基因打靶 cre-loxp重组酶系统
cre_loxp基因敲除系统解读ppt课件
MerCreMer融合蛋白
该系统将雌激素受体(Estrogen Receptor,ER)的配 体结合区(ligand-binding domain,LBD)和Cre重组 酶进行融合，产生一种嵌合重组酶，该嵌合重 组酶的表达被置于特异启动子的调节之下，从 而使其在特定组织和器官或者特定发育阶段产 生。但是只有该嵌合重组酶并不能发挥Cre重组 酶的活性，因为雌激素受体结合区的存在使其 不能进入核内与loxP位点相结合。只有加入雌 激素后才能使其进入核内发挥作用。
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基因敲除机理 （续）
Offspring: 25% homozygous knockout after 2 generation
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二、基因敲除的基本流程
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（1）打靶载体构建
Attention: Exon1 3N GT/AG
Conditional Knockout
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（2）转化ES细胞
电转需要的细胞数量2-5x107
同一染色体上含有同源序列的DNA分子之间或分子之内的重新组合。 在基因敲除小鼠制作过程中，需要针对目的基因两端特异性片段设 计带有相同片段的重组载体，将重组载体导入到胚胎干细胞后外源 的重组载体与胚胎干细胞中相同的片段会发生同源重组
同源重组示意图
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一、Cre/Loxp系统
Cre重组酶（37℃）
acids 281 to 599, G525R)
D.S. Sohal, M. Nghiem. Temporally regulated and tissue-specific gene manipulations in the adult and embryonic heart using a tamoxifen-inducible Cre protein. Circ Res. 89:20-25 (201061).
Cre-loxP、CRISPR-Cas9技术与病毒载体在基因敲除中的联用
基因敲除技术在病毒感染性疾病治疗中的应用
基因敲除技术能够消除病毒复制所需的宿主细胞内基因从而阻止病毒的复制和感染。
基因敲除技术可以用于开发新型抗病毒药物通过抑制病毒复制或干扰病毒生命周期的关键环节 来治疗病毒感染。
基因敲除技术可以用于基因治疗通过将正常基因导入宿主细胞替代缺陷基因恢复细胞功能达到 治疗目的。
CRISPR-Cs9与病毒载体的联用
Cre-loxP技术用于控制基 因表达
CRISPR-Cs9技术用于编 辑基因
病毒载体在基因敲除中的重 要作用
Cre-loxP、CRISPR-Cs9 技术与病毒载体的联用原理
三者联用的优势与挑战
优势：Cre-loxP、CRISPR-Cs9技术与病毒载体在基因敲除中的联用可以实现高效、精准 的基因敲除有助于研究基因功能和疾病治疗。
基因敲除技术简介 Cre-loxP系统在基因敲除中的应用 CRISPR-Cs9系统在基因敲除中的应用 病毒载体在基因敲除中的联用
基因敲除技术在癌症治疗中的应用
基因敲除技术能够精准地编辑人类基因为癌症治疗提供了新的手段。
通过敲除致癌基因或激活抑癌基因基因敲除技术可以有效抑制癌症细胞的生长和扩散。 基因敲除技术在癌症治疗中具有个体化、精准化的特点可以降低治疗副作用和提高治疗 效果。 目前基因敲除技术在癌症治疗领域仍处于研究阶段但已取得了一定的成果和进展。
