牛乳中氯霉素的检测

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DB51T 676-2007 牛奶中氯霉素残留检测方法-高效液相色谱-串联质谱(LC-MS-MS)法

ICS：65.020.30DB 备案号：四川省地方标准DB51/T 676—2007牛奶中氯霉素残留检测方法－高效液相色谱-串联质谱（LC-MS-MS）法Determination of chloramphenicol residues in milkby high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry目次前言 (II)1 范围 (1)2 规范性引用文件 (1)3 制样 (1)3.1 样品的制备 (1)3.2 样品的保存 (1)4 测定方法 (1)4.1 方法提要或原理 (1)4.2 试剂和材料 (1)4.3 仪器和设备 (2)4.4 测定步骤 (2)4.5 结果计算和表述 (3)5 检测方法灵敏度、准确度、精密度 (4)5.1 灵敏度 (4)5.2 准确度 (4)5.3 精密度 (4)附录 A （资料性附录）氯霉素特征离子质量色谱图、特征离子质谱图 (5)I前言本标准按GB/T1.1—2000 《标准的结构和编写规则》进行编制本标准附录是资料性附录本标准由四川省畜牧食品局提出并归口本标准由四川省质量技术监督局批准本标准起草单位：四川省兽药残留监控中心、四川省兽药监察所本标准主要起草人：彭莉、岳秀英、高岚、熊浩山、官艳丽、王海波、吴晓岚II牛奶中氯霉素残留检测方法－高效液相色谱-串联质谱（LC-MS-MS）法1 范围本标准规定了牛奶中氯霉素残留量检测的制样和高效液相色谱-串联质谱（LC-MS-MS）测定方法。

本标准适用于牛奶中氯霉素的残留量测定。

检出限为0.05µg/L。

2 规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。

凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。

凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。

高效液相色谱_质谱_质谱联用法快速检测牛奶中的氯霉素_吴宇伉

0． 3
0
100． 0
0． 3
80． 0
20． 0
0． 3
80． 0
20． 0
0． 3
1． 2． 2 质谱条件离子源：电喷雾电离（ ESI）；扫描方式：负离子扫描；监测模式：多反应监测（ MＲM）；挥发气温度： 350 ℃ ；毛细管温度： 300 ℃ ；鞘气： 13 L / min；辅助气： 6 L / min；喷雾电压： 2 500 V。氯霉素质谱分析的条件参数见表 2。
时间（ min） 0． 00 0． 50 1． 50 2． 00 2． 50 4． 50 5． 00 6． 00
表 1 流动相成分梯度表
A（ % ）
B（ % ）
流速（ ml / min）
80． 0
20． 0
0． 3
80． 0
20． 0
ห้องสมุดไป่ตู้
0． 3
40． 0
60． 0
0． 3
5． 0
95． 0
0． 3
0
100． 0
度：
C
=1
000cV m
式中： C －牛奶中氯霉素残留浓度，μg / kg； c －测
定结果，μg / ml； V －最后定容体积，0． 5 ml； m －称取的
牛奶样品质量，1． 0000 g。
2结果
2． 1 测定范围与最低检出浓度将逐级稀释的标准系列工作液分别进样 5 μl，测定结果经线性回归，测定范围为 0． 25 μg / kg ～ 1． 25 μg / kg。回归方程为 y = 0． 24625x + 0． 073069（ y 为峰面积； x 为浓度，ng / ml）；线性相关系数 r 为 0． 9978；进空白样，以基线 3 倍噪声值在标准曲线中查得结果计算，测得该方法检出限为 0． 004 μg / kg。 2． 2 质谱条件的优化首先采用 50 ng / ml 的氯霉素标准溶液在负离子模式下进行母离子全扫描，确定氯霉素的分子离子为 m / z 321． 0。按照欧盟委员会指令

ELISA法检测牛奶中氯霉素残留的前处理方法

９９．０７１ｌＯ．８１１０４．６６
１５０１３２．７６１５３．５２１２８．８０１３８．３６１４６．５４１６２．５５１２９．２ｌ１４６．１０
表２２种前处理方法氯霉素的回收试验
添加浓度实测浓度
（ｎｇ／ｋｇ）
查鳖！
回收率平均回收率
（％）
（ｉ±５，％）
方法２
实测浓度回收率（ｎｇ／ｋｇ）（％）
ｓபைடு நூலகம்ｕｒｃｅｓ．
ＫｅｙＷｏｒｄ
ＥＵＳＡ：Ｓａｍｐｌｅｐｒｅｔｒｅａｔｍｅｎｔ；Ｃｈｌｏｒａｍｐｈｅｎｉｃｏｌ；Ｍｉｌｋ
氯霉素（Ｃｈｌｏｒｍｎｐｈｅｎｉｃｏｋ，ＣＡＰ）是针状或片状结晶，性质稳定。微溶于水，易溶于甲醇、丙酮、乙酸乙酯等有机溶剂，在酸性或中性溶液中较稳定。作为一种高效广谱抗生素，ＣＡＰ经常用于治疗奶牛的乳腺炎，在泌乳期使用，必将造成牛奶中ＣＡＰ的残留…。虽然我国农业部在２００２年就发布公告禁止使用ＣＡＰ，但仍有一些畜牧养殖户使用ＣＡＰ来治疗奶牛疾病。从上世纪７０年代ＣＡＰ残留分析方法建立以来，已经有微生物学方法、免疫分析方法、色谱分析方法等忙Ｊ。酶联免疫吸附试验（ＥＬＩＳＡ）法口。在实验室操作中具有简单、快速、灵敏度较高、重复性好、处理样品量大等优点，现在市场有试剂盒供应，可以直接用于生产实践，适用于大规模ＣＡＰ残留筛选检测，在检测过程中样品的前处理的是否得当将直接影响检测结果，为此，笔者专门针对
ＷＵＬｉｎｇ—ｌｉｎｇ，心ＮＧＮａｎ（ＨａｎｇｚｈｏｕＨｕｓｂａｎｄｒｙａｎｄＶｅｔｅｒｉｎａｒｙＭｅｄｉｃｉｎｅ
１００２０，Ｃｈｉｎａｌ
Ａｂｓｔｒａｃｔ
ＳａｍｐｌｅｐｒｅｔｒｅａｔｍｅｎｔｉｓａｐｉｖｏｔａｌｓｔｅｐｉｎｔｈｅｐｒｏｃｅｓｓｏｆｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆｃｈｌｏｒａｍｐｈｅｎｉｃｏｌｒｅｓｉｄｕｅｉｎｍｉｌｋｂｙＥＬＩＳＡ．，１１】ｉｓ

