(整理)肺炎克雷伯氏菌PCR快速检测试剂盒

【产品名称】

通用名称：肺炎克雷伯氏菌PCR检测试剂盒

英文名称：PCR diagnostic kit for Klebsiella pneumoniae

【检验原理】

目前，国内食品卫生微生物检验的方法主要采用国家标准（GB/T）和行业标准（SN/T），该类标准是由传统的分离培养、镜检观察、生化鉴定等实验组成，一般的检测周期在6～8 天，要求检测步骤较多而且精度低，存在着检验周期偏长、工作量大等缺点。临床上对致病菌检测也需要快速得到检测结果，以免延误病情。

针对目前微生物检测的现状，天津生物芯片结合目前微生物研究领域的先进技术，投入大量人力、物力，成功开发了基于PCR技术的肺炎克雷伯氏菌PCR检测试剂盒。

肺炎克雷伯氏菌PCR检测试剂盒使用肺炎克雷伯氏菌的特异引物，可与样本中的肺炎克雷伯氏菌基因组的相应靶位点特异性结合，利用PCR反应达到对肺炎克雷伯氏菌快速检测的目的。试剂盒具有特异性强的特点，可以将肺炎克雷伯氏菌从其它细菌中特异地区分出来。

【预期用途】

用于食品、水样、临床样品以及环境样品中的肺炎克雷伯氏菌的检测。

肺炎克雷伯氏菌PCR检测试剂盒检测乳粉中的肺炎克雷伯氏菌,无需增菌.通过滤膜法成功地从人工污染肺炎克雷伯氏菌的乳粉中提取了肺炎克雷伯氏菌的DNA.以肺炎克雷伯氏菌的间区序列(ITS)为靶基因,经过PCR扩增得到158 bp的产物,经过DNA测序证实该产物为目的扩增产物.该方法灵敏度高,乳粉中检测的灵敏度为10CFU/mL,可在6 h内完成对乳品中肺炎克雷伯氏菌的检测,比目前普遍采用的先增菌再进行PCR检测的方法缩短了12-24 h.

【主要组成部分】

肺炎克雷伯氏菌核酸扩增（PCR）检测试

剂盒

组份规格

数量贮存温度核酸提取液

1ml/支2支

-20℃肺炎克雷伯氏菌PCR反应液500μl /支

1支

Taq酶

12μl /支1支

肺炎克雷伯氏菌阳性对照品100μl /支

1支

阴性对照品100μl /支1支

【储藏条件及有效期】

-20℃保存，避免反复冻融，有效期一年。

【样品处理】

（1）取培养后的菌液约1.5ml，12000rpm离心2min，弃上清。

（2）加入200μl无菌水，充分混匀，12000rpm离心2min，弃上清。

（3）加入80μl裂解液，用移液器吹吸混匀，50℃水浴1小时，100 ℃水浴15分钟，冰上放置10分钟后12000rpm离心3min。

（4）取上清液用于PCR检测。

【使用方法】

1.试剂配制（试剂准备区）

从试剂盒中取出PCR反应液在室温融化，将PCR反应液充分震荡混匀，所有试剂在使用前2000rpm离心10s。设所需要的管数n（n=样本数+1管阳性对照品+1管阴性对照品），每个测试反应体系试剂配置如下表。计算所需要的n管反应的各试剂的使用量，加入至适当体积的无菌离心管中，充分混合均匀，分装至无菌PCR反应管中，每管20μl。

PCR反应液Taq酶

每个反应体系试剂用量19.7μl0.3μl

2.PCR扩增（扩增和产物分析区）

将样本、阴性对照品和阳性对照品使用前恢复至室温，2000rpm离心10s。向每个PCR反应管中分别加入样本、阴性对照品和阳性对照品各5μl，震荡混匀，于2000rpm离心10s。将PCR管放入PCR仪中，使用以下程序进行扩增反应，整个扩增反应约需2小时。

3.结果判断（扩增和产物分析区）

从PCR管中取出2μl PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。在紫外灯下，阴性对照品没有任何条带；肺炎克雷伯氏菌阳性对照品具有大小为269bp的条带。当被检样品经电泳检测出现269bp大小的条带时则属于肺炎克雷伯氏菌阳性；当未出现条带或所出现的条带大小与阳性对照品的条带大小不一致时均视为阴性结果。

【注意事项】

1.本试剂盒不做临床诊断。

2.实验室管理应严格按照PCR基因扩增实验室的管理规范，试验人员必须进行专业培

训，实验过程中严格分区进行（试剂准备区、样本制备区、扩增和产物分析区），实

验操作的每个阶段使用专用的仪器和设备，各区用品不能交叉使用。

3.样本准备和试剂准备阶段应使用生物安全柜，实验过程中穿工作服，带一次性手套，

使用自卸管移液器。

4.对每次实验进行质量控制。

5.试剂使用前要完全解冻，并混合均匀，但应避免反复冻融。

6.样本制备区所用过的吸头请打入盛有消毒剂的容器，并与废弃物一起灭菌后方可丢

弃。

7.实验完毕用10%次氯酸或75%酒精或紫外灯处理工作台和移液器。

8.所有检测样品应视为具有传染性物质，操作和处理均需符合相关法规要求：卫生部《微

生物生物医学实验室生物安全通用准则》和《医疗废物管理条例》。