基因敲除技术还可以用于疫苗开发通过消除病毒基因中的关键位点降低病毒的毒力或致癌性从 而开发出更安全、更有效的疫苗。
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未来展望与研究方向
Cre-loxP、CRISPR-Cs9技术与病毒载体联用技术的发展 前景
技术改进：随着 基因编辑技术的 不断进步CreloxP、 CRISPR-Cs9与 病毒载体的联用 技术将得到进一 步优化提高敲除 效率和应用范围。
一分钟看懂基因编辑神器「Cre-LoxP」
一分钟看懂基因编辑神器「Cre-LoxP」Q师弟小花师姐，我最近看到什么DO、DIO、FLEX系统的，据说都是Cre-LoxP系统，那么他们之间有什么差异啊？小花师姐师弟，要了解这三种系统的差异，我们首先必须先了解什么是Cre-LoxP系统。
Cre-LoxP系统是一种重组酶系统，能够控制基因组DNA中位点特异性重组的发生，被广泛应用于特异位点的基因敲除、基因插入、基因翻转和基因易位，可达到在基因水平上对生物体进行定向遗传改造的目的，其主要由Cre与LoxP两部分组成。
Cre是一种重组酶，于1981年从P1噬菌体中发现，属于λInt酶超基因家族。
Cre重组酶，能够特异性识别LoxP位点，使2个LoxP 位点之间的DNA进行精确的位点特异性重组。
LoxP则是位于P1噬菌体中的34bp序列，由两个13bp的反向回文序列和8bp的中间间隔序列共同组成，间隔序列决定了LoxP的方向。
LoxP位点的序列如下所示：其中，“N”表示可能变化的碱基。
通过高通量筛选，我们获得了不同的LoxP序列，如下表所示：不同LoxP位点序列表那么当Cre与LoxP相遇时，他们之间又将发生怎样的故事，使得Cre-LoxP系统名气大振呢？主要有以下三种情景哦~✫情景一当两个LoxP位点位于一条DNA链上但方向相反时，Cre重组酶能诱导两个LoxP位点间的序列翻转（图1A）；✫情景二当两个LoxP位点位于一条DNA链上且方向相同，Cre重组酶能有效地敲除两个LoxP位点间的序列（图1B）；✫情景三当两个LoxP位点分别位于两条不同的DNA链或染色体上，Cre 重组酶能诱导两条DNA链发生交换或染色体易位（图1C）。
图1 Cre-LoxP系统基本工作原理示意图However，从以上情景我们也可以看到在Cre酶存在时，A、B、C三种场景的变化其实是可逆的，那么该如何使这种动态变化达到一种稳定状态呢？如下图所示，通过引入两对不同的LoxP位点，经过两组LoxP点的两轮重组我们即可达到一种稳定状态。
cre-loxp系统在大脑特定区域进行基因敲除的原理
cre-loxp系统在大脑特定区域进行基因敲除的原理Cre-loxp系统是一种常用的基因敲除技术，用于特定区域的基因敲除。
该系统是通过两种转基因技术相互配合实现的，即Cre重组酶和loxp位点。
Cre重组酶是一种由细菌噬菌体产生的酶，能够识别和剪切含有loxp位点的DNA序列，从而实现特定区域的基因敲除。
Cre-loxp系统的原理如下：1. Cre重组酶的表达：首先，使用基因工程技术将Cre酶的编码基因嵌入到转基因小鼠的基因组中，使其能够在特定的组织或细胞类型中产生。
通过引入特定的启动子或组织特异性表达的促进子，可以实现Cre重组酶在目标组织或细胞中的表达。
2. 基因敲除载体：在目标基因的启动子或内含子区域，插入一对loxp位点。
loxp位点是一种特殊的DNA序列，约有34个碱基对，呈倒向重复，用于诱导Cre重组酶的作用。
3. Cre重组酶的介导：一旦Cre重组酶在目标组织或细胞中表达，它能够识别和结合含有loxp位点的DNA序列，并结合在loxp位点上。
Cre重组酶在loxp位点间发生酶活性，通过识别和切割这两个loxp位点间的DNA链，将目标基因位点裂解。
4. 基因敲除效应：一旦目标基因位点被裂解，无法继续正常转录和翻译，从而导致目标基因的敲除。
这样，就实现了在特定区域的基因敲除。