荧光衍生化法测定牛奶中氯霉素残留的研究_潘莹宇

摘要: 研究氯霉素荧光衍生化反应的实验条件, 建立荧光分光光度法测定牛
奶中氯霉素残留的新方法。牛奶中的氯霉素, 用乙酸乙酯超声提取 3 次, 浓缩,
盐水溶解, 正己烷脱脂, 再经乙酸乙酯反萃取, 氮气吹干, 经还原, 用荧光胺衍
生化测定。氯霉素衍生化产物质量浓度在 12. 5~ 500 ngPmL 范围内, 相对荧光强
疫法、色谱法( 气相色谱、液相色谱、薄层色谱) 、质谱联用法[ 3] 。而利用荧光分光光度法检测动物性食品中氯霉素残留国内外未见报道。
荧光胺( 4- 苯基螺环- 呋喃- 2- ( 3H)- 1c酞烷- 3, 3c二酮, Fluorescamine) 本身无荧光, 水解产物亦无荧光, 但能在温和条件下与伯胺反应得到强荧光产物, 且仲胺不发生类似反应[ 4] 。氯霉素本身不发荧光, 但其苯环上的硝基经还原为芳香伯胺与荧光胺反应形成具有荧光的物质以达到痕量检测的目的。据此, 建立了荧光衍生化法测定牛奶中氯霉素残留的方法。
度) 。并按照下式计算样品中氯霉素的残留量: Qx = ( Q@ 2) PV
式中: Qx - 样品中 CAP 的残留量( ngPmL) ; Q- 样
品在标准曲线求得的质量浓度( ngPmL ) ; V - 牛奶取样量( mL) 1. 2. 4 最佳反应条件的正交实验设计在荧光衍生化反应中, 影响衍生化的主要因素有溶液的酸度、荧光胺的用量、反应所需时间等, 本文按三因素三水平的正交设计考察最佳反应条件, 正交设计的因素水平见表 1。 2 结果与讨论 2. 1 样品提取、净化条件的选择
因素荧光胺( B) 用量 VPmL
0. 30 0. 40 0. 50
反应时间( C) tPmin 5 8 12

液相色谱串联质谱法检测乳制品中氯霉素的方法研究

乙酸乙酯对样品进行提取，再对３种固相萃取柱净化效
（以上实际均为色谱纯，科密欧）；超纯水。
果进行比较，最终确定适合奶制品中氯霉素测定的最佳１．２色谱务件
净化方式。该方法样品处理简单、准确度高，在针对奶粉、婴幼儿配方奶粉、液态奶等奶制品中氯霉素的检测
固相萃取仪；分析天平；旋转蒸发仪；氮吹仪；碎裂电压：１２５Ｖ；氯霉素定性离子对：ｍ／ｚ３２１／２５７（碰撞电压５Ｖ），ｍ／ｚ
国９卞圈ｔＪ奶Ａ斗Ｉ１２ … ０Ｉ１Ｙ３・１Ａ０ＮＤＳＡＦＴｇ
口口液相色谱串联质谱法检测乳制
口
厂＋１
氯霉素的方法研究
邢宇，郭丽娜，孙伟
（黑龙江省质量监督检测研究院，哈尔滨１５００５０）
中图分类号：ＴＳ２５２．７文献标识码：Ａ文章编号：１００４ — ４２６４（２０１３）１０ — ００４６ — ０３
摘
要：本研究建立了液态奶、全脂奶粉、婴幼儿配方奶粉中氯霉素的液相色谱串联质谱分析法，采用Ｃ１８
分离柱（１５（）Ｘ４．６０ｍｍ ×５１＂１＂１）、乙腈：０．１％甲酸（３５：６５）作为流动相，对不同的提取方式、不同的净化
效果良好，可用于乳制品中氯霉素的检验。
液相条件：色谱柱：分离柱Ｃ１８（１５０×４．６０ｍｍｘ５ｕｍ，

