载脂蛋白E基因型分型方法研究

载脂蛋白E 基因型分型方法研究

钱士匀　覃　西　王丹妹

(海南医学院附属医院检验科)　海口　570102

摘要　目的:为调查海南省老年性痴呆患者载脂蛋白E (Apo E )基因频率,建立一种简便、快速、准

确的人载脂蛋白E 基因型检测方法。方法:应用碘化钠法提取模板DNA ,聚合酶链反应(PCR )特异性扩增Apo E 基因含112位和158位氨基酸的基因序列,扩增产物用限制内切酶Hha I 酶切,聚

丙烯酰胺凝胶电泳后,观察酶切位点的限制性片段长度多态性(RFIP)图谱。结果:碘化钠法提取模板DNA 与经典法无差异;运用PCR -RFIP 法检测30名健康人Apo E 基因型,实验成功。结论:该方法简单、快速、准确,适合于一般实验室开展Apo E 基因型调查。关键词　载脂蛋白E 类;聚合酶链反应;限制性片段长度多态性;基因型分类号　Q 783.1

METHODOLOGY FOR APOLIPOPROTEIN E GENOTYPING

Qian Shiyun,Qin Xi,Wang Danmei

(T he Centr al La bo rat or y,Affiliated Ho spital o f Hainan M edical co llege )　Haikou 570102

ABSTRAC T Objectiv e :T o establish a simple ,im mediate and accurate m ethod fo r apolipoprotein E (Apo E )g enoty ping in patients w ith Alzheim er 's dem entia in Hainan Pro vince .M ethod :The tem-plate DNA w as collected with the NaI method.Apo E gene sequences containing amino acid positions 112and 158w ere amplified for electr ophor esis on poly acrylam ide gels by polym erase chain r eaction (PCR ).The patter ns of restriction fragm ent leng th poly morphism o f Apo E gene w ere distinguished .Results:T he NaI m ethod show ed no difference as com pared w ith the classical metho d for collecting tem plate DNA.T hus,Apo E g enoty ping by PCRRfip w as carried o ut w ith success in 30healthy indi-viduals .Conclusion :T he metho d is considered to be sim ple ,imm ediate ,and accur ate fo r Apo E g eno-ty ping in ordinary labo rato ries .

Key words Apo lipoprotein E;PCR;restriction fragm ent length po lymo rphism ;genotype 载脂蛋白E (Apo E )是一种富含精氨酸的碱性蛋白质,Apo E 在脂类代谢中起着重要的作用,Uterman [1]等1975年首先报道了Apo E 存在的3种异构体,即E 2,E 3,E 4,3种异构体分别由3个共

显性等位基因E 2、E 3、E

4所决定,3种常见的等位基因可产生6种不同的基因型:E 2/2、E 3/2、E 4/3、E

3/3、E 4/3及E 4/4。近年来研究发现Apo E 等位基因与冠心病、动脉粥样硬化、迟发性家族性Alzheimer 病及脂质代谢紊乱密切相关,Apo E 多

态性的研究目前是医学热门研究项目,Apo E 表型

和基因型的研究方法众多[2～4],本文采用聚合酶链反应限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)技术,测定Apo E 基因型,为调查分析人群Apo E 基因型及等位基因频率分布提供一种快速、简便、准确的检测手段。

1　材料与方法

1.1　对象

健康成人30例,经体检,无心血管及脂代谢有

106

海南医学院学报　1999,5(3):97～101Journal of H ainan M edical Colleg e

5卷

关疾病,男性21名,女性9名,年龄42～61岁,平均年龄49.6岁。1.2　试剂

TaqDNA 聚合酶,dNTPs,DNA 片段长度标准物,Hha Ⅰ酶均由湖北维科公司提供的MBI 产品,其余试剂均为分析纯。其引物序列为:

P 1:5’-AACAACT GACCCCGGT GGCG -3’;P 2:5’-AT GGCGCTGAGGCCGCGCTC-3’;

