实验六、抗菌药物的体外药效试验
抗菌药物的体外抑菌及体内抗菌实验
《生物工程综合实验平台》——《抗菌药物的体外抑菌及体内抗菌实验》专业班级：学号：姓名：小组成员：实验日期：5月27日-5月30日微生物综合实验抗菌药物的体外抑菌及体内抗菌实验班级16级生物技术1、2班姓名学号座位号实验日程安排抗菌药物的体外抑菌及体内抗菌实验一、实验原理抗菌药物一般是指具有抑菌或杀菌活性的药物，包括各种抗生素、磺胺类、咪唑类、硝基咪唑类、喹诺酮类等化学合成药物。
由细菌、放线菌、真菌等微生物经培养而得到的某些产物，或用化学半合成法制造的相同或类似的物质，也可化学全合成。
抗菌药物在一定浓度下对病原体有抑制和杀灭作用。
药物的体外抑菌实验，是指在体外测定药物抑制或杀灭细菌能力的实验。
它是常用抗菌实验的方法，其中最常用的方法有系列稀释法和琼脂扩散法。
稀释法有液体培养基连续稀释法和固体稀释法（斜面法）两种，这两种方法都可以用来测定药物的最小抑菌浓度（MIC）：是指该药物能抑制细菌生长的最低浓度，通常用ug/ml或U/ml表示。
其结果判断方法为凡无肉眼可见细菌生长的药物最低浓度即为该菌的最小抑菌浓度（MIC）。
琼脂扩散法是将抗菌药物加至接种试验菌的平板表面，抗菌药物在琼脂胶内向四周自由扩散，其浓度随扩散距离增大而降低。
在药物一定的扩散距离内，由于药物的抗菌效应，试验菌不能生长，此无菌生长的范围称为抑菌圈。
抑菌圈的大小与药物的抑菌效应成正比。
琼脂扩散法常有纸片法、管碟法、打洞法和挖沟法。
一般药敏实验常采用纸片法，我们可以根据抑菌圈的大小，来判断菌种对药物的敏感性，是敏感，中度敏感还是耐药。
世界卫生组织规定了抗菌药物的敏感性评定标准，在标准实验条件下根据抑菌圈的大小来判断，如：药物的体内抗菌实验又称为动物实验治疗试验或保护力试验。
当抗菌药物进入机体后，其效力的发挥要受体内各种因素的影响。
如血液及组织内的蛋白质或磷脂、浓汁内的核酸均与药物结合，降低药物的活性；坏死组织内的酸性环境也能影响药物的活性。
实验六 体外抑菌实验
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记录实验结果
管号
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
稀释倍数
1
1/2
1/4
1/8
1/1 6
1/3 2
1/6 4
1/1 28
1/2 56
0
稀释浓度(u/ml)
128
64
32
16
8
4
2
1
0.5
－
金色葡萄球菌
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【注意事项】 注意事项】
1. 接种细菌时要在无菌条件下均匀涂抹；用过的棉 签火焰烧灼后丢弃。 2. 用试管二倍稀释法测MIC值，稀释时注意 稀释的顺序；每次移液前注意清洗吸管。 3. 药敏片之间要间隔适当距离，以免抑菌圈 出现交叉。 4. 四人一组，纸片法每人一个平皿，作四种药物对 一种菌的作用，同组每人所接菌种不同，平皿上 做好记号。结果记录时将本组结果综合。
动物机能学实验2 动物机能学实验
编者：陈小军 编者：
实验内容
实验一 实验二 实验三 实验四 实验五 实验六 实验七 实验八 影响药物作用的因素 药物代谢动力学实验 处方与药物的配伍禁忌 中毒与解救试验 药物对离体肠的影响 抗微生物药物的体外抑菌实验 生物碱的提取及其药敏实验 药物对离体心脏的影响
实验六、 实验六、抗菌药物的体外抑菌实验
【实验目的】 掌握药敏试验的方法，了解药物对常见 菌的作用。 意义： 意义： • 体外抗菌试验对临床用药具有参考价值。 体外抗菌试验对临床用药具有参考价值。 • 鉴定新药是否具有抗菌活性。 鉴定新药是否具有抗菌活性。
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最新体外抗菌药物抑菌试验(亦称细菌对药物的敏感试验-简称药...-药学医学精品资料
3 用灭菌棉拭子蘸取相当于1.5×108CFU/m1 的金黄色葡萄球菌菌液，在试管内壁旋转挤 去多余菌液后，在MHA 平板表面上，从不同 方向均匀涂布3次，每次旋转平板60度，最后 沿平板内缘涂抹1圈。同样方法涂布大肠埃希 菌。
4
5
平板在室温下干燥3～5min后。根据试验菌 株选择抗菌谱。如阳性球菌:金黄色葡萄球菌 选择青霉素(PEN)、苯唑西林(OXA) 环丙沙 星(CIP)、万古霉素(VAN)、克林霉素(CLI)等。 大肠埃希菌选用氨苄西林(AMP)、头抱唑林 (FZN)、庆大霉素(GEN)、环丙沙星(CIP)、 亚胺配南(IMP)等。 用无菌镊子将含药纸片，紧贴于琼脂表面， 各纸片之间相距应大于24mm，纸片距平板 内缘应大于15mm，置37℃孵育18h～24h观 看结果。
原理 是将定量抗菌药物纸片贴在涂有细菌的 琼脂平板上，抗菌药物在琼脂内向四周扩散， 其浓度逐渐递减，使纸片周围的敏感细菌受 到抑制生长，形成抑菌圈，测量抑菌圈的直 径来判定细菌对药物的敏感程度。此法简单 易行、价格便宜、药物选择灵活，适用对生 长快的细菌进行药敏试验。
材料