Charm 氯霉素快速检测条-牛奶

配体免疫反应进行检测（受体是细胞在进化过程中形成的细胞蛋白组分，能识别周围环境中某种微量化学物质；配体是能与受体特异性结合的物质）。检测条具有两条俘获带，其中一条为检测带（T，由配体组成），另一条为质控带（C）。当样品与被标记的受体混合后，受体将在俘获带上被俘获，并显出红色，随后可以通过反应后俘获带颜色的深浅来判定结果。 2.产品性能检测限：0.1ppb。灵敏度和特异性：检测无氯霉素牛奶样品，阴性检测率为 90%，置信度为 95%。交叉反应：以下兽药残留在浓度为100ppb时不会干扰检测：氨基糖苷类、其他酰胺醇类、-内酰胺/头孢菌素类、氟喹诺酮类、大环内脂/林可胺类、硝基呋喃类、四环素、磺胺类药物、或氯噻嗪、氟美松、安乃近、呋喃苯胺酸、伊佛霉素、新生霉素、催产素、对氨基苯甲酸、苯基丁氮酮、三氯噻嗪和噻苯咪唑。体细胞浓度为106 SCC/ml或细菌浓度为3105 cfu/ml时对检测无干扰。 3.试剂盒组份及另需的材料试剂盒组份氯霉素快速检测条：100 条 0.1 ppb 氯霉素阳性标准品用户手册 4. 试剂制备和储存将试剂盒保存在 0-7℃条件下，不要冷冻！检测条保存在密封的箔罐中，每次检测前取出所需数量的检测条后，将箔罐密封好重新放回冰箱。避免保存在高湿度条件下。箔罐中有一包湿度防潮剂，正常情况下，防潮剂中颗粒呈蓝色，若颗粒变为紫色或红色时则说明湿度太高，检测条已经变质。检测条在室温条件下可保存 12 小时。阴性质控使用氯霉素阴性牛奶作为阴性质控，用于进行性能监控以及复原阳性质控。阴性质控检测 T 线颜色比枪头另需的材料耗材设配 ROSA 孵育器（40℃） ROSA 读数仪（可选）打印机（可选） 300 μ L 移液器（可选）
C 线深。阴性质控可冷藏 72 小时。阳性质控未水化时和试剂条一样干燥低温保存。用 10ml 阴性奶溶解成浓度为 0.1ppb 的氯霉素阳性质控，冷藏或冰浴放置 5min，用前振荡混匀。阳性质控可在冷藏条件下保存 48 小时。在-15℃条件下可保存 2 个月。样品和质控液的长期储存将样品混匀，分成小份（至少为 0.5ml）放在小瓶中冷冻。质控液应在复原 6 小时内以 1ml 为单位分装并冷冻。冷冻后的样品和质控液在-15℃条件下可保存 2 个月。在冷藏条件下或冰水中过夜缓慢解冻，振荡摇匀。解冻后的样品，冷藏条件下可保存 24 小时。如果出现明显的蛋白沉淀，说明样品变质。未用完的样品请丢弃，请勿重复冷冻。 5.注意事项 1) 2) 3) 4) 5) 高脂肪样品（>6.5%）可能导致结果不可用，需离心处理后检测。检测条上的碎片影响读数仪光学性能，因此在将检测条插入读数仪前，应擦去检测条上的灰尘和牛奶残渣,以保持设备清洁。孵育器应保持清洁和水平，孵育器的温度必须是 402℃。用前要预热 10 分钟，达到合适的温度。样品在检测前冷藏放置（0-4.4℃）。检测在取样 5 天内进行。在室温环境下（10-30℃）进行检测。

乳及乳粉中氯霉素残留量的测定方法

乳及乳粉中氯霉素残留量的测定方法超高效液相色谱-串联质谱法标准操作程序1 安全提示本试验方法中使用的部分试剂具有毒性或腐蚀性，操作时须小心谨慎！如溅到皮肤上应立即用水冲洗，严重者应立即治疗。

2 方法提要本标准操作程序是本实验室参照GB/T 18932.19-2003和《残留检测质量控制指南》的有关要求制定。

本方法适用于乳及乳粉中氯霉素残留量的测定和确证。

3 实验部分3.1 原理试样中氯霉素残留用乙酸乙酯提取后，用正己烷脱脂、HLB固相萃取柱净化后，用超高效液相色谱-串联质谱联用仪检测，外标法定量。

3.2 检测限、测定低限、线性范围、回收率范围和精密度表1 方法的检测限、测定低限、线性范围、回收率范围和精密度化合物名称检测限（μg/kg）测定低限（μg/kg）线性范围（μg/L）回收率（%）RSD（%）氯霉素0.1 0.2 3.3 仪器和设备3.3.1 液相色谱-质谱联用仪。

3.3.2分析天平：感量0.1mg、0.01g。

3.3.3机械振荡器。

3.3.4 离心机。

3.3.5 涡旋混匀器。

3.3.6 固相萃取仪。

3.3.7 氮吹浓缩仪。

3.3.8 移液枪：50 ~1000μL。

3.4 试剂与材料除另有说明外，所有试剂均为分析纯，水为高纯水。

3.4.1 试剂3.4.1.1 乙腈。

3.4.1.2 乙酸乙酯。

3.4.1.3 甲醇。

3.4.1.4 氯化钠。

3.4.2 溶液3.4.2.1 氯化钠溶液（4%）：取20 g氯化钠，用适量水溶解后，用水定容至500 mL。

3.4.2.2 乙腈-水溶液（1 + 4）：取20mL乙腈与80 mL水混合均匀。

3.4.2.3 乙腈-水溶液（1 + 7）：取20mL乙腈与140 mL水混合均匀3.4.3 标准物质与标准溶液3.4.3.1 标准物质表2 标准物质列表标准物质英文名称纯度氯霉素Chloramphenicol ≥99.0%3.4.3.2氯霉素标准溶液：储备液100 μg/m L，用甲醇溶解定容，储存在4±4℃。

高效液相色谱法测定牛奶中氯霉素残留的研究综述_李红

河南畜牧兽医２００７年（第２８卷）第２期综合版专论综述专论综述高效液相色谱法测定牛奶中氯霉素残留的研究综述李红１，张莹蕾２，李永军１，马伟华１（１．河南省乳品工程技术研究中心，河南郑州４５０００８；２．河南三鹿花花牛乳业有限公司）中图分类号：Ｓ８５９．８４文献标识码：Ｂ文章编号：１００４－５０９０（２００７）０３－００１１－０１氯霉素抗菌谱较广，能抑制革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌，由于其价格低廉、抗菌性能好，是预防和治疗牛乳房炎等疾病的主要药物，但其残留对人体健康的危害不容忽视，它能够导致严重的再生障碍性贫血，并且其发生与使用剂量和频率无关。