特异性扩增Apo E 基因第4外显子区含编码112位与158位氨基酸的基因序列,产物片段为292bp 。

1.3　模板DNA 提取

取全血100L l 加无菌双蒸水100L l 混匀,加6mol/L NaI 200L l 涡旋震荡30s,加等体积氯仿/异戊醇(24∶1),涡旋震荡30s,离心后取上清加0.6体积异丙醇混匀,室温静置15min ,离心后沉淀以37%异丙醇洗1次,晾干后溶于TE (T ris 1mol/L,EDT A 0.1M ol/L,pH 7.6)液中,提取的DNA 经紫外分光光度计定量后,置-20℃保存备用。

1.4　PCR 扩增

0.5m l 扩增管内加入扩增缓冲液;dNTPs,引物P 1、P 2及模板DNA 。置热循环仪(PE 480型,Perkin-Elmer cetus)中的95℃预变性12m in 后,再加入T aqDNA 聚合酶2U 。然后按下列程序循环35次,即94℃变性1m in ,65℃退火1m in ,72℃延伸1.5min ,最后于72℃再延伸10min 。取产物10L l 经2%琼脂糖凝胶电泳,溴化乙啶(EB)染色,以DNA Markers 为标准参考物,紫外灯下观察扩增结果,无非特异性条带出现。1.5　PCR 产物的限制性酶切

吸取扩增物于另1试管,加入Hha I 酶1L l (10U /L l ),充分混匀,置扩增仪内,37℃4h ,反应终止后,酶切产物经10%聚丙烯酰胺凝胶电泳,EB 染色35min,以DN A M arkers 为标准参考物,紫外灯下观察结果。

2　结　果

Apo E DNA 经PCR 扩增后,其产物经2.0%琼脂糖凝胶电泳,在紫外灯下观察292bp 处有一明显的条带,与标准DNA M ar kers 比较,无非特异性区带出现。

扩增产物经限制性酶切后,于10%聚丙烯酰

胺凝胶电泳显示出Apo E 基因型的片段,见图1。

7为PCR 产物(292bp ),M 为M ar kers ,1-6分别为基因型

图1　A po E 基因扩增产物HhaI 酶切后图谱

Apo E 基因型判定参照Richar d [5]方法,E 2/E 2为91、83、38bp 3条区带;E 3/E 3为91、48、38bp 3条区带;E 4/E 4为72、48、38bp;E 2/E 3为91、83、48、38

bp 4条区带;E 2/E 4为91、83、72、48、38bp 5条区

带;E 3/E 4为91、72、48、38bp 4条区带,30份血样中仅检出1例E 2/E 2基因型,共检出6种基因型。

3　讨　论

Apo E 结构基因位点存在多态性,其多态性的分子基础是112位点上半胱氨酸T GC (Cys)和158位点上的精氨酸CGC (Arg )互换,其DNA 序列分别为T GC 和CGC ,本试验用特异性的引物进行扩增,包含上述2位点DNA 序列,扩增产物为292度bp,产物进一步用Hha I 酶切,因Hha I 酶可特异性识别GCGC 序列,故可识别A rg 位点DNA 序列,而不能识别Cys 位点DNA 序列,由于扩增产物GCGC -GT GC 2位点的差异,酶切后可产生不同的限制性片段长度多态性E 2、E 3、E 4,并由此产生6种不同的基因型,早期Apo E 基因型分析方法有超速离心法、IEF 法、I-GBlot 法、IEF-PAGE 法等,但由于上述方法均存在有操作复杂、费时费力且成本过高或结果不稳定等问题,较难在普通实验室开展,本文参照国内外文献[6～8]在普通实验室内运用PCR-RFLP 方法,特异性扩增Apo E 结构基因第4外显子区域含编码112位点和158位点,氨基酸的基因序列,扩增产物用HhaI 酶切,酶切产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳后,即可观察不同

107　3期

钱士匀等.载脂蛋白E 基因型分型方法研究