈-水(0.2 %甲酸)(体积比80∶20)溶液超声提取，离心，取上清液过Oasis PRIME HLB固相萃取柱，流出液2 mL氮吹近干，用1 mL 0.1%甲酸水∶乙腈(95∶5)定容至1 mL，过PTFE滤膜，LC-MS/MS正负离子同时扫描测定喹诺酮类、四环素类、氯霉素类抗生素的含量。

该方法的线性范围0.5~50 ng/mL，相关系数＞0.995，加标0.5~20.0 μg/kg，回收率为71.5 %~104.5 %，RSD为1.9 %~9.6 %，喹诺酮类检出限为1.0 μg/kg，四环素类检出限为2.0 μg/kg，氯霉素类检出限为0.5 μg/kg。

结论：该方法灵敏、快速、准确，适用于蜂蜜的喹诺酮、四环素、氯霉素检测。

[关键词]蜂蜜；喹诺酮类；四环素类；氯霉素类；正负离子[中图分类号]O65 [文献标识码]A [文章编号]1007-1865(2020)11-0202-04 Simultaneous Determination of Quinolones Tetracyclines and ChloramphenicolsinHoney by UPLC-MS/MSDu Hongmiao(Beijing Products Quality Supervisionand Inspection Institute, Beijing 101300, China) Abstract:A method for simultaneous determination ofQuinolones Tetracyclines and Chloramphenicols in honey was developed by means of a series mass spectrometry(MS)methods. After the sample was ultrasound extracted from acetonitrile-water(0.2% formate)(volume fraction 80∶20)aqueous solution, centrifugation, Purification of samples with Oasis Prime HLB, Take out 2mL of outflow liquid, blow it to dryness with nitrogen, use 1mL of water containing 0.1% formic acid∶acetonitrile (95∶5) to constant volume to 1mL, filter it with PTFE filter membrane, The UPLC-MS/MS method detection of positive and negative ions was used to qualitatively and quantitatively determine multiple antibiotic residues in honey simultaneously.The results showed that the linear relationship of the drugs to be tested was good in the range of 0.5ng/mL to 50ng/mL.and the correlation coefficient(r)was all above 0.995.Addition recovery experiments were conducted at 0.5~20.0μg/kg concentration levels,the average recovery rate was between 71.5%and 104.5%,and the relative standard deviation ranged from 1.9% to 9.6%.The detection limit of the developed method reached up to Quinolones1μg/kg.Tetracyclines2μg/kg.Chloramphenicols0.5μg/kg.The method has high sensitivity,short analysis time and strong corroboration ability,which is recommended to be used in simultaneous determination of Quinolones, tetracyclines and Chloramphenicols residues.Keywords:honey；Quinolones；Tetracyclines；Chloramphenicols；detection of positive and negative ions蜂蜜中含有丰富的果糖和葡萄糖，不仅能够改善人体的血液循环、补充营养和恢复人体疲劳，还能起到润肺止咳、消积通便等作用，因此，随着人民生活水平逐渐提高，蜂蜜的消费需求量逐年增大。

蜂蜜中氯霉素残留量的直接竞争ELISA检测

蜂蜜中氯霉素残留量的直接竞争ELISA检测一、试验目的把握蜂蜜中氯霉素残留的挺直竞争EL[SA检测的原理和办法。

二、试验原理挺直竞争ELISA是ELISA的一种。

样品中残留的氯霉素与氯霉素酶标志物共同竞争包被于酶标板微孔内的氯霉素抗体，形成的酶标志抗原抗体复合物被吸附于微孔内，加底物显色后，于450nm处测定吸光度，吸光度大小与样品中氯霉素的残留量成反比。