1 水解酪蛋白琼脂（Mueller-Hinton AgarMHA） 倾注成4mm厚的12～15cm平板，将其保存 于4℃冰箱可用1周。 2硫酸钡比浊管 1.175%氯化钡 （BaCl2 .2H2O）0.5ml加0.36N(1%)流酸溶 液99.5ml,充分混匀，每管4ml其浊度相当于 0.5麦氏（McFarland standard）比浊管第一 管1/2（1.5亿/ml相当于1.5×108CFU／m1）, 使用期半年。
操作方法
药物原液配制 原液浓度常为测定浓度的10倍以上。根据药 物性能选择溶剂。例如 取青霉素钾注射粉剂80万u/支 + 蒸馏水 4ml→20万u /ml，取1ml +9mlMH 肉汤→2万 u /ml，取2万u /ml的5.12ml药液+MH肉汤 14.88ml→5120 u /ml，分装4ml/支，-20℃保 存）。
抗菌药物的体外抑菌及体内抗菌实验
《生物工程综合实验平台》——《抗菌药物的体外抑菌及体内抗菌实验》专业班级：学号：姓名：小组成员：实验日期：5月27日-5月30日微生物综合实验抗菌药物的体外抑菌及体内抗菌实验班级16级生物技术1、2班姓名学号座位号实验日程安排抗菌药物的体外抑菌及体内抗菌实验一、实验原理抗菌药物一般是指具有抑菌或杀菌活性的药物，包括各种抗生素、磺胺类、咪唑类、硝基咪唑类、喹诺酮类等化学合成药物。
由细菌、放线菌、真菌等微生物经培养而得到的某些产物，或用化学半合成法制造的相同或类似的物质，也可化学全合成。
抗菌药物在一定浓度下对病原体有抑制和杀灭作用。
药物的体外抑菌实验，是指在体外测定药物抑制或杀灭细菌能力的实验。
它是常用抗菌实验的方法，其中最常用的方法有系列稀释法和琼脂扩散法。
稀释法有液体培养基连续稀释法和固体稀释法（斜面法）两种，这两种方法都可以用来测定药物的最小抑菌浓度（MIC）：是指该药物能抑制细菌生长的最低浓度，通常用ug/ml或U/ml表示。
其结果判断方法为凡无肉眼可见细菌生长的药物最低浓度即为该菌的最小抑菌浓度（MIC）。
琼脂扩散法是将抗菌药物加至接种试验菌的平板表面，抗菌药物在琼脂胶内向四周自由扩散，其浓度随扩散距离增大而降低。
在药物一定的扩散距离内，由于药物的抗菌效应，试验菌不能生长，此无菌生长的范围称为抑菌圈。
抑菌圈的大小与药物的抑菌效应成正比。
琼脂扩散法常有纸片法、管碟法、打洞法和挖沟法。
一般药敏实验常采用纸片法，我们可以根据抑菌圈的大小，来判断菌种对药物的敏感性，是敏感，中度敏感还是耐药。
世界卫生组织规定了抗菌药物的敏感性评定标准，在标准实验条件下根据抑菌圈的大小来判断，如：药物的体内抗菌实验又称为动物实验治疗试验或保护力试验。
当抗菌药物进入机体后，其效力的发挥要受体内各种因素的影响。
如血液及组织内的蛋白质或磷脂、浓汁内的核酸均与药物结合，降低药物的活性；坏死组织内的酸性环境也能影响药物的活性。
药物的体外抗菌试验-第十九章
药物的体外抗菌试验-第十九章第十九章药物的体外抗菌试验教学要求.（一）掌握常用的体外抑菌试验（连续稀释法、琼脂扩散法）。
.（二）熟悉杀菌试验（最低杀菌浓度、最低致死浓度的含义及测定的方法，活菌计数法，石碳酸系数测定法）；联合抗菌试验（纸条试验、梯度平板纸条试验、棋盘格法），协同、拮抗、无关、累加的概念。
.（三）了解体外抗菌试验的影响因素。
第一节常用的体外抑菌试验一、药物的体外抗菌试验.又称药敏试验，主要用于筛选抗菌药物或测定细菌对药物的敏感性。
.最低抑菌浓度（MIC）：指药物完全抑制某种微生物生长的最低浓度。
.优点：方法简便、需时短、用药量少，不需要动物。
.缺点：不能根据体外试验结果肯定或否定一个药物的抗菌作用。
试验菌.细菌、霉菌和酵母菌常用.标准菌株：来自专门机构，我国是卫生部生物制品检定所菌种保藏中心提供。
.临床分离株：经形态、生化及血清学等方面鉴定。
不得有杂菌污染，不宜用传代多次的菌种，最好是重新活化的。
控制培养时间。
.接种菌量的多少的计算培养基.根据试验菌的营养要求进行选择.培养基质量控制供试药物.药物的浓度和总量要精确配制.供试药物用适宜溶剂溶解并稀释至所需浓度，难溶药物加助溶剂。
.中草药或某些生药原粉的样品，应先提取，再浓缩至所需浓度对照试验.试验菌对照：在无药情况下，应能在培养基内正常生长.已知药物对照：已知抗菌药对标准的敏感菌株应出现预期的抗菌效应，对已知的抗药菌应不出现抗菌效应。
.溶剂及稀释剂对照：抗菌药物配制时所用的溶剂及稀释剂应无抗菌作用（一）连续稀释法.方法：液体法和固体法。
.用于测定药物的最低抑菌浓度（MIC）和最低杀菌浓度（MBC）。
.抑菌：药物可抑制微生物生长繁殖，但不杀死它，在药物除去后，微生物又可恢复生长.杀菌：药物能杀死微生物，当药物去除后，微生物不再继续生长。
1、液体培养基稀释法.方法：两倍稀释法.步骤：液体培养基稀释药物成系列递减的浓度每管加入一定量试验菌24-48小时后肉眼观察试管浑浊情况，记录能抑制细菌生长的最低浓度（MIC）将未见细菌生长的各试管内的培养液（各吸取0.1ml）移种到新鲜的琼脂培养基上重新长出细菌的只具有抑菌作用，无菌生长（菌落数﹤5个）具有杀菌作用，记录最低杀菌浓度（MBC）。
高级药理学 体外抗菌活性试验
体 外 抗 菌 活 性 试 验
三、比浊法
2. 步骤 将检品液也稀释成1~3种不同浓度， 种不同浓度， 将检品液也稀释成 种不同浓度 加入肉汤菌液培养基中。 加入肉汤菌液培养基中。 将全部试管移至37℃ 将全部试管移至 ℃恒温水浴箱 中约3~4h，待细菌充分生长后取 中约 ， 用光电比色计测定其透光度， 出，用光电比色计测定其透光度， 根据同浓度的读数求出平均值， 根据同浓度的读数求出平均值， 然后绘出标准曲线。 然后绘出标准曲线。 将检品管同样求出平均值， 将检品管同样求出平均值，根据 标准曲线即可求出被检品的效价。 标准曲线即可求出被检品的效价。