Cre-loxp系统具有以下特点和优点：1. 灵活性：Cre-loxp系统可以在不同的组织或细胞类型中实现基因敲除，由于Cre重组酶的表达是由特定启动子或组织特异性表达的促进子控制的，因此可以实现组织或细胞特定的基因敲除。
2. 高效性：Cre重组酶的催化作用很高效，能够在较短的时间内进行特定区域的基因敲除。
3. 精确性：Cre重组酶只能识别和剪切含有完整loxp位点序列的DNA链，因此能够实现精确的目标基因敲除，而不会对其他基因产生影响。
4. 可逆性：如果需要在特定的时期或特定的组织中恢复目标基因的表达，只需停止Cre重组酶的表达即可。
条件性基因敲除的基本原理Cre／loxP重组系统
条件性基因敲除的基本原理Cre／loxP重组系统条件性基因敲除的基本原理 Cre ／ loxP 重组系统条件性基因敲除主要是通过Cre／10xP或者Ftp／FRT重组系统来实现的。
这两个系统都是位点特异性重组酶系统，已发展成为在体内、外进行遗传操作的有力工具。
这两个系统的应用，可以使靶基因的表达或缺失发生在试验动物发育的某一阶段或某一特定的组织器官。
此外，若与控制Cre或Flp表达的其他诱导系统相结合，还可以对某一基因同时实现时空两方面的调控。
1．Cre／loxP系统的原理Cre／loxP系统来源于F1噬菌体，可以介导位点特异的DNA重组。
该系统含有两种成分：①一段长34bp的DNA序列，含有两个13 bp的反向重复序列和一个8 bp的核心序列。
这段34bp序列是重组酶识别的位点，被称为loxP位点(10cus of X―over in P1)。
②Cre重组酶(cyclizationrecombination)，它是一种由343个氨基酸组成的单体蛋白，可以引发loxP位点的DNA重组。
任何序列的DNA，当其位于两个loxP位点之间的时候，在Cre重组酶的作用下要么被缺失(两个loxP位点的方向相同)，要么方向发生倒转(两loxP位点的方向相反)，如图所示。
Cre／loxP系统的作用机制2．Cre／loxP系统优点Cre／10xP系统之所以在基因敲除中获得了非常广泛的应用，是由该系统的诸多优点决定的：①Cre重组酶与具有loxP位点的DNA片断形成复合物后，可以提供足够的能量引发之后的DNA重组过程，因此该系统不需要细胞或者生物体提供其他的辅助因子；②loxP位点是一段较短的DNA序列，因此非常容易合成；③Cre重组酶是一种比较稳定的蛋白质，因此可以在生物体不同的组织、不同的生理条件下发挥作用；④Cre重组酶的编码基因可以置于任何一种启动子的调控之下，从而使这种重组酶在生物体不同的细胞、组织、器官，以及不同的发育阶段或不同的生理条件下产生，进而发挥作用，这一点也是该系统在应用过程中最为重要的一点。
Cre-loxp系统
Cre-loxp系统Cre-lox系统介绍及使⽤汇总由于Cre-lox系统具有操作简单、重组率⾼的优点，如今已经成为体内外遗传操作的强有⼒⼯具。
利⽤Cre-lox系统，可以在特定细胞、组织或整个⽣物体，甚⾄在特定时间点敲除或表达某个基因，实现对特定基因的时空特异性操作，这对基因功能的研究和⼈类疾病动物模型的建⽴都具有深刻影响。
1.什么是Cre-lox系统？从名字就能知道这套系统的两个主要组成部分：(1)Cre重组酶环化重组酶（Cre,cyclizationrecombinase），是酪氨酸位点特异性重组酶之⼀，能催化两个DNA 识别位点之间的位点特异性重组。
Cre重组酶来源于P1噬菌体，由343个氨基酸组成，能特异性地识别Lox位点。
除Cre以外，此类重组酶还有Flp（flipase）和Dre（D6特异性重组酶）。
(2)Lox位点Cre重组酶识别的回⽂DNA位点，也叫loxP(locusofX-overP1)位点，长34bp，其特征结构为ATAACTTCGTATA?-NNNTANNN-TATACGAAGTTAT。