以标准品为对比，按照吸光度计算出样品中氯霉素的残留量。

三、仪器与试材 1．仪器与器材酶标仪、各种规格的移液器、离心机、氮气吹干仪、液体混匀器、振荡器等。

2．试剂除特殊注明外，试验中所用试剂均为分析纯，水为去离子水或蒸馏水。

(1)ELISA试剂盒：包含包被有抗氯霉素抗体的96孔酶标板、氯霉素标准溶液、氯霉素酶标志物溶液、酶底物、发色剂、反应终止液、缓冲溶液等。

(2)试剂：乙酸乙酯(重蒸馏)。

3．试验材料 2～3种蜂蜜，各1()00g。

四、试验步骤 1．样品的预处理对无结晶的试验室样品，将其搅拌匀称。

对有结晶的试验室样品，在密闭的状况下，置于不超过60℃的水浴中加热、振荡，待样品所有溶化后搅匀，冷却至室温。

取500g作为试验样品。

制备好的试样置于样品瓶中，密封，并加以标识，于室温下保存。

2．样品提取取2．00g样品，置于25mL具塞离心管中，加4mL水和4mL乙酸乙酯，于液体混匀器上充分混匀2min，使试样彻低溶解。

在振荡器上振荡10min，以4000r ／min离心10min。

吸取上层乙酸乙酯1mL于10mL具塞试管中，用氮气吹干仪在50℃吹干。

加O．5mL缓冲溶液溶解残渣，得样品提取液。

3．测定 (1)标准曲线的绘制①分离吸取50μL系列稀释的氯霉素标准溶液与适当稀释的酶标志氯霉素，加入酶标板微孔内，重复数为3，混匀后，于37℃避光保温1h。

以稀释缓冲溶液洗酶标板5次，每次3min，扣干。

②加50μL酶底物与50μL发色剂于微孔内，混匀，于37℃避光保温30min。

蜂蜜中氯霉素残留量的不确定度评定

第48卷第14期2020年7月广㊀州㊀化㊀工Guangzhou Chemical IndustryVol.48No.14Jul.2020蜂蜜中氯霉素残留量的不确定度评定杨㊀涛,袁㊀辉(新疆产品质量监督检验研究院,新疆㊀乌鲁木齐㊀830011)摘㊀要:采用液相色谱-串联质谱法检测蜂蜜中氯霉素的残留量,依据GB /T 18932.19-2003建立分析方法和数学模型,分析该方法不确定度的来源㊂通过对标准溶液及样品前处理过程引入的各不确定度分量来源的分析㊁计算和合成,结果表明,对测量结果不确定度主要的影响因素为标准曲线拟合㊂经过最终合成评定,蜂蜜中氯霉素残留量的结果可表示为(2.79ʃ0.28)μg /kg,k =2㊂关键词:氯霉素;蜂蜜;不确定度㊀中图分类号:TS207.3㊀文献标志码:A 文章编号:1001-9677(2020)14-0114-03㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀第一作者:杨涛(1980-),男,高级工程师,硕士,研究方向:食品安全与质量研究㊂Uncertainty Evaluation of Chloramphenicol Residues in HoneyYANG Tao ,YUAN Hui(Xinjiang Product Quality Supervision and Inspection Institute,Xinjiang Urumqi 830011,China)Abstract :The liquid chromatography -tandem mass spectrometry was used to detect the residual amount of chloramphenicol in honey.The analytical method and mathematical model were established in accordance with GB /T 18932.19-2003to analyze the source of uncertainty of this method.Through the analysis,calculation and synthesis of the sources of uncertainty components introduced in the standard solution and sample pre -treatment process,the results showed that the main factor affecting the uncertainty of the measurement results was the standard curve fitting.After final