体 外 抗 菌 活 性 试 验
三、比浊法
2. 步骤 将标准药液稀释成不同稀释度 1:10,1:15,1:20,1:30,1:40。然后于 。 大小相同的试管内加入8.8mL肉 大小相同的试管内加入 肉 汤培养基， 汤培养基，同时接种试验菌液 0.2mL。取上述已稀释好的标准 。 稀释液1mL加入肉汤菌液试管中。 加入肉汤菌液试管中。 稀释液 加入肉汤菌液试管中 此时的稀释倍数为 1:100,1:150,1:200,1:300,1:400
无细菌生长的一管为最低抑菌浓度 （MIC）。 ）。
一、稀释法
稀 释 法
(二)固体稀释法 二 固体稀释法 2. 平皿稀释法 取平皿13只 加入不同浓度的药液 取平皿 只,加入不同浓度的药液 各1mL,第1~12平皿各加融化的普 第 平皿各加融化的普 通琼脂培养基9.0mL，第13平皿作 通琼脂培养基 ， 平皿作 为对照不加药，加入10mL培养基， 培养基， 为对照不加药，加入 培养基 均匀摇动使其与药液合一。 均匀摇动使其与药液合一。待琼 脂凝固、表面干燥后接种试验菌。 脂凝固、表面干燥后接种试验菌。 培养24~48h，观察结果，求出 置37 ℃培养 ，观察结果，
抗生素体外抑菌实验实验报告
抗生素体外抑菌实验实验报告本实验旨在探究不同类型抗生素对某一细菌菌种的体外抑菌效果。
实验原理：细菌的体外抑菌实验是评估抗菌药物对细菌生长的影响的一种常见方法。
该实验通过在固体培养基上为细菌划线，将抗生素药物涂布在纸片上，再放置于已划好细菌的平板培养基上。
通过比较不同类型药物涂布的纸片与对照的空白纸片对细菌生长的影响，从而评价药物的抑菌作用。
实验步骤：1.选取一种目标细菌，本实验选用金黄色葡萄球菌。
2.准备好含有所需抗生素的培养基。
3.将目标细菌接种在平板培养基上并使其生长至对数生长期。
4.在平板培养基上划线并将贴有不同抗生素药物的纸片置于相应位置。
5.将培养基培养在恰当条件下，通常需要48小时，直到菌落在对照组与不同抗生素组之间的差异变得显著。
6.通过比较不同种类抗生素药物对金黄色葡萄球菌的体外抑菌效果进行分析。
实验结果：利用本实验方法，我们测试了对金黄色葡萄球菌的八种不同类型的抗生素的体外抑菌效果。
实验结果表明不同类型抗生素的抑菌效果明显不同。
其中，抗菌肽和β-内酰胺类抗生素对金黄色葡萄球菌生长的抑制效果最强，其次是氨基糖苷和磺胺类抗生素。
而抗酸菌素类抗生素和大环内酯类抗生素显示出对金黄色葡萄球菌的较弱抑菌能力，而两性霉素B和卡那霉素则没有表现出任何抑菌效果。
实验结论：通过本实验，我们得出了不同类型抗生素对某一细菌（金黄色葡萄球菌）的体外抑菌效果。
不同类型抗生素的抑菌效果明显不同。
抗菌肽和β-内酰胺类抗生素对金黄色葡萄球菌生长的抑制效果最强，其次是氨基糖苷和磺胺类抗生素。
而抗酸菌素类抗生素和大环内酯类抗生素显示出对金黄色葡萄球菌的较弱抑菌能力，而两性霉素B和卡那霉素则没有表现出任何抑菌效果。
这些实验结果对于抗菌药物选择和用药方案的制定具有重要参考意义。
药物的体外抗菌试验
滤纸片法： 滤纸片法： 制成含菌平板后， 制成含菌平板后，将滤纸片蘸取药液置 于平板上，培养后观察结果， 于平板上，培养后观察结果，量取抑菌圈直 径以此判断试验药物抑菌作用的强弱。 径以此判断试验药物抑菌作用的强弱。 用于新药的初筛及临床的药敏试验。 用于新药的初筛及临床的药敏试验。 新药的初筛及临床的药敏试验
在实际工作中， 在实际工作中，往往可见到体外实验有 作用的药物， 作用的药物，进入机体后由于各种原因而失 效，有的药物毒性很大也不能用于临床。 有的药物毒性很大也不能用于临床。
抗菌试验的影响因素
3、抗菌药物 、 药物的浓度、 及含有的其他成分均可 药物的浓度、pH及含有的其他成分均可 影响试验结果， 影响试验结果，特别是中草药制剂往往含有 色素、杂质和鞣质等， 色素、杂质和鞣质等，这些均可造成错误结 果，应加注意。 应加注意。
抗菌试验的影响因素
4、对照试验： 、对照试验： 为精确判断实验结果， 为精确判断实验结果，试验时应设各种对 照，包括试验菌对照、已知药物对照及溶剂 包括试验菌对照、 和稀释液对照等。 和稀释液对照等。
抗菌试验的影响因素
2、培养基 、 抗菌试验的培养基应按试验菌的需求配制， 抗菌试验的培养基应按试验菌的需求配制，如链球 菌常用含血清的肉汤培养基， 菌常用含血清的肉汤培养基，抗真菌药物试验需用 沙氏培养基。 沙氏培养基。 培养基的酸碱度、电解质、 培养基的酸碱度、电解质、还原性物质等均可影响 试验结果， 试验结果，实验时应尽可能排除各种影响实验结果 因素的掺入。 因素的掺入。 经无菌检查合格。 经无菌检查合格。
液体连续稀释法
1、在一系列的试管中用液体培养基将试验药 在一系列的试管中用液体培养基将试验药 物作连续对倍稀释， 物作连续对倍稀释，使药物的浓度沿试管顺 序成倍递减。 序成倍递减。 2、再于各管中加入等量的实验菌，经 16～ 、再于各管中加入等量的实验菌， ～ 24 h培养后，与阴性及阳性对照管进行对照 培养后， 培养后 观察。 观察。 3、将未长细菌的培养液取出，分别转种琼脂 、将未长细菌的培养液取出， 平皿。如培养后重新长出试验菌， 平皿。如培养后重新长出试验菌，说明该药 仅有抑菌作用。 仅有抑菌作用。如无菌生长则可以认为该药 物有杀菌作用。 物有杀菌作用。