两边反向互补的13个碱基为Cre重组酶的识别序列，中间的8个碱基为重组发⽣位置，这也决定了loxP的⽅向。
N表⽰可变碱基，不同的碱基选择可形成不同的Lox位点，除了野⽣型loxP，常见的还有Lox2272，Lox511，Lox5171等等，这些突变Lox位点也能被Cre重组酶识别，但是只有两个序列相同的Lox位点之间才能发⽣重组。
在同⼀个DNA分⼦上，根据Lox位点的位置与⽅向，可能会发⽣3种不同的重组事件：（1）切除：当两个Lox位点在同⼀染⾊体上且⽅向相同时，将切除同向Lox位点之间的DNA序列（也叫Lox侧翼序列，Flox序列）。
（2）反转：当两个Lox位点位于同⼀染⾊体上且⽅向相反时，两个Lox位点之间的序列发⽣序列反转，即颠倒。
（3）易位：如果两个Lox位点位于不同的染⾊体上且⽅向相同，则易位事件将导致DNA ⽚段的交换。
CreLoxP重组酶系统专题知识
3.Cre重组酶介导两个LoxP位点间旳重组过程
• 假如两个LoxP位点位于一条DNA链上，且方向相同，Cre重组酶能有效切除两个LoxP位点间旳序 列；假如两个LoxP位点位于一条DNA链上，但方向相反，Cre重组酶能造成两个LoxP位点间旳序 列倒位。
• 假如两个LoxP位点分别位于两条不同旳DNA或染色体上，Cre酶能 介导两条DNA链旳互换或染色体易位。
• 新霉素抗性基因 (neo) 和单纯疱疹病毒旳胸腺嘧啶激酶基因 (HSV-tK ) 为正负选择 (positive and negative selection) 系统，是筛选和富集同源重组细胞广泛应用旳措施；该措施虽然使 基因打靶技术可合用于任何外源目旳基因，但也有一种严重旳缺陷，即发生同源重组旳细 胞基因组中总留有外源旳选择标识(neo) 基因；该基因可能影响相邻基因旳体现，不利于对 突变表型旳精确分析。
病毒依赖旳Cre-loxp系统旳优点
• 更强旳区域特异性：因为病毒能够经过局部注射旳方式确保区域特异性感染，再加上驱动 Cre基因旳特异性开启子，能够实现更强旳区域和细胞特异性旳基因重组。
• 更少旳花费：购置转基因动物旳费用一般是比较昂贵旳，而且转基因动物旳喂养、基因型 鉴定都需要不少旳人力、物力，而病毒旳制备、保存和注射所花旳费用相对来说是比较少 旳。
老式基因敲除技术旳缺陷
• knockout 小鼠旳全部细胞基因组上都存在基因旳缺失／突变 ，往往引起严重旳发育缺陷或 胎儿死亡，不利于在发育后期阶段基因功能旳分析。
• 虽然发育完整旳突变体小鼠，对于 knockout 表型旳解释常遇到两个困难问题：一是全部体 细胞基因旳剔除，极难将异常旳表型归于哪一类细胞或组织；二是极难排除在成熟动物上 因为发育缺陷所引起旳异常表型。
0425-cre-loxp、crispr-cas9技术与病毒载体在基因敲除中的联用
2.1 CRISPR-Cas9技术
2.2 CRISPR-Cas9系统
DNA、RNA和蛋白质聚合物
2.3 CRISPR-Cas9技术
2.4 CRISPR-Cas9技术
1. CRISPR-Cas9系统的可用位点更多：理 CRISPR-Cas9进行编辑的位点，而TALEN和 到一个可用位点；
1.1 Cre-loxP技术基本原
1.2 Cre-loxP技术应用
1.2 Cre-loxP技术应用—
与组织特异性启动子结合应用，
启动子
albumin insulin adipose protein 2
1.2 Cre-合应用，对
启动子
Mx1 CMV-tTA
4 组合应用示例——Cr
4.1 Cre-loxP与病毒工具
“条件性基因激活”模式
4.1 Cre-loxP与病毒工具
4.2 Cas9系统与病毒工具
4.2 Cas9系统与病毒工具
4.3 Cre-loxP、CRISPR-C
Cre-dependent Cas9 mice
思考
阐述Cre-LoxP技术的基本 CRISPR-Cas9技术与ZFN
诱导物
IFN tetracycl
1.3 Cre-loxP技术仍有不
2. CRISPR-Cas9技术