synthesis assessment,the result of chloramphenicol residue in honey can be expressed as (2.79ʃ0.28)μg /kg,k =2.Key words :chloramphenicol;honey;uncertainty蜂蜜因含有丰富的果糖㊁葡萄糖㊁多种维生素㊁有机酸等对人体有益的矿物质,被誉为大自然中最完美的营养食品㊂氯霉素是一种强力抗生素,能有效控制蜂群感染,减少蜜蜂死亡情况,但如果过量使用氯霉素,会导致部分氯霉素在蜂蜜中残留㊂氯霉素作为一种广谱高效抗生素,有严重的副作用,它人类的毒性较大,因此,中华人民共和国农业部公告第235号‘动物性食品中兽药最高残留限量“中严格规定动物性食品中氯霉素不得检出㊂目前,蜂蜜中氯霉素的检测标准主要有:微生物法㊁酶联免疫法㊁气相色谱-质谱法㊁液相色谱-串联质谱法㊂目前报道的有关蜂蜜中氯霉素残留量不确定度评定主要依据SN /T 1864-2007‘进出口动物源食品中氯霉素残留量的检测方法液相色谱-串联质谱法“[1],而国内大多数检测机构采用的检测方法是GB /T 18932.19-2003‘蜂蜜中氯霉素残留量的测定方法液相色谱-串联质谱法“[2],本文作者结合前期不确定度研究成果[3],现根据此检验方法分析蜂蜜中氯霉素残留量不确定度的来源㊂1㊀实㊀验1.1㊀原㊀理用乙酸乙酯提取其中的待测组分,浓缩后用水溶解并过HLB 小柱净化,液相色谱-串联质谱仪测定,外标法定量㊂1.2㊀主要仪器与试剂TSQ GUANTIS 高效液相色谱-质谱/质谱仪,美国thermofisher 公司;电子天平(感量0.1mg,感量0.01g),德国Sartorius 公司;固相萃取装置,美国J2Scientific 公司;离心机,上海安亭㊂氯霉素标准品(99%),德国Dr 公司;乙腈㊁甲醇㊁乙酸乙酯(色谱纯),德国默克公司;其它试剂为分析纯;超纯水由美国millipore 纯水仪制得;蜂蜜样品为市场中购买㊂1.3㊀检测方法1.3.1㊀提㊀取准确称取5g 试样(精确到0.01g)于50mL 离心管中,加入5mL 水,摇匀使其溶解;加15mL 乙酸乙酯提取,离心后准确吸收取12mL 乙酸乙酯溶液进行浓缩,尽干,用5mL 水溶解待净化㊂1.3.2㊀净㊀化用5mL 乙酸乙酯洗脱㊂洗脱液在50ħ下用氮吹仪浓缩至近干,用1mL 乙腈水溶液(2+8)溶解残渣,用0.22μm 滤膜过滤后上仪器测定㊂1.3.3㊀色谱条件流动相为乙腈:水溶液(2ʒ8),流速0.3mL /min,柱温40ħ,进样量:5μL㊂质谱条件:电喷雾负离子模式,多反应第48卷第14期杨涛,等:蜂蜜中氯霉素残留量的不确定度评定115㊀监测模式(MRM)㊂1.4㊀不确定度来源及数学模型根据检验方法,不确定度主要来源如下:一是标准溶液引入的不确定度,包含标准品纯度㊁称量㊁标准溶液配制以及标准曲线拟合等分量;二是样品前处理过程引入的不确定度,包括样品的称量㊁定容以及待测组分提取回收率等分量㊂依据标准检验方法和评估指南[4]本试验中氯霉素计算数学模型为:X =c ˑV m ˑf式中:X 试样中氯霉素的含量,μg /kgm 试样质量,g V 试样提取液总体积,mL c 从标准曲线上测得样品中氯霉素的质量浓度,ng /mL f 样品中待测组分回收率,%2㊀不确定度评定2.1㊀标准溶液引入的不确定度2.1.1㊀标准品纯度引入的不确定度根据标准品证书提供的内容,氯霉素纯度大于99%,按照矩形分布,其相对不确定度为:u rel (std )=(1-0.99)/3=0.00582.1.2㊀标准品称量引入的不确定度当称取氯霉素标准品10mg 时所使用的天平最大允许误差为ʃ0.1mg,按照矩形分布,其相对不确定度为:u (s )=0.1mg /3=0.058mg u rel (s )=0./10=0.00582.1.3㊀标准溶液稀释配制过程中由移液器和玻璃量器引入的不确定度系列标准溶液的稀释配制要使用不同规格的移液器和玻璃量器,依据JJG 646-2006‘移液器检定规程“[5]㊁JJG 196-2006‘常用玻璃量器检定规程“[6],其引入的不确定度见表1㊂表1㊀校准玻璃量器和移液器引入的不确定度Table 1㊀Uncertainty introduced by glass gauge andpipette calibration玻璃量器与移液器最大允许误差定容或移取体积相对标准不确定度A 级100mL 单标容量瓶ʃ0.10mL100mLu