体外药敏试验实验报告
一、实验目的本实验旨在通过体外药敏试验，测定某病原菌对不同抗菌药物的敏感性，为临床合理用药提供科学依据。
二、实验材料1. 实验菌株：选取某病原菌为实验菌株，如金黄色葡萄球菌、大肠杆菌等。
2. 抗菌药物：选择临床常用的抗菌药物，如青霉素、头孢菌素、喹诺酮类等。
3. 实验仪器：微量稀释器、无菌操作台、恒温培养箱、比浊仪等。
4. 实验试剂：M-H肉汤培养基、药敏纸片、药敏试剂盒等。
三、实验方法1. 菌液制备：将实验菌株接种于M-H肉汤培养基，37℃培养24小时，制成菌悬液，用比浊仪测定其浓度，调整至1×10^6 CFU/mL。
2. 药敏纸片法：- 将制备好的菌悬液均匀涂布于M-H琼脂平板上。
- 将药敏纸片贴于平板表面，确保纸片与琼脂平板紧密接触。
- 将平板倒置，37℃培养24小时，观察抑菌圈的大小。
3. 微量稀释法：- 将M-H肉汤培养基加入微量稀释器中，制成一系列不同浓度的抗菌药物溶液。
- 将菌悬液加入微量稀释器中，与抗菌药物溶液混合均匀。
- 将混合液接种于M-H琼脂平板上，37℃培养24小时，观察菌落生长情况。
- 根据抑菌圈的大小或菌落生长情况，计算最低抑菌浓度（MIC）。
四、实验结果1. 药敏纸片法：- 青霉素：抑菌圈直径为15mm，判定为敏感。
- 头孢菌素：抑菌圈直径为18mm，判定为敏感。
- 喹诺酮类：抑菌圈直径为20mm，判定为敏感。
2. 微量稀释法：- 青霉素：MIC为0.125mg/L，判定为敏感。
- 头孢菌素：MIC为0.25mg/L，判定为敏感。
- 喹诺酮类：MIC为0.5mg/L，判定为敏感。
五、实验讨论1. 本实验采用药敏纸片法和微量稀释法测定了某病原菌对不同抗菌药物的敏感性，结果显示该菌株对青霉素、头孢菌素和喹诺酮类均表现为敏感。
2. 体外药敏试验是临床合理用药的重要依据，但应注意以下几点：- 严格遵循实验操作规程，确保实验结果的准确性。
- 定期校准实验仪器，确保实验数据的可靠性。
药物的体外抗菌试验[荟萃精制]
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行业培训
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抗菌试验的影响因素
2、培养基
❖ 抗菌试验的培养基应按试验菌的需求配制，如链球 菌常用含血清的肉汤培养基，抗真菌药物试验需用 沙氏培养基。
❖ 培养基的酸碱度、电解质、还原性物质等均可影响 试验结果，实验时应尽可能排除各种影响实验结果 因素的掺入。
❖ 经无菌检查合格。 行业培训
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抗菌试验的影响因素
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行业培训
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❖ 琼脂扩散法具有方法简便，技术要求不 高，易掌握操作的特点。但精确度不高，一 般能用于定性或初步判断其作用的强弱。
❖ 液体稀释法是一种测定药物的抗菌作用 定量方法，较琼脂扩散法精确，因而运用较 普遍 。
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连续稀释法
❖ 可用于测定药物的最低抑菌浓度（MIC）和 最低杀菌浓度（MBC）。可以用液体培养基， 也可用固体培养基。
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❖ 在实际工作中，往往可见到体外实验有 作用的药物，进入机体后由于各种原因而失 效，有的药物毒性很大也不能用于临床。
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联合抗菌试验的常用方法
一、纸条试验（paper strip test）
即在已接种实验菌的平板表面垂直放置两条浸有一 种药液的滤纸条，培养后根据抑菌区的加强、减弱 或无影响来判断它们在联合应用时的效应。 图20-2是纸条实验的示意图。
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图20-2是纸条实验的示意图。图中A列的两纸条中只有一条含 有抗菌药物，另一条不含抗菌药物；B列的两纸条均含有抗菌
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抗菌试验的影响因素
❖ 1、试验菌： ❖ 用专门的供应机构提供的标准菌株。 ❖ 北京卫生部药品生物制品检定所菌种保藏中
心。 ❖ 试验菌应合理保藏，用前加以纯化及生物学
实验六、抗菌药物的体外药效试验
实验六、抗菌药物的体外药效试验（药敏试验）各种病原菌对抗菌药物的敏感性不同，同种细菌的不同菌株对同一药物的敏感性有差异，检测细菌对抗菌药物的敏感性，可筛选最有疗效的药物，用于临床对控制细菌性传染病的流行至关重要。
