氯霉素试剂盒检测方法

酶标免疫分析定量检测氯霉素残留试剂盒。德国R-Biopharm公司制造(中文翻译件仅供参考,以试剂盒内附的英文原件为准.)

简介

RIDASCREEN Chloramphenicol（产品编号R1501）

竞争酶标免疫法定量测定牛奶，肉类及鸡蛋中的氯霉素残留。试剂盒中包括了所有检测用的试剂。该试剂盒有96个试验孔包括标准试验，如果进行定量分析，必须有微孔板酶标仪。

检测下限:

尿液中50ppt

虾及鱼肉50ppt

牛奶中：150 ppt

肉类中: 100ppt

1. 用途

RIDASCREEN chloramphenicol竞争酶标免疫法定量测定牛奶，尿液，虾肉，鱼肉，肉类及鸡蛋中的氯霉素残留。

2.概要（略）

3.测定原理

测定的基础是抗原抗体反应。微孔板包被有针对兔IgG（氯霉素抗体）的羊抗体。加入氯霉素抗体，氯霉素酶标记物，标准或样品溶液。游离氯霉素与氯霉素酶标记物竞争氯霉素抗体，同时氯霉素抗体与羊抗体连接。没有连接的酶标记物在洗涤步骤中被除去。将酶基质（过氧化尿素）和发色剂（四甲基联苯胺）加入到孔中并且孵育。结合的酶标记物将无色的发色剂转化为蓝色的产物。加入反应停止液后使颜色由蓝转变为黄色。在450nm处测量（选择参比波长≥600nm）。吸光度值与样品中的氯霉素浓度成反比。

4.提供的试剂

每一个盒中的试剂足够进行96个测量（包括标准分析孔），盒中的材料如下：

1 X 96孔板（12条X 8孔）包被有抗兔IgG的羊抗体

6 X 浓缩标准液, 300ul/瓶, 为氯霉素溶液

0ppt，500ppt, 1500ppt, 4500ppt, 13500ppt, 40500ppt

1 X 过氧化物酶标记的氯霉素浓缩液…..……..红色帽

1 X 氯霉素抗体浓缩液…………………………..黑色帽

1 X 基质(7ml);含有过氧化尿素…….……….…..绿色帽

1 X 发色剂(7ml);四甲基联苯胺…….….…….….蓝色帽

1 X 反应停止液(14ml)1M硫酸....….……….…..黄色帽

1 X 缓冲液1(100ml)用于标准，酶标记物，抗体，样品

及缓冲液2稀释用

1X 缓冲液2（1ml），测定牛奶样品时的标准稀释用缓冲液

5.需要的材料但盒中不提供

设备

----微孔板酶标仪(450nm)

----离心机

----旋转蒸发器

----振荡器

----磁力搅拌器

----刻度移液管

----50ul, 100ul, 450ul微量加样器

试剂

----醋酸乙酯

----乙腈

----正己烷（或正庚烷）

----异辛烷

----三氯甲烷（氯仿）

----葡萄糖苷酸酶glucuronidase/arysulfatasesolution

（Merck, Art.No.4114）

----Carrez I：0. 36M铁氰化钾（II）X 3 H2O

----CarrezII：1. 04 M 硫酸锌X7 H2O

筛选肉样品用试剂

PBS缓冲液：(0.55g NaH2PO4 X H2O; 2.85g Na2HPO4 X 2H2O +9g NaCl 加入蒸流水至1000ml）；pH7.2

6. 操作者应该注意之事项

----标准液含有氯霉素，应特别小心

----反应停止液为1M硫酸,避免接触皮肤

----不要使用过了有效日期的试剂盒, 稀释或搀杂使用会引起灵

敏度的降低.

----不要交换使用不同批号的盒中试剂.

7. 储存条件

----保存试剂盒于2-8o C.不要冷冻

----无色的发色剂对光敏感,因此要避免直接暴露在光线下

----将不用的微孔板放进原锡箔袋中并且与提供的干燥剂

一起重新密封.

8. 试剂变质的迹象

发色试剂有任何颜色表明发色剂变质,应当弃之.

0标准的吸光度值小于0.6个单位(A450nm<0.6)时,表示试剂可能变质.

9. 样品处理(样品应当在暗处及冷藏保存)

9.1 牛奶样

-----10o C离心10分钟3500 g, 吸除上层的脂肪

----5ml去除脂肪奶加入150ul Carrez I出现沉淀，短暂振荡，然

后加入150ul Carrez II混合。

----15 o C离心10分钟3500 g

----移取上层液

----用buffer 1稀释液以1：2稀释上层液（1份上层液+1份buffer 1），

----取50ul进行测定

注意：如果离心后仍然浑浊，再重复沉淀过程

9. 2. 组织样品（肉及肾脏）

9．2．1定量方法

----用均质器均质肉或肾脏（去除脂肪）

----取5g 均质过的样品与20ml 乙腈水溶液(84+16)抽提10分钟

----15 o C离心10分钟3000 g

----3ml上清液与3ml蒸流水混合,加入4.5ml醋酸乙酯抽提

----15 0C离心10分钟3000 g

----将醋酸乙酯层转移至另一瓶中完全干燥

----用1. 5ml缓冲液1溶解残留物，加入1. 5ml正己烷

（或正庚烷）脱脂

----完全除去上层的正己烷

----取50ul下层的水相进行分析.

9．2．2 筛选用简单处理方法

---- 加入20ml PBS缓冲液pH7. 2 到5g样品中（去掉脂肪的肉或肾脏）。----用均质器均质30秒，再振荡10分钟

----15 o C离心15分钟3000 g

----0. 2ml上清液与0. 2ml缓冲液1混合

----取50ul稀释液进行分析分析

9.3.蛋

----称5g均质过的样品于试管中（用均质器均质蛋黄或全蛋）

----用9. 2. 1方法处理

9.4 尿液

----转移1ml 尿液到玻璃试管中,加0. 5ml 100mM醋酸钠缓冲液pH4.8 混合

----加20ul葡萄糖苷酸酶glucuronidase/arysulfatasesolution

（Merck, Art.No.4114）到稀释的尿液中

----在37 o C水解至少2小时(或过夜)

----冷却溶液到室温并且加入2ml醋酸乙酯混合1 分钟

----室温离心10分钟3000 g

----取出1ml 上层液体(相当于0.5ml 尿样)在氮气流下干燥

----用0.5ml 样品稀释缓冲液溶解干燥的残留物

----取50ul 进行测定

稀释倍数为1; 检测下限为50ng/L(50ppt)