V 1rel =0.000581000μL 移液器ʃ1.0%1000μL u V 2rel =0.005771000μL 移液器ʃ1.0%500μL u V 3rel =0.00577100μL 移液器ʃ2.0%100μL u V 4rel =0.01155根据表1中的数据,结合各自使用的次数,则移液器和玻璃量器引入的相对不确定度为:u rel (V 1)=7u 2V 1rel +4u 2V 2rel +u 2V 3rel +3u 2V 4rel=0.02392.1.4㊀标准溶液稀释过程中温度引入的不确定度在标准溶液稀释配制过程中,环境温度控制在(20ʃ2)ħ,标准溶液是用乙腈稀释配制,其在20ħ时的膨胀系数为1.37ˑ10-3mL /ħ,依据矩形分布,移液器和玻璃量器由于温度校准引入的不确定度见表2㊂表2㊀温度校准引入的不确定度Table 2㊀Uncertainty introduced by temperature calibration玻璃量器与移液器定容或移取体积计算公式相对标准不确定度A 级100mL 单标容量瓶100mL 100ˑ5ˑ1.37ˑ10-3/31/2/100u T 1rel =0.003951000μL 移液器1000μL 1000ˑ5ˑ1.37ˑ10-3/31/2/1000u T 2rel =0.003951000μL 移液器500μL 500ˑ5ˑ1.37ˑ10-3/31/2/500u T 3rel =0.00395100μL 移液器100μL100ˑ5ˑ1.37ˑ10-3/31/2/100u T 4rel =0.00395由表2中的数据结合使用次数,由于温度变化引入的相对不确定度:u rel (T 1)=7u 2T 1rel +4u 2T 2rel +u 2T 3rel +3u 2T 4rel=0.01532.1.5㊀最小二乘法拟合标准曲线的不确定度将标准溶液稀释为1㊁2㊁5㊁10㊁20ng /mL 五个梯度浓度,每个浓度上机测定3次,即n =15,采用最小二乘法对标准溶液浓度/平均峰面积对应的曲线拟合,得到其相对不确定度㊂标准溶液系列质量浓度与对应峰面积的数据见表3㊂表3㊀液相色谱-串联质谱法测定氯霉素的标准曲线数据Table 3㊀Calibration curve data of chloramphenicol by liquidchromatography -tandem mass spectrometry标准溶液浓度c /(ng /mL)标准溶液峰面积内标溶液峰面积峰面积比值A 13521490.020453713117290.01933804412917290.01930501927620450.03688675827820450.04067930528825290.037933526522921720.0976234521321720.092724679522824930.0939767781044021940.2197933231044921940.2063375091044623560.1989683122090022060.4041146222091222060.4135966582087622650.397020484㊀㊀注:曲线方程为Y =0.0203X -0.0037,其中斜率a =0.0203,截距b =-0.0037,相关系数为0.9999㊂对样品处理液中的氯霉素共测量6次,即p =6㊂测得样品处理液中氯霉素的平均含量为x =9.3163ng /mL㊂于是由最小二乘法拟合标准曲线所引入的不确定度u (q )为:u (q )=S (A )a1p +1n +(X -C )2S xx=0.3744其中:116㊀广㊀州㊀化㊀工2020年7月S (A )=ðn i =1[Ai -(b +aC i)]2n -2=0.0156C =ðn i =1Cin=7.60S xx =ðni =1(Ci-C )2=723.60式中:S (A )为标液峰面积标准偏差;p 为样品测定次数;n 为标溶各点测定次数;X 为样品中氯霉素的平均质量浓度;C 表示各标准溶液质量浓度点C i 的平均值;S xx 表示各标液浓度点C i 与C 之差的平方和;a 为标准曲线斜率;b 为标准曲线截距;A i 为标液各浓度点测定的峰面积比值;C i 为标液各浓度点含量㊂标准曲线拟合引入的相对不确定度为:u rel (q )=u (q )/x =0.0402因此,在标准溶液配制测定过程中,各分量合成的不确定度为:u rel (c )=u 