此外，通过药物敏感试验可为新抗菌药物的筛选提供依据。
药敏试验的方法很多，普遍使用的有滤纸片扩散试验（Kirby-Baueer Dice Diffusion）；最低抑菌浓度试验（Minimum Inhibitory Concentration, MIC）和最低杀菌浓度试验（Minimum Bactericidal Concentration, MBC）。
［目的要求］1、熟悉体外抗菌试验操作技术。
2、掌握药物抗菌能力体外测定的常用方法及其用途。
［实验原理］常用的体外测定药物抑菌能力的方法有两大类：琼脂渗透法与浓度系列稀释法。
琼脂渗透法时利用药物能够渗透至琼脂培养基的性能，将实验菌混入琼脂培养基后倾注成平板；或将试验菌均匀涂于琼脂平板的表面，然后用不同的方法将药物置于已含试验菌的琼脂平板上。
根据加药的操作方法不同而有滤纸片法、打洞法、管碟法及挖沟法等。
经适宜温度培养后观察药物的抑菌能力。
浓度系列稀释法时把药物稀释成不同的系列浓度，混入培养基内，加入一定量的试验菌，经适宜温度培养后观察结果，求得药物的最低抑菌浓度（MIC）。
1、细菌：所用细菌应包括主要致病菌。
革兰氏阳性球菌包括金黄色葡萄球菌(产酶与不产酶菌株)、表皮葡萄球菌，链球菌、肠球菌等。
革兰氏阴性球菌如淋球菌等。
革兰氏阴性杆菌包括流感杆菌、肠杆菌科细菌8～10种，绿脓杆菌与其它假单孢菌属及不动杆菌属等，厌氧菌包括脆弱类杆菌、消化球菌和消化链球菌等。
对临床应用有代表性的菌株数量，创新药应不小于1000株。
其它类新药根据新药抗菌谱宽窄可作200-500株。
试验时应包括有国际公认质控菌株(如金葡菌ATCC25925，大肠杆菌ATCC25922和绿脓杆菌ATCC27853等)。
药效体外测定实验报告
药效体外测定实验报告实验目的：本实验旨在通过体外测定药效的方法，研究药物的药效作用，为药物的临床应用提供参考。
实验原理：体外药效测定主要通过体外实验，即在体外环境中观察药物的药效作用。
常用的体外测定方法包括酶联免疫吸附法（ELISA）、光谱法、细胞毒性测定法等。
本实验选择适合的体外测定方法，以测定药物的药效。
实验材料与仪器：1. 药物样品2. 细胞系及培养基3. 96孔板4. 酶标仪5. 离心机6. 洗板机7. 实验室培养箱实验步骤：1. 细胞培养与处理1.1 将细胞系接种至培养瓶中，使用适当的培养基进行培养。
1.2 根据试验设计，将细胞分配到96孔板中，使每个孔的细胞数相近。
1.3 添加适当的培养基，使细胞在培养基中生长。
1.4 放置在实验室培养箱中，以适当的条件（如温度、湿度、气体组成等）进行培养。
2. 药物处理与干预2.1 在培养基中添加不同浓度的药物样品。
2.2 设置药物的处理组和对照组，在对照组中不添加药物。
2.3 设计药物处理的时间和浓度梯度，使实验结果具有可比性和可信度。
3. 药效测定3.1 根据实验设计，在药物处理后的适当时间点，收集细胞培养上清液。
3.2 使用酶标仪进行药效的测定，比如ELISA法测定特定蛋白质的含量，光谱法测定某种物质的浓度等。
4. 数据处理与分析4.1 根据实验所采用的测定方法，对实验数据进行统计分析。
4.2 使用适当的统计方法，如方差分析等，对不同处理组之间的差异进行比较和评估。
4.3 绘制结果图表，解释实验结果。
实验注意事项：1. 培养细胞时，应确保细胞处于健康状态，培养基应根据细胞系的要求进行配制。
2. 药物处理时要严格按照实验设计进行，遵循安全操作规范。
3. 测定结果应进行重复实验验证，并保证数据的可靠性和稳定性。
4. 实验完成后，应及时清理实验区域，妥善处理实验废弃物。
实验结果与讨论：根据实验所测定的药效数据，进行数据分析和统计处理，得出实验结果。
体外抑菌实验
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二、纸片法
取已经制备好的6种药敏片：青霉素 20000μ/ml、链霉素、多西环素、10％磺胺二甲嘧 啶钠，10％恩诺沙星，碘酒2.5％ ，放置在已接种 细菌的琼脂平板表面的不同区域。为了位置间隔 准确，最好事先在平皿底用蜡笔作上记号。 将培养皿置37℃培养24h，观察纸片周围有无 抑菌环，并测量抑菌圈的直径，比较各药的抗菌 效力。样例如下图：
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试管号 牛肉膏汤 （ml） 青霉素（ml） 葡萄球菌液 （ml）
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• １－８，１０管各加入培养18 h并用牛肉膏 汤稀释至5X１０７～ １０８ｃｆｕ／ｍｌ的 金黄色葡萄球菌菌液０．５ml。放入37℃培 养箱内培养24h后，取出观察细菌生长情况。 • 以能抑制细菌生长的最小浓度为青霉素对该 细菌的最低抑制浓度（MIC）。 • 结果记录于下表：
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【思考题】
• 分别以抑菌圈的大小和MIC值来比较 常见药物对金黄色葡萄球菌的作用强度。
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Careful ,then successful !