因此，近年来美国和欧盟对动物食品中的氯霉素残留量都制定了严格的限制指标，残留量不得超过０．１μｇ／ｋｇ。

我国农业部已禁止使用该药，无论内销还是出口的畜产品，氯霉素残留都是必检项目。

到现在为止，氯霉素残留的检测已相继建立了气相色谱、液相色谱、薄层色谱、放射性分析、微生物法及免疫学检测等方法。

高效液相色谱法是一种快速有效的分离分析技术，它引入了气相色谱理论，在技术上采用高压泵、高效固定和高灵敏度检测器，实现了分离速度快、效率高和操作自动化。

高效液相色谱法测定牛奶中的氯霉素残留都要经过提取、层析柱净化、浓缩以及残留药物分离和检测。

该文就从这四个方面对高效液相色谱法测定牛奶中氯霉素的残留进行概述。

１样品的提取与净化１．１样品的提取牛奶中含有大量蛋白质、脂肪、糖类、维生素、无机盐、水分等，这些样品基质的存在不但干扰待测物的检测，而且污染仪器和降低设备使用寿命，因此需要选择合理有效的提取方法。

为了从牛奶样品中提取氯霉素，首先要使蛋白质变性，破坏其胶体状态。

从牛奶中提取氯霉素使用最多的是乙酸乙酯和乙腈，乙酸乙酯既能有效提取氯霉素，又能减少牛奶中蛋白质等水溶性杂质被萃取到溶剂中。

乙腈能够有效除去牛奶中的蛋白质，但萃取效率没有乙酸乙酯高。

使用高氯酸溶液能有效地净化残留物，减少对氯霉素的干扰。

胶体金免疫渗滤法检测淡水鱼及牛乳中氯霉素残留

（天津科技大学食品工程与生物技术学院，天津市食品营养与安全重点实验室，天津３０５）０４７
摘要：制备了平均粒径２ｌ的胶体金，用以标记抗氯霉素多克隆抗体；将氯霉素半抗原与卵清蛋白的偶联物包在硝酸纤维０Ｔｎｌ被素膜Ｅ作为检测带，羊抗兔二扳为质控带，作依据免疫竞争法原理，建立通过免疫胶体金渗滤式试纸条检测六种淡水鱼及牛乳中氯霉素残留的方法。样品前处理方法简便，方法灵敏度为１Ｌ峙／，只需１１ｍｎ０５ｉ即可目测判断结果，￣可以作为淡水鱼及牛乳中氯霉素残
ＤｏｍｍｕｎｇｌｌｒｔｏＡｓａｔＩｏｏｄＦｉａｉｎｓｙｔ
ＷＡＮＧＷｅ，ｉＺＨＡＮＧＹｎＬＵＪｎｗｅ，ＡＧＬｉＷＡＧＦｎ－ｉ，ＡＧＳｕａ，Ｉｕ－ｉＷＮ，ＮｅｇｘａＷＮｈｏ
（Ｖ）ｄｅｈｅｅｅｉｅｓｄｏｎｔｃｌｌｅ（ＣｍｅｒｎｏｍｉｇｅｅｔｏｅＧｏｔｔｒｂｉＩＧｗａｃｏｅｓｎｒｌｅＯＡａｔｎｔｙＷＴｄｓｒｎｈｐｅｎａｉｏｅｕｏＮ）ｍｂａｅｆｎｔｔｚｎ．ａａｉａｂｇｒｌｓｒｈｓｎ－ｔｓｈｓａｃｔ础ｏｏＴｅｍｅｏａｉｌａｄｆｔ１－５ｍｉｔ）ｔｅｓｎｉｖｔｏｈｔｄＷｓｅｓ（０１ｎｅｗｈｔｅｓｉｆ１峙／，ｈｃｏｌｅｗｄｌｓｄｔｅｅｔｅＣＰｒｓｕｓｉｈｓｍｐｎａｕｓｉｈｉｔｙＬｗｉｈｃｕｄｂｅｕｅｄｔＡｉｅｉｙｏｃｔｈｅｄｎ

超高效液相色谱_串联质谱法测定牛奶中的氯霉素残留

收稿日期：2010－07－28 基金项目：云南民族大学重点实验室基金；云南民族药资源委
部共建重点实验室开放课题资助。作者简介：栗旸（1976— ），女，工程师，硕士，主要从事卫生检验
工作。通讯作者：胡秋芬（1973— ），女，教授，博士，主要研究方向为分
氯霉素对人体有严重的副作用它能抑制人体骨髓造血功能而引起再生障碍性贫血症和粒状白细胞缺乏症等疾病21多个国家现已规定在蛋鸡和乳牛中禁止使用氯霉素h
畜牧与饲料科学
Animal Husbandry and Feed Science
2010 ，31 （8 ）:91-92
超高效液相色谱-串联质谱法测定牛奶中的氯霉素残留
氯霉素残留量的测定方法有酶联免疫法［5］、气相色谱法［6］、气质联用法［7］、液相色谱法［8］和液质联用法等［9-12］多种方法。酶联免疫法适用于样品的快速筛查，但定性及定量的准确度差。气相色谱法和气质联用法均需要对样品进行衍生化，其前处理繁琐且耗时较长。液相色谱方法的灵敏度较差，且容易出现假阳性结果。液质联用方法则是一种高灵敏度、高选择性的检测方法，特别是液相色谱-串联质谱系统可进一步提高检测的灵敏度和选择性，大大降低了检测限和假阳性检测结果的出现概率。［13-16］该研究用液相色谱-串联质谱法测定牛奶中的氯霉素，取得了满意的结果。［17-27］ 1 材料与方法 1.1 试剂与材料氯霉素标样购于瑞士 Fluka 公司；乙腈、乙酸乙酯为色谱纯试剂，购于美国 Fisher 公司；18.2 MΩ 超纯水由 Milli-Q Advantage A10 超纯水处理系统处理；牛奶样品购买于云南省昆明市某农贸市场。 1.2 仪器及工作条件 IKA T25 型高速匀浆机，德国伊卡