2rel (std )+u 2rel (s )+u 2rel (V 1)+u 2rel (T 1)+u 2rel (q )=0.04992.2㊀样品前处理过程引入的不确定度2.2.1㊀样品称量过程引入的不确定度当称取蜂蜜5.00g 时,其所使用的天平允许最大误差为ʃ0.01g,根据矩形分布,其相对不确定度为:u (m )=0.01g /3=0.00577g u rel (m )=0.00577/5.00=0.001152.2.2㊀样品前处理过程体积引入的不确定度样品前处理过程中使用15mL 单标线吸量管1次,10mL 单标线吸量管1次,1mL 单标线吸量管1次,样品前处理过程引入的相对不确定度见表4㊂表4㊀样品前处理过程中玻璃量器引入的不确定度Table 4㊀Uncertainty introduced by the glass scaleduring sample preparation玻璃量器最大允许误差定容或移取体积相对标准不确定度A 级15mL 单标线吸量管ʃ0.025mL 15mL u V 5rel =0.00096A 级10mL 单标线吸量管ʃ0.020mL 10mL u V 6rel =0.0012A 级1mL 单标吸量管ʃ0.007%1mLu V 7rel =0.0040由表4中的数据,合成前处理过程中玻璃量器引入的相对不确定度为:u rel (V )=u 2V 5rel +u 2V 6rel +u 2V 7rel=0.004282.2.3㊀样品前处理回收率引入的不确定度对阴性样品添加10ng /mL 的氯霉素,进行6次加标回收实验,回收率分别为92.9%,93.3%,92.9%,92.7%,93.8%,93.1%,平均回收率为93.16%,相对标准偏差为0.392%,则由回收率引入的相对不确定度为:u rel (f )=0.003922.3㊀不确定度合成2.3.1㊀标准不确定度合成由以上分析过程各相对不确定度分量见表5㊂表5㊀各相对不确定度分量汇总表Table 5㊀Summary table of relative uncertainty components来源相对标准不确定度u rel (c )待测组分含量0.0499u rel (m )样品称量0.00115u rel (V )样品前处理过程0.00428u rel (f )回收率0.00392由上述各不确定度分量的数据合成标准不确定度为:u rel (x )=u 2rel (c )+u 2rel (m )+u 2rel (V )+u 2rel (f )=0.05022.3.2㊀扩展不确定度依据JJF 1135-2005‘化学分析测量不确定度评定“[7],在95%的置信水平下,取k =2,蜂蜜样品中氯霉素的测量值为9.3163ng /mL,结合前处理过程,计算得到样品中氯霉素的含量为2.79μg /kg,则扩展不确定度为:U =2.79ˑ0.0502ˑ2=0.280μg /kg2.3.3㊀不确定结果按照该方法测定蜂蜜中氯霉素的结果为:X =(2.79ʃ0.28)μg /kg,k =2㊂3㊀结㊀论根据实验过程,对蜂蜜中氯霉素残留量测定的不确定度来源进行了评定,评定结果表明:影响的主要因素是采用最小二乘法标准曲线拟合对氯霉素质量浓度的影响,而样品称量㊁前处理过程中等引入的不确定度基本可忽略不计㊂因此建议在采用该方法的检测过程中,要对标准溶液配制步骤以及标准曲线拟合过程进行强化控制,使检测结果准确有效㊂参考文献[1]㊀陈梅斯,练习中,郑丽斯.液相色谱-串联质谱法测定蜂蜜中氯霉素残留量的不确定度[J].现代食品,2018(23):103-106.[2]㊀国家质量监督检验检疫总局.GB /T 18932.19-2003蜂蜜中氯霉素残留量的测定方法液相色谱-串联质谱法[S].北京:中国标准出版社,2003.[3]㊀杨涛,袁辉.猪肉中五氯酚酸钠残留量的不确定度评定[J].广州化工,2019(20):110-112[4]㊀中国合格评定国家认可委员会.CNAS -GL006:2019化学分析中不确定度的评估指南[S].北京:中国标准出版社,2019.[5]㊀国家质量监督检验检疫总局.JJG 646-2006移液器检定规程[S].北京:中国计量出版社,2006.[6]㊀全国流量容量计量技术委员会.JJG 196-2006常用玻璃量器检定规程[S].北京:中国标准出版社,2007.[7]㊀国家质量技术监督局.JJF 1135-2005化学分析测量不确定度评定[S].北京:中国计量出版社,2005.。