【实验目的】
掌握药敏试验的方法，了解药物对常见 菌的作用。
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药物的体外抑菌试验
实验五药物的体外抗菌试验药物的抗菌试验是为了检查药物的抗菌能力.该项试验方法已广泛应用于新药研究和指导临床用药.如抗菌药物的筛选，提取过程的生物追踪、抗菌谱的测定、耐药谱的测定、药敏试验、药物血浓度测定等各个方面.药物的体外抗菌试验在实验室进行,优点是方法简便、需时短、用药量少，不需要活的动物、实验条件容易控制。
因此，药物的体外抗菌试验已广泛应用各种测定了。
药物的体外抑菌试验是常用抗菌试验方法，其中最常用的方法用系列稀释法和琼脂扩散法.(一）稀释法（结果示教）稀释法有液体培养基连续稀释法和固体稀释法（斜面法)两种.这两种方法都可以用来测定药物的最小抑菌浓度（MIC）：是指该药物能抑制细菌生长的最低浓度，通常用μg∕ml或U/ml表示.（二）琼脂扩散法它是将抗菌药物加至接种试验菌的平板表面，抗菌药物在琼脂胶内向四周自由扩散，其浓度随扩散距离增大而降低，在药物一定的扩散距离内，由于药物的抗菌效应,试验菌不能生长，此无菌生长的范围称为抑菌圈,抑菌圈的大小与药物的抑菌效应成正比。
琼脂扩散法常有纸片法、管碟法、打洞法和挖沟法.滤纸片法（K—B纸片法）－学生操作滤纸片法是最常用的方法,适用于新药的初筛试验（初步药物是否有抗菌作用）及临床的药敏试验（细菌药物第三性试验、以便选择用药）。
滤纸片分湿、干两种，可以在试验时用无菌纸片沾取药物溶液放在含菌的平板表面，也以预先做成一定浓度的干燥纸片。
一般来说预先做成的干燥纸片实用一些而且准确一些。
至于干燥纸片的制备方法：选用吸水力强而且质地均匀的滤纸，用打洞机制成6mm直径的圆纸片，120℃干燥灭菌2小时。
然后把配制好的各种适宜浓度的抗生素溶液，每100张纸片加入0。
5ml药液，使它均匀浸润，放在无菌平皿中，37℃，使它干燥，分装小瓶中，封口,4℃保存。
如果是β－内酰胺类抗生素还要放在—20℃保存。
这就制成了干燥的含药液的纸片。
一般药敏试验常采用滤纸片法，我们可以根据抑菌圈的大小，来判断菌种对药物的敏感性，是敏感,中度敏感还是耐药。
体外抑菌实验报告
为了评估不同抗生素药物的抗菌能力，本实验通过体外抑菌实验，观察并记录抗生素对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌等常见细菌的抑菌效果，以期为临床合理用药提供参考。
二、实验材料1. 菌株：金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌等。
2. 药物：头孢克洛、氨苄西林、阿莫西林、庆大霉素、红霉素等。
3. 培养基：牛肉膏蛋白胨琼脂培养基、M-H肉汤培养基。
4. 实验器材：培养皿、移液器、无菌试管、锥形瓶、酒精灯、高压蒸汽灭菌器等。
三、实验方法1. 菌株培养：将菌株接种于牛肉膏蛋白胨琼脂培养基，37℃培养24小时。
2. 药物制备：将抗生素药物溶解于M-H肉汤培养基中，制成不同浓度的药物溶液。
3. 抑菌实验：将培养好的菌株接种于牛肉膏蛋白胨琼脂培养基，制成平板。
将不同浓度的药物溶液滴加于平板上，37℃培养24小时，观察抑菌圈直径。
4. 数据记录：记录不同浓度药物溶液的抑菌圈直径，计算抑菌率。
四、实验结果1. 头孢克洛对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌的抑菌效果较好，抑菌圈直径分别为18mm、15mm、13mm。
2. 氨苄西林对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌的抑菌效果较好，对铜绿假单胞菌的抑菌效果较差，抑菌圈直径分别为12mm、10mm、5mm。
3. 阿莫西林对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌的抑菌效果较好，对铜绿假单胞菌的抑菌效果较差，抑菌圈直径分别为10mm、8mm、4mm。
4. 庆大霉素对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌的抑菌效果较好，抑菌圈直径分别为20mm、18mm、16mm。
5. 红霉素对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌的抑菌效果较好，对铜绿假单胞菌的抑菌效果较差，抑菌圈直径分别为14mm、12mm、6mm。
1. 头孢克洛、庆大霉素等抗生素对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌具有较强的抑菌效果，可作为临床治疗此类细菌感染的首选药物。
2. 氨苄西林、阿莫西林等抗生素对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌的抑菌效果较好，但对铜绿假单胞菌的抑菌效果较差，临床应用时需注意。
实验六、抗菌药物的体外药效试验
实验六、抗菌药物的体外药效试验(药敏试验）各种病原菌对抗菌药物的敏感性不同，同种细菌的不同菌株对同一药物的敏感性有差异，检测细菌对抗菌药物的敏感性，可筛选最有疗效的药物，用于临床对控制细菌性传染病的流行至关重要。
此外,通过药物敏感试验可为新抗菌药物的筛选提供依据。
药敏试验的方法很多，普遍使用的有滤纸片扩散试验(Kirby —Baueer Dice Diffusion）;最低抑菌浓度试验（Minimum Inhibitory Concentration，MIC）和最低杀菌浓度试验(Minimum Bactericidal Concentration, MBC）.［目的要求］1、熟悉体外抗菌试验操作技术。