高效液相色谱_荧光检测法测定牛奶中氯霉素的残留量

2005年11月Nove mber 2005色谱C h inese J ou rna l of C h rom a tog raphyVo l .23N o.6577～580收稿日期:2005206213作者简介:潘莹宇,女,硕士研究生,E 2mail:yingyupan@.通讯联系人:许　茜,女,副教授,硕士生导师,主要从事色谱研究工作,E 2mail:xutiange@s ohu .com.高效液相色谱2荧光检测法测定牛奶中氯霉素的残留量潘莹宇,　许　茜,　康学军,　张建新(东南大学公共卫生学院营养与食品卫生学系,江苏南京210009)摘要:建立了对牛奶中氯霉素的残留量进行检测的高效液相色谱2荧光检测方法。

氯霉素还原后在温和条件下与荧光胺发生衍生化反应,采用十八烷基键合硅胶固定相,以乙腈/四氢呋喃/0102m o l/L 醋酸钠2醋酸缓冲液(pH 610)(体积比为16∶8∶76)为流动相,流速110mL /m in,柱温40℃,荧光检测激发波长为410nm ,发射波长为508nm 。

在上述实验条件下,氯霉素检测的线性范围为014～800μg /L (r 2=019999),检出限为012μg /L 。

当空白样品中氯霉素添加水平为2～40μg /L 时,该方法的回收率为6616%～9218%,相对标准偏差为415%～914%。

该方法适用于牛奶中氯霉素痕量残留的监测,具有干扰小、选择性好、灵敏度高等优点。

关键词:高效液相色谱2荧光检测法;柱前衍生化;荧光胺;氯霉素;残留;牛奶中图分类号:O 658 文献标识码:A 文章编号:100028713(2005)0620577204D e te rm in a t io n o f C h lo ram p h e n ico l R e s id u e s in M ilk b yR e ve rs e d 2P h a s e H igh P e rfo rm a n ce L iq u id C h rom a to g rap h y w ith F lu o re s ce n ce D e te c t io nPAN Yingyu,XU Q ian,K AN G Xue jun,ZHAN G J ianx in(D ep a r tm en t of N u tr ition a n d Food H ygien e,School of Pu blic H ea lth,Sou thea s t U n ivers ity,N a n jin g 210009,Ch in a )A b s t ra c t:A h igh p e rfo r m ance liqu id ch rom a tograp h ic m e thod w ith fluo rescence de tec tion fo r the de te r m ina tion of ch lo ram p hen ico l (CA P )res idues in m ilk w as deve lop ed.A lthough CA P itse lf is non 2fluo rescen t the a rom a tic n itro group of CA P cou ld be reduced to a rom a tic p ri m a ry am ino group and fluo rescam ine can be used as a se lec tive reagen t fo r p ri m a ry am ines.The re 2fo re,the CA P w as de riva tized w ith fluo rescam ine p rio r to in jec tion in th is p ro jec t .The H PLC m e thod w as p e rfo r m ed on a D iam ond C 18co lum n (250m m ×416m m i 1d 1,410μm )w ith the m ob ile p hase com p osed of sod ium ace ta te buffe r (0102m o l/L,pH 610)2ace ton itrile 2te trahyd ro 2fu ran (76∶16∶8,v /v /v ).The flow ra te of the m ob ile p hase w as se t a t 110m L /m in,and the co lum n w as m a in ta ined a t 40℃.A na ly tes w e re de tec ted by a fluo rescence de tec to r a t 410nm exc ita tion and 508nm em iss ion w ave leng th.The s tanda rd cu rve w as linea r in the range from014μg /L to 800μg /L.The li m it of de tec tion (LOD )w as 012μg /L,and the li m it of quan tita 2tion (LOQ )w as 014μg /L.O ve ra ll recove ries w e re be t w een 6616%and 9218%w ith re la tive s tanda rd dev ia tions be t w een 415%and 914%.The p rocedu re p rovides a rap id,re liab le and sen 2s itive m e thod fo r the de te r m ina tion of CA P in m ilk.Ke y w o rd s:h igh p e rfo r m ance liqu id ch rom a tograp hy 2fluo rescence de tec tion;p re 2co lum n de ri 2va tiza tion;fluo rescam ine;ch lo ram p hen ico l ;res idues;m ilk 氯霉素(ch lo ram p hen ico l,CA P )是一种较有效的抗生素,广泛用于动物的各种传染性疾病的治疗。