23235426_全自动固相萃取_-_超高效液相色谱串联质谱法测定蜂蜜中的氯霉素

氯霉素是一种常见的抑菌类合成抗生素，曾在动物养殖业广泛使用，但由于人体对氯霉素有严重的不良反应，易引起再生障碍性贫血和溶血性贫血，我国农业部235号公告[1]、193号公告中已明确规定禁止在动物中使用氯霉素[2]，在动物源性食品中氯霉素残留物不得检出。

然而在养蜂过程中，蜂场为避免蜂群感染某些疾病，可能会违规使用这些便宜且治疗效果较好的抗生素，因此蜂蜜中检出氯霉素残留的案例时有发生。

蜂蜜中氯霉素的检测方法很多，主要有气相色谱-质谱（GC-MS）法[3，4]、高效液相色谱（HPLC）法和液相色谱-质谱联用（LC-MS/MS）法[5-7]。

样品前处理方法主要包括溶剂提取、固相萃取法和QuEChERS 方法。

本研究建立了全自动固相萃取-超高效液相色谱串联质谱法测定蜂蜜中氯霉素残留量，取得了比较好的结果。

1　实验部分1.1　试样蜂蜜样品来源：随机抽取10份市售蜂蜜。

1.2　材料与试剂氯霉素标准品、D 5-氯霉素标准品，购于德国Dr.Ehrenstorfer GmbH，纯度＞99.0%；醋酸铵为阿拉丁试剂公司的质谱纯试剂；甲醇、乙酸乙酯均为德国默克公司的色谱纯试剂；浓盐酸为国药集团的优级纯试剂。

氯霉素标准品临用前甲醇稀释至100 ng/mL，D 5-氯霉素标准品临用前甲醇稀释至20 ng/mL。

1.3　仪器与设备Thermo TSQ QUANTIS 液相色谱-三重四极杆串联质谱仪，美国赛默飞；ST 16R 型高速低温离心机，美国赛默飞；PB203-N 电子天平，梅特勒；Fotector Plus 48位全自动固相萃取仪，Reeko 公司；Organomation N-EVAP 112型氮吹仪，美国Organomation；MCS 固相萃取柱（500 mg/6 mL）。

1.4　液相色谱条件ACQUITY UPLC® BEH C 18（1.7 μm，2.1 mm×100 mm）液相色谱柱，柱温：40 ℃；流速：0.3 mL/min；进样体积：3 μL；梯度洗脱程序见表1。

农产品快速检测技术W1302-5 速测卡快速检测蜂蜜中的氯霉素-微测试

《农产品/食品快速检测技术》课程-微测试一、单选题1、蜂蜜中出现氯霉素是因为（）。

A．氯霉素是蜂蜜的成分，自然存在B．为提高蜂蜜保质期人为添加C．蜂农使用氯霉素处理蜂房防治“幼虫腐烂病”D．为增加蜂蜜甜度人为添加参考答案：C难度：中2、采用本方法快速检测蜂蜜中的氯霉素，约需（）。

A．20 minB．60 minC．90 minD．120 min参考答案：A难度：中3、采用本方法快速检测蜂蜜中的氯霉素，取出试纸条后应在（）min内完成结果判定。

A．1minB．2minC．3minD．4min参考答案：B难度：低二、多选题1、本检测阳性结果的现象为（）？A．T线比C线显色深B．T线和C线显色一样深C．T线比C线显色浅D．T线无显色，C线有显色参考答案： C ；D难度：中三、判断题1、有结晶的蜂蜜样品需要在密闭状态下水浴，但结晶全部融化后搅匀再取样。

参考答案：T难度：低2、本检测中待检样本加入微孔试剂后，不可吹吸，要等待待检样本于微孔试剂自然混匀。

参考答案：F难度：中四、填空题1、该方法中提取氯霉素用到的试剂是。

参考答案：乙酸乙酯难度：中2、本方法检测结果C线不显色，无论T线是否显色，该检测均判为。

参考答案：无效难度：低五、简答题1、简述速测卡快速检测蜂蜜中的氯霉素需要准备哪些物品。

参考答案：天平、蜗旋仪、离心机、氮吹仪、移液器等仪器。

氯霉素快速检测试纸条、氯霉素微孔试剂、样品稀释液、乙酸乙酯等试剂。

难度：中六、综合题1、请设计速测卡快速检测蜂蜜中的氯霉素的检测步骤。

参考答案：1）物品准备，包括仪器及试剂等。

2）样品前处理，包括称量、溶解、浸提、离心分离、挥干溶剂、复溶等。

3）检测操作，包括样品与微孔试剂的混匀，层析。

4）结果判读，明确阴阳性结果的现象。

难度：中。