2、掌握药物抗菌能力体外测定的常用方法及其用途.［实验原理］常用的体外测定药物抑菌能力的方法有两大类：琼脂渗透法与浓度系列稀释法.琼脂渗透法时利用药物能够渗透至琼脂培养基的性能，将实验菌混入琼脂培养基后倾注成平板；或将试验菌均匀涂于琼脂平板的表面,然后用不同的方法将药物置于已含试验菌的琼脂平板上。
根据加药的操作方法不同而有滤纸片法、打洞法、管碟法及挖沟法等。
经适宜温度培养后观察药物的抑菌能力.浓度系列稀释法时把药物稀释成不同的系列浓度，混入培养基内,加入一定量的试验菌，经适宜温度培养后观察结果，求得药物的最低抑菌浓度（MIC）.1、细菌:所用细菌应包括主要致病菌。
革兰氏阳性球菌包括金黄色葡萄球菌(产酶与不产酶菌株)、表皮葡萄球菌，链球菌、肠球菌等。
革兰氏阴性球菌如淋球菌等。
革兰氏阴性杆菌包括流感杆菌、肠杆菌科细菌8～10种，绿脓杆菌与其它假单孢菌属及不动杆菌属等，厌氧菌包括脆弱类杆菌、消化球菌和消化链球菌等.对临床应用有代表性的菌株数量，创新药应不小于1000株。
其它类新药根据新药抗菌谱宽窄可作200—500株。
试验时应包括有国际公认质控菌株(如金葡菌ATCC25925，大肠杆菌ATCC25922和绿脓杆菌ATCC27853等)。
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实验六、抗菌药物的体外药效试验（药敏试验）各种病原菌对抗菌药物的敏感性不同，同种细菌的不同菌株对同一药物的敏感性有差异，检测细菌对抗菌药物的敏感性，可筛选最有疗效的药物，用于临床对控制细菌性传染病的流行至关重要。
此外，通过药物敏感试验可为新抗菌药物的筛选提供依据。
药敏试验的方法很多，普遍使用的有滤纸片扩散试验（Kirby-Baueer Dice Diffusion）；最低抑菌浓度试验（Minimum Inhibitory Concentration, MIC）和最低杀菌浓度试验（Minimum Bactericidal Concentration, MBC）。
［目的要求］1、熟悉体外抗菌试验操作技术。
2、掌握药物抗菌能力体外测定的常用方法及其用途。
［实验原理］常用的体外测定药物抑菌能力的方法有两大类：琼脂渗透法与浓度系列稀释法。
琼脂渗透法时利用药物能够渗透至琼脂培养基的性能，将实验菌混入琼脂培养基后倾注成平板；或将试验菌均匀涂于琼脂平板的表面，然后用不同的方法将药物置于已含试验菌的琼脂平板上。
根据加药的操作方法不同而有滤纸片法、打洞法、管碟法及挖沟法等。
经适宜温度培养后观察药物的抑菌能力。
浓度系列稀释法时把药物稀释成不同的系列浓度，混入培养基内，加入一定量的试验菌，经适宜温度培养后观察结果，求得药物的最低抑菌浓度（MIC）。
1、细菌：所用细菌应包括主要致病菌。
革兰氏阳性球菌包括金黄色葡萄球菌(产酶与不产酶菌株)、表皮葡萄球菌，链球菌、肠球菌等。
革兰氏阴性球菌如淋球菌等。
革兰氏阴性杆菌包括流感杆菌、肠杆菌科细菌8～10种，绿脓杆菌与其它假单孢菌属及不动杆菌属等，厌氧菌包括脆弱类杆菌、消化球菌和消化链球菌等。
对临床应用有代表性的菌株数量，创新药应不小于1000株。
其它类新药根据新药抗菌谱宽窄可作200-500株。
试验时应包括有国际公认质控菌株(如金葡菌ATCC25925，大肠杆菌ATCC25922和绿脓杆菌ATCC27853等)。
2、培养基：选MH(Muelkr-Hintop)培养基。
链球菌、流感杆菌需接种到巧克力琼脂平板或加5％羊血。
淋球菌接种到哥伦比亚培养基上。
3、药物配制：试验样品与阳性对照药品均应用称重法求出效价并按盐基比例折算出实际效价。
所试药物用磷酸缓冲液或灭菌注射用水溶解，配制成溶液。
少数难溶药物可加少许相应助溶剂，再用缓冲液或灭菌注射用水稀释至所需浓度。
4、试验方法：①最小抑菌浓度(MIC)测定法，采用平皿或试管二倍稀释法测无细菌生长平皿或试管中所含药物的最小浓度即为最小抑菌浓度。
②最小杀菌浓度（MBC）测定法，先测出MIC，再依次存未见细苗生长各管培养物分别吸取0.1ml，倾倒于平皿上，37再培养18小时，平皿上菌落数小于5个的最小稀释度的药物浓度即为最低杀菌浓度。
③杀菌曲线（KCs）实验，将所试菌液约105菌落计数单位(CFU／ml)与抗菌药物混合，定量取样于平皿培养基，孵育后计算其活菌数，并绘制出时间杀菌曲线。
实验应设空白对照管与已知药物对照试验。
5、培养条件对MIC的影响：①pH值的影响，将培养基的pH调整，测定药物对所试细菌(临床常见致病菌)1～2株MIC的影响。
②细菌接种量的影响, 在其它条件不变时改变细菌接种量，比较不同菌量对MIC的影响。
③血清蛋白结合的影响：如采用25％、50％、75％等不同的血清浓度与不含血清的培养基观察血清含量对MIC的影响。
［试验内容］（一）滤纸片法（圆纸片扩散试验）［材料］无菌平皿1只, 无菌1ml吸管1支,无菌小滤纸片, 待检药（1个平板可做1种或多种药物实验）, 琼脂培养基（瓶装或定量分装15～20ml于大试管，灭菌，备用）, 实验菌肉汤培养基，镊子，95％酒精等。
［方法］①琼脂培养基置于水浴中加热融化，冷却至50℃左右，用无菌操作法吸取菌液（制备每只平板约需0.1～0.2ml）加入琼脂培养基中，迅速混匀，倾注于无菌平皿内，素转动平皿使细菌均匀分布其中，水平放置待凝（也可预先在平皿中铺一层琼脂培养基作底层，冷却后再加一薄层含菌琼脂培养基，如此，可使抑菌圈更加清晰）。
②镊子沾酒精后通过火焰，烧灼灭菌，反复3次，镊取无菌滤纸片，浸沾药液，贴于平板表面，各纸片间的距离药大致相等。
③37℃培养一昼夜后，观察此滤纸片周围有无抑菌圈，并量取其直径。
抑菌圈即无菌生长区，药液在一定浓度范围内，抑菌圈的大小表示抑菌作用的强弱。
［结果判定］根据药物纸片周围有无抑菌圈及其直径大小，来判断该菌对各种药物的敏感程度。
依次可分为：高度敏感，中毒敏感，低度敏感，不敏感四种。
细菌对磺胺类药物的敏感度的标准，按Hawking所定，若磺胺药物浓度在每毫升10μg即能抑制细菌生长者，则该细菌对磺胺药很敏感；如需每毫升50μg才能抑制生长，为敏感；每毫升1000μg才能抑制为中度敏感；每毫升超过1000μg 仍不能抑菌者，则为耐药菌株。