固相萃取-高效液相色谱法测定牛乳中氯霉素残留

氯酸溶液沉淀蛋白，再经ｓｔｒａｔａ — Ｘ固相小柱萃取，洗脱液浓缩后在ＯＤＳ（４．６Ｘ１５０ｍｍ）柱上，以乙腈一５ｍｍｏｌ／Ｌ磷酸氢二铵缓冲溶液（２２：７８）为流动相，２７７ｎｍ检测。结果：线性关系良好（ｒ＝０．９９９６），定量限（ＬＯＱ）为０．５ｎｇ／ｍｌ，各浓度绝
ｄｅｎｓｅｄｗｉｔｈｓｔｒａｔａ—Ｘｃｏｌｕｍｎ．ＴｈｅａｒｔｇｅｔｅｌｕｔｉｏｎｉＳｄｅｔｅｍｉｒｎｅｄｏｎＯＤＳ（６．０Ｘ１５０ｍｍ）ｃｏｌｕｍｎｗｉｔｈａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅ一５ｍｍｏ１／Ｌｄｉ —
ｍｉｌｋ，ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇｐｈｅｎａｃｅｔｉｎａｓｉｎｔｅｒｎｌａｓａｎｔｄａｒｄ，ｉｓｄｅｐｒｏｔｅｉｎｅｄｗｉｔｈ１０％ＨＣ１０ｄｉｆｒｓｔ．，Ｉ ’ ｈｅｓｕｐｅｎａｒｔａｎｔｉｓｔｈｅｎｅｘｔｒａｃｔｅｄａｎｄｃｏｎ —
［Ａｂｓｔｒａｃｔ］Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ：Ｔｏｄｅｖｅｌｏｐａｍｅｔｈｏｄｆｏｒｄｅｔｅｍｉｒｎａｔｉｏｎｏｆｒｅｓｉｄｕｅｏｆｃｈｌｏｒａｍｐｈｅｎｉｃｏｌｉｎｂｏｖｉｎｅｍｉｌｋ．Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ｔｈｅ５年１２月第１５卷第１２期