传统的基因打靶技术主要依赖于基因 代靶基因片段，从而达到目的。 但是同源重组在细胞中的发生概率极 费用也比较高。
新3代基因组编辑工具
均由自然界存在的核酸酶系统 均具有识别核酸碱基特异性的 作用机制：均通过在细胞基因
Cre-loxP、CRI 与病毒载体在基因
Content
第一节、Cre-loxP技术 第二节、 CRISPR-Ca
条件性基因敲除的“时空开关”——Cre-loxP系统介绍
条件性基因敲除的“时空开关”——Cre-loxP系统介绍基因敲除小鼠是我们研究基因功能必不可少的利器，主要分为全身性基因敲除和条件性基因敲除。
然而，全身性基因敲除的小鼠存在着无法忽视的缺陷，例如：不能特异性地研究特定基因在特定组织内（及特定的时间）的功能；全身性基因敲除小鼠有时因某些基因对胚胎发育的影响而无法正常分娩；或因出生后严重的生理缺陷而过早死亡；或不能产生后代而不能获得纯合子动物模型。
因此，条件性基因敲除小鼠虽然有周期长、费用高、需要配合特定工具鼠使用等劣势，但仍获得了越来越多的选择与喜爱。
今天，就和大家一起来了解下条件性基因敲除方法必用的Cre-loxP重组系统以及应用Cre-loxP进行条件性基因敲除的原则。
概述Cre-loxP重组系统，即对一段特定的DNA序列进行定位并用Cre 重组酶对其进行剪接，由Cre重组酶和loxP位点两部分组成。
其中Cre蛋白，最初由“导致重组（Cause recombination）”命名，也有文献命名为“环化重组酶（Cyclizationrecombinase）”。
Cre重组酶（CyclizationRecombination Enzyme）由大肠杆菌噬菌体P1的Cre基因编码，是由343个氨基酸组成的38kD的蛋白质。
它不仅具有催化活性，而且与限制酶相似，能够特异性识别loxP位点, 从而重组或删除loxP片段间的基因。
loxP（Locus Of X-over P1）是P1噬菌体基因组中34bp的特殊位点序列，包括两个13bp的反向重复序列和一个8bp的间隔区域。
其中，反向重复序列是Cre重组酶的特异识别位点，而间隔区域决定了loxP位点的方向，间隔区中的“N”代表这个碱基是可变的：发展历史1985年，R H Hoess, K AbremskiCre-Lox首次发表了大肠杆菌噬菌体P1的Cre-lox位点特异性重组系统的断裂和交换机制文章。
1987年，Brian Sauer博士把大肠杆菌噬菌体P1的Cre-lox位点特异性重组系统在酿酒酵母中即真核系统中进行了功能表达，提出了Cre介导的位点特异性重组可能是调节真核生物基因组重排的有用工具的预想。
cre-loxp原理
Cre-LoxP系统是一种基因编辑技术，其工作原理主要基于Cre重组酶和LoxP位点的相互作用。
Cre重组酶是一种由343个氨基酸组成的单体蛋白，由大肠杆菌噬菌体P1的Cre基因编码。
它具有催化活性，并能特异性识别LoxP位点。
LoxP位点是由两个13bp的反向重复序列和一个8bp的间隔区域组成的34bp序列，其中反向重复序列是Cre重组酶的特异识别位点，而间隔区域决定了LoxP位点的方向。
当基因组内存在LoxP位点时，一旦有Cre重组酶，便会结合到LoxP位点两端的反向重复序列区形成二聚体。
此二聚体与其他LoxP位点的二聚体结合，进而形成四聚体。
随后，LoxP 位点之间的DNA被Cre重组酶切下，切口在DNA连接酶的作用下重新连接。
重组的结果取决于LoxP位点的位置和方向，可能导致基因敲除、基因翻转、基因易位或基因插入等不同的基因编辑效果。
Cre-LoxP系统的这些特性使其在基因定点删除、外源基因定点整合、疾病动物模型建立、筛选高效表达基因座等方面得到了有效利用，成为体内外DNA重组的有力工具。
1。
cre-loxp基因敲除系统
背景介绍
1981 年Evans 等首次在体 外分离和培养ES，成功建 立了小鼠胚胎干细胞系