（二）试管稀释法［材料］菌种：金黄色葡萄球菌肉汤培养物；培养基：普通肉汤；抗菌药物：含青霉素64IU/ ml；其他材料：麦氏比浊管，灭菌1 ml刻度吸管，橡皮胶头，无菌试管。
［方法］以葡萄球菌对青霉素的敏感性为例。
将1ml/管排成一列，编上19的管号，在第一个管内加入含64IU/ ml青霉素肉汤1 ml。
混匀后吸取1 ml到第二管，混匀，再取1 ml至第3管，以此类推至第八管。
第9管不含青霉素的肉汤做为对照管。
然后每管加入0.1 ml含菌当量相当于麦氏比浊管第1管1/2的金黄色葡萄球菌（相当于1.5亿/ ml），操作术式见表（三）平板稀释法［材料］无菌平皿，5 ml 无菌吸管，1 ml 无菌吸管，10 ml 无菌吸管，无菌试管，待检药液，灭菌蒸馏水，缓冲液（pH 依药物稳定性而定），实验菌肉汤培养物，琼脂培养基（大试管定量分装成9 ml/支）。
［方法］1、细菌蒸馏水或缓冲液把待检药液配成一系列浓度梯度：1：1，1：2，1：4，1：8，1：16，1：32，1：64，1：128，1：256，（方法同试管稀释法中的二倍稀释）。
2、将每种浓度的待检药液1 ML ，加入9ML50～55℃琼脂培养基中，迅速混匀倾注于无菌平板中，制成一系列药物浓度递减的平板。
3、对照不加药液，即将培养基直接倾入无菌平皿，待冷凝即成。
4、将不同试验菌经适当稀释后，点种再含药平板及对照平板上，接种量约为10CFU/点(colony-forming unit,CFU 菌落形成单位)。
5、37℃培养18～24小时后，观察药物对试验的最大稀释度，再乘以10，得出最大抑制稀释度（即MIC ）。
［注意事项］1、实验中所用试管、吸管。
棉签、镊子、纸片及各种药液配制均应无菌，并按照生物实验常规进行操作。
2、滤纸片法：①到平板时，平板中琼脂培养基的厚薄需均匀一致，以免影试管号 1 23 4 5 6 7 8 9 药物浓度（μg ）3216 8 4 2 1 0.5 0.25 肉汤（ml ）1 1 11 青霉（ml ） 1 1 1 1ml细菌（ml ）0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1响抑菌圈大小。
琼脂板的厚度可影响抑菌圈的大小，一般为2～3mm。
②制备含菌平板时，应特别注意混入菌液时的温度，不能太高，以免烧死细菌。
菌液和培养基混合后应迅速摇匀，使均匀分布。
③培养温度和时间以37℃、18小时最佳，要求温度均匀。
培养石匠过场可能影响抑菌圈的清晰度。
④滤纸片沾取药液时不要太多，以免再平板中流淌，影响抑菌圈形状和大小。
3、试管稀释法：①稀释的准确性每稀释一种浓度换一支吸管，较一支吸管稀释到底准确些。
②加入菌液的浓度菌液浓度大时，则最小抑菌浓度药高，反之亦然。
③菌龄一般认为幼龄菌较敏感，所以多用细菌的6小时培养液。
［思考题］1、怎样判断最后的结果时抑菌还是杀菌？抑菌浓度大还是杀菌浓度大？2、用试管稀释法测定药物的最低抑菌浓度时，主要有哪些因素影响试验结果？3、如药物是一种脂溶性或不太溶于水的物质，是否也可以测定其最定抑菌浓度？如可以，如何进行？4、比较青霉素G钠、庆大霉素、丁胺卡那霉素、头孢呋新、诺氟沙星在体外抑菌的强弱。
5、体外筛选具有抗菌作用的药物能否直接应用于临床? 为什么?实验七、抗菌药物的体内药效观察在体外实验中呈现抗菌作用的药物还可能由于毒性大或体内过程、代谢动力学等原因，在体内发挥不出抗菌效果，需进一步了解其对感染动物是否有效。
体内实验不仅测定敏感性，还包括影响新药治疗的其他的变化因素，如宿主反应，药物到达感染部位的能力，药物的灭活等。
如果在体内也有效，且毒性不大，才有可能过渡到临床，另外，还应注意许多体外无抗菌作用的中草药用于治疗感染性疾病可能会有较好疗效。
［实验目的］1、了解细菌感染实验治疗方法的基本过程；2、观察青霉素的体内抗菌作用及ED50的测定。
［实验材料］1、实验动物及选择原则：小白鼠30只（18～22g ）；选用有合格证动物提供的健康小鼠，体重18～22g ，雌雄各半，随机分组，每组动物至少10只。
2、实验器材及药品等：注射器(1ml)；小试管；试管架；MH 培养基；金黄色葡萄球菌液；5％胃膜素悬液；青霉案G 钠；2.5％碘酊；70％乙醇；5％石炭酸溶液。
3、感染菌种：根据所试药物的抗菌作用特点选择不同菌株进行试验。
常用致病菌如金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、肠杆菌、氏肺炎杆菌、杆菌、痢疾杆菌、伤寒杆菌、绿脓杆菌等。
试验广谱抗生素时感染菌株应包括金葡菌与革兰氏阴性菌各l ～2种。
创新与阴性菌均需作2种以上，每一种菌2株以上，并包括有临床分离的致病菌。
［方法］1、菌液制备：将保存的金黄色葡萄球菌接种MH 培养基中，于37℃培养，16-18小时。
用平皿表面计数法测定实验感染用的活菌数(如条件一致，则不必每次测定)。
将上述菌液用生理盐水以10倍顺序稀释为10-1、10-2、10-3…等不同浓度菌液；再取此不同浓度的菌液1ml 加5％胃膜素悬液9ml 。
即做成浓度力10-2、10-3、10-4...的菌悬液用。
2、预试验：将不同浓度的菌悬液分别腹腔注射于3～5只小鼠，每只0.5ml ，观察其死亡情况。
正式实验时选用最小致死量，即感染后引起小鼠80-100％死亡的菌液浓度进行感染。
常用的病菌的参考用量见本实验附录。
肺炎链球菌和链球菌的腹腔感染可不用胃膜素稀释，而是将在血清MH 培养基中培养16-18小时的菌液腹腔注射0.2～0.5m1，观察24-48动物死亡情况。
①感染菌量：感染前需先测出所试菌株的最小致死量(MLD)，即能引起80-00％动物死亡的菌液浓度)作为感染菌量。
②感染途径：菌源液用5％胃膜素(或干酵母)稀释至所需浓度，经腹腔或尾静脉注射相当于100％致死量的菌液感染小鼠。
3、实验治疗：取18～22g 的小鼠30只。