同位素稀释法测定乳制品中的残留氯霉素

同位素稀释法测定乳制品中的残留氯霉素唐吉旺;周丛;林源;肖泳;钟文涛;吴海智【摘要】建立了同位素稀释高效液相色谱串联质谱测定乳制品中氯霉素残留的方法;往待测样品中加入同位素内标氯霉素-D5,用乙腈进行提取,取部分提取液加水稀释,并于4℃放置1h后冷冻、离心分离,取上清液进行负离子选择反应监测模式下的液相色谱-质谱技术检测;并确定了优化检测条件.结果表明,在优化的检测条件下,该方法在0.1～10μg/L氯霉素浓度范围内有良好的线性关系,相关系数为0.999 8,检出限(S/N=3)为0.1μg/kg.其在不同添加水平(0.02、2、10 μg/L)下对液体乳和奶粉两种样品的平均回收率分别为95.0％～102.5％和90.0％～101.0％,相对标准偏差分别为1.86％～5.35％和2.16％～5.64％.该方法操作简便快速、灵敏度高、重现性好、便于大批量的样品分析,符合法规残留限量监测要求,为监测乳制品质量安全提供了一种较好的检测手段.【期刊名称】《化学研究》【年(卷),期】2014(025)001【总页数】4页(P86-89)【关键词】同位素稀释;高效液相色谱-串联质谱;乳制品;氯霉素;测定【作者】唐吉旺;周丛;林源;肖泳;钟文涛;吴海智【作者单位】湖南省产品商品质量监督检验研究院,湖南长沙410007;湖南省产品商品质量监督检验研究院,湖南长沙410007;湖南省产品商品质量监督检验研究院,湖南长沙410007;湖南省产品商品质量监督检验研究院,湖南长沙410007;湖南省产品商品质量监督检验研究院,湖南长沙410007;湖南省产品商品质量监督检验研究院,湖南长沙410007【正文语种】中文【中图分类】O657.63氯霉素是一种广谱性抗生素，在所有成年动物中作为兽药被长期使用. 兽医临床上用于治疗畜禽的细菌性疾病. 食品中氯霉素残留对人类的健康构成直接或潜在的威胁,特别是氯霉素能导致人类的再生性障碍性贫血，是一种可能的致癌物质，并且其致癌效果与剂量大小无关. 因此，欧盟、美国、加拿大规定氯霉素严格禁止在食用动物中使用，同时欧盟实施愈来愈严格的计划监控，规定氯霉素在肉、海鲜、鸡蛋、牛奶、蜂蜜等食用动物内的最小执行限量(MRPL)为0.3 μg/kg. 因此,寻求快速、灵敏检测技术，降低方法的检出限成为氯霉素残留检测技术研究焦点[1-4].由于样品本身具有复杂的基质，再加上最低检测限量(<0.3 μg/kg)和检测方法可行性这双重严格标准，氯霉素食物残留分析具有很大的挑战性. 高效液相色谱串联质谱检测技术，推进了液相色谱的发展，其具有特异性和灵敏性，非常适合食物中氯霉素残留的分析. LC-MS/MS运行之前需进行样品制备和前处理. 而传统的前处理过程中用到固相萃取(SPE)和液-液萃取(LLE)技术[5-7]，样品前处理比较费时费力，同时增加了检测成本. 本文作者介绍一种简单样品制备方法，该方法仅仅使用乙腈进行氯霉素的提取，同时进行蛋白质沉淀，将沉淀物分离后即可进行高效液相分离和三重四级杆质谱仪的检测. 此样品前处理方法简单、快速、费用低，同时满足定性分析特异性需求和定量分析的灵敏度要求. 其有效性也符合欧盟规定2002/657/EC.1.1 仪器与试剂高效液相色谱-串联质谱仪(TSQ Quantum Ultra Thermo Fisher Scientific)，配有电喷雾离子源；台式高速冷冻离心机(Neofuge 23R,上海力申科学仪器有限公司)；10 mL聚四氟乙烯离心管；超声仪(SB-5200DT,宁波新芝生物科技股份有限公司).氯霉素(CAP)：纯度≥99.0%；氯霉素氘代内标(CAP-D5)：纯度≥99.9%;乙腈，液相色谱纯.1.2 标准溶液的配制分别准确称取10.0 mg氯霉素和氯霉素-D5，用乙腈定容至100 mL，配制成100.0 mg/L的标准储备液，使用时根据需要用水稀释成相应浓度的标准品溶液. 1.3 样品前处理准确秤取2.0 g液体乳制品或1.0 g固体乳粉(固体乳粉在处理前需加2 mL的40～60 ℃的热水将其溶解)，加入400 μL浓度为100 μg/L的氯霉素-D5溶液，涡旋混匀，再加入3 mL乙腈，涡旋振荡提取1～2 min后，于超声仪中超声30 min. 超声提取后，4 ℃条件下以6 000 r/min冷冻离心10 min. 取上清液0.75 mL，加入0.25 mL水，涡旋混匀，并于4 ℃冰箱中储存1 h. 再以6 000 r/min冷冻离心10 min. 取上清液,用0.22 μm的有机膜过滤，然后进行HPLC-MS/MS测定.1.4 HPLC-MS/MS条件1.4.1 HPLC条件色谱柱：Hypersil GOLDTM柱(100 mm×3 mm,1.9 μm)；流动相：溶剂A为水，溶剂B为甲醇；梯度洗脱程序：0～0.5 min，80% A, 0.5～3.5 min, 80%A～5%A, 3.5～3.9 min,5%A, 3.9～4.0 min, 5%A～80%A,4～5.0 min,80%A. 流速为0.5 mL/min，柱温为35 ℃，进样量为10 μL.1.4.2 MS/MS条件离子源为电喷雾电离离子源(ESI)，扫描方式为负离子扫描，辅助气压力为10 Arb，鞘气压力为45 Arb，离子喷雾电压(IS)为2 800 V，雾化器温度为300 ℃，离子源温度为350 ℃，碰撞气(氩气)压力为1.5 mtorr，检测方式为选择离子监测(SRM)扫描模式.2.1 样品前处理条件的优化由于乳制品样品基质复杂，含有较高浓度的蛋白质及大量的内源性化合物，干扰目标物的测定，因此必须尽量去除蛋白质，减少基质对测试的影响. 此实验方法的主要目的就是为了避免使用许多文献中提到的费时费力的固相萃取(SPE)或是液-液萃取(LLE)制备方法. 氯霉素易溶于乙腈，因此选用乙腈作为提取溶剂，可以对目标化合物进行有效的提取，同时乙腈又能较好地沉淀蛋白质. 实验结果表明，当乙腈与样品溶液的体积比为1.5∶1时，能满足提取效率的要求，达到富集的目的，同时能初步沉淀蛋白质. 取部分乙腈提取液，按照一定的比例加水稀释，这步操作对梯度色谱分离来说是非常必要的. 实验表明，乙腈提取液和水的比例为3∶1时，蛋白质沉淀效果比较好，但是蛋白质的清除是不彻底的. 当在4 ℃的冰箱中放置1 h 后，试管底部出现蛋白质沉淀的痕迹，因此这步操作可以防止未沉淀彻底的蛋白质进入仪器，干扰分析，污染仪器.2.2 色谱条件的优化分别考察了甲醇-水和乙腈-水流动相系统对于目标化合物峰型和离子化效率的影响. 结果表明用甲醇-水溶液作流动相，在梯度洗脱条件下，HPLC-MS/MS分析的色谱峰分离度较好，峰形好且响应高. 因乳制品内源性干扰较多，不宜选用过短的色谱柱，兼顾分析耗时选择色谱柱长为100 mm较为合适.2.3 质谱条件的优化在ESI负离子扫描模式下，对1 mg/L的氯霉素和氯霉素-D5标准溶液进行全扫描. 结果表明，这两种化合物的最强峰均为其准分子离子峰，因此选择分子离子[M-H]-为母离子. 然后分别对准分子离子进行子离子扫描，得到碎片的离子信息，找到强度较大的三个子离子，并优化碰撞能量使其强度最大，将其中一个信号大的子离子作为定量离子，由此得到氯霉素和氯霉素-D5在负离子模式下的质谱分析参数见表1. 所测定标准溶液中氯霉素及其同位素内标氯霉素-D5的SRM色谱图见图1.2.4 标准曲线、线性范围与检出限本方法采用内标法定量. 在上述最佳色谱条件下，检测浓度分别为0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0 μg/L的氯霉素标准工作液，以各浓度峰面积Y对相应浓度X 绘制标准曲线，得到氯霉素的线性回归方程为Y=0.010 64X+0.000 673 2，其相关系数R为0.999 8；以信噪比S/N=3计算出样品中氯霉素的检出限LOD值为0.1 μg/kg. 结果表明在0.10～10 .0 μg/L范围内，浓度与峰面积有良好的线性关系.2.5 方法的回收率和精密度分别准确称取空白液体乳样品或奶粉样品，并分别添加3个水平的标准溶液，添加水平为0.2、2.0和10.0 μg/L，按照前述步骤进行氯霉素的提取、超高效液相色谱-串联质谱法测定，每个添加水平平行测定6次. 加标样品的SRM色谱图见图2. 平均回收率和相对标准偏差(RSD)见表2. 结果表明，氯霉素在液体乳基质中的回收率在95.0%～102.5% 之间，相对标准偏差(RSD)在1.86%～5.35% 之间；氯霉素在奶粉基质中的回收率在90.0%～101.0%之间，相对标准偏差(RSD)在2.16%～ 5.64%之间.2.6 实际样品检测分别对湖南、贵州及武汉三个省份奶制品中的氯霉素进行了监测，共计65个样品，其中奶粉为18个样，其余均为液体乳及其制品，监测结果为均未检出氯霉素残留. 这表明目前乳制品奶源中的兽药残留得到了较好的控制.结论：本文建立了同位素稀释的HPLC-MS/MS法检测乳制品氯霉素残留的方法，样品前处理简捷方便、处理过程所用有机试剂少、可操作性强，分析成本低，分析效率高，便于大批量的样品分析；同时，质谱分析时间短，方法的检测限低，准确度和精密度均达到了药物残留分析的要求，为监测乳制品质量安全提供了一种较好的检测手段.【相关文献】[1]BOGUSZ M J, HASSAN H, AL-ENAZI E, et al. Rapid determination of chloramphenicol and its glucuronide in food products by liquid chromatography-electrospray negative ionization tandem mass spectrometry [J]. Chrom B, 2004,807(2): 343-356.[2]TAO D. Effects of sample preparation and high resolution SRM on LC-MS-MS determination of chloramphenicol in various food product [C]. Poster Presentation, 53rd ASMS Conference, San Antonio, TX, USA, June 5-9, 2005.[3]GALLO P. Development of a liquid chromatography/electrospray tandem mass spectrometry method for confirmation of chloramphenicol residues in milk after alfa-1-acid glycoprotein affinity chromatography [J]. Rapid Commun Mass Spectrom, 2005, 19(4): 574-579.[4]王淑敏, 李照山, 屈建莹. 多壁碳纳米管修饰玻碳电极伏安法测定氯霉素[J]. 化学研究, 2007,18(3): 83-86.[5]那文志, 段文超, 姜源等. 超高效液相色谱串联质谱法检测牛奶及奶粉中氯霉素残留[J].生命科学仪器, 2013，1(1): 23-26.[6]王浩, 杨红梅，郭启雷, 等. 液相色谱-串联质谱法快速同时测定婴幼儿配方乳粉中氯霉素、三聚氰胺、甲硝唑和洛硝达唑[J]. 分析化学, 2013(2): 283-287.[7]巩军, 褚中秋, 姜金斗. 超高效液相色谱—三重四级杆质谱测定乳与乳制品中氯霉素的残留[J]. 中国乳品工业, 2012(7): 14-17.。

牛奶中氯霉素及四环素类抗生素的反相高效液相色谱快速测定

Simultaneous Determination of Tetracycline,
Oxytetracycline, Chlorotetracycline, and
Chloramphenicol in Cow Milk by RP-HPLC 作者：韦文惠
作者机构：柳州职业技术学院,广西柳州545006
出版物刊名：柳州职业技术学院学报
页码： 77-80页
主题词： HPLC;氯霉素;四环素;金霉素;土霉素
摘要：利用反相高效液相色谱法（RP—HPLC），在Spherisorb C18柱上以乙腈-0．2g／L氨三乙酸（pH2．5）（体积比20：80）为流动相，柱温35℃，于267nm紫外检测牛奶中残留的氯霉素（CP）、金霉素（CTC）、土霉素（OTC）、四环素（TC）。

考查了流动相的组成、流动相pH等因素对分离度的影响。

实验条件下，四种抗生素在试验浓度范围内色谱峰面积与浓度呈现良好线性关系。

四种抗生素的加标回收率分别为：土霉素为105％，四环素为90％，金霉素为82％，氯霉素为87％；检测限（SIN=3）分别为土霉素为0．35mg／L、四环素为0．30mg／L、金霉素为0．80mg／L、氯霉素为0．70mg／L。

方法简单、快速，可用于奶制品中这些抗生素的检测。

高效液相色谱法测定牛奶中残留的氯霉素

高效液相色谱法测定牛奶中残留的氯霉素张将乐【摘要】主要针对抗生素中氯霉素的研究现状以及高效液相色谱(HPLC)在检测食品中氯霉素残留的应用,以菊乐(样品1)、华西(样品2)两品牌牛奶为对象建立了牛奶中氯霉素残留的HPLC检测方法:以275 nm作为检测波长,乙腈为提取溶剂,并加入无水硫酸钠防止样品中水分及干扰成分进入提取液,促使蛋白质变性分散,防止样品结块状,有利于降低乳化和提高振荡提取的效率.两品牌均未检测出氯霉素的存在.该方法简便、快速、灵敏,样品加标回收率在91.6%~127.1%之间,可以满足牛奶中氯霉素检测的需要.%The research status of chloramphenicol in antibiotics and the application of high performance liquid chromatography (HPLC) in the detection of chloramphenicol residues in food were ing Chrysanthemum (sample 1) and Huaxi (sample 2),determination of chloramphenicol residues in HPLC was carried out,taking 275 nm as the detection wavelength,acetonitrile as the extraction solvent,and adding anhydrous sodium sulfate to prevent the sample of water and interference components into the extract,to promote protein denaturation and prevent the sample agglomerate,Which was beneficial to reduce the emulsification and improve the efficiency of oscillation extraction.No presence of chloramphenicol was detected in both brands.The method was simple,rapid and sensitive.The recoveries of the samples were between 91.6% and 127.1%,which can meet the requirement of chloramphenicol detection in milk.【期刊名称】《广州化工》【年(卷),期】2017(045)011【总页数】3页(P152-153,165)【关键词】抗生素;氯霉素;高效液相色谱;牛奶【作者】张将乐【作者单位】成都理工大学材料与化学化工学院,四川成都 610059【正文语种】中文【中图分类】O661.1氯霉素抗菌谱较广，能抑制革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌，由于其价格低廉、抗菌性能好，是预防和治疗牛乳房炎等疾病的主要药物，但其残留对人体健康的危害不容忽视，它能够导致严重的再生障碍性贫血，并且其发生与使用剂量和频率无关。