1985 年Smithies最早在哺乳动 物细胞中发现并实现了同源重 组
同源重组
Homologus Recombination
同源重组是指发生在姐妹染色单体（sister chromatin) 之间或同 一染色体上含有同源序列的DNA分子之间或分子之内的重新组合 。在基因敲除小鼠制作过程中，需要针对目的基因两端特异性片 段设计带有相同片段的重组载体，将重组载体导入到胚胎干细胞 后外源的重组载体与胚胎干细胞中相同的片段会发生同源重组
三、Cre工具鼠的构建
DNA显微原核注射，是指将外源DNA通 过显微注射的方法注射到受精卵的原 核内，注射DNA整合到小鼠受精卵的 基因组中，并稳定遗传给后代。
诱导性组织特异性Cre工具鼠的载体构建
MHC (cardiac-specific a-myosin heavy chain) Mer (mutated murine estrogen receptor ligand-binding domain amino
MerCreMer融合蛋白
该系统将雌激素受体(Estrogen Receptor,ER)的 配体结合区(ligand-binding domain,LBD)和Cre 重组酶进行融合，产生一种嵌合重组酶，该嵌 合重组酶的表达被置于特异启动子的调节之下 ，从而使其在特定组织和器官或者特定发育阶 段产生。但是只有该嵌合重组酶并不能发挥 Cre重组酶的活性，因为雌激素受体结合区的 存在使其不能进入核内与loxP位点相结合。只 有加入雌激素后才能使其进入核内发挥作用。
基因敲除机理 （续）
Offspring: 25% homozygous knockout after 2 generation
creloxp重组酶系统原理
Cre-loxp重组酶系统是一种常用的基因编辑技术，它可以在特定的DNA序列上实现特异性的编辑和改变。
本文将从原理、应用和发展趋势等方面对Cre-loxp重组酶系统进行介绍。
一、Cre-loxp重组酶系统的原理1. Cre重组酶Cre重组酶是一种来源于大肠杆菌的酶，它能够识别和结合特定的DNA序列loxp，并在该序列上引发DNA的重组事件。
Cre酶最初是在嗜盐古细菌（Archaeoglobus fulgidus）中发现的，后来被用于基因编辑和遗传工程领域。
2. loxp序列loxp序列是Cre-loxp重组酶系统中的关键部分，它是一种DNA序列，长度为34个碱基对，其中包含了两个逆向定向重组位点。
这样的结构使得Cre酶可以选择性地将该序列分为两部分，并引发DNA片段的剪接和重组。
3. Cre-loxp重组酶系统的原理当Cre重组酶与loxp序列结合后，它将在该序列上诱导DNA的重组，使得该序列内的基因组成发生改变。
这种改变可以是插入、缺失、逆向或转向等，具体取决于Cre酶与loxp序列的相对定向。
Cre-loxp重组酶系统可以实现对特定DNA序列的编辑和改变。
二、Cre-loxp重组酶系统的应用1. 基因敲除通过Cre-loxp重组酶系统，可以实现对特定基因的敲除。
具体而言，首先需要在目标细胞中导入一个含有loxp序列的质粒，然后再导入Cre重组酶。
Cre酶与loxp序列结合后，将引发目标基因的敲除，从而实现对该基因的功能破坏或消除。
2. 基因激活除了基因敲除外，Cre-loxp重组酶系统还可以实现对特定基因的激活。
这种激活方式通常是通过插入或逆向调控目标基因的转录和翻译，从而增加目标基因产物的表达水平。
3. 细胞命运的调控在细胞生物学领域，Cre-loxp重组酶系统也被广泛应用于调控细胞的命运和功能。
通过敲除或激活特定基因，可以实现对细胞增殖、分化、凋亡等过程的调控，从而揭示细胞内部的生物学机制。
cre重组酶
Cre/loxP系统转基因与基因敲除Cre-LoxP重组酶系统在新型基因打靶中获得广泛应用，是条件性基因打靶、诱导性基因打靶、时空特异性基因打靶策略的技术核心。
Cre重组酶和LoxP序列Cre重组酶：于1981年从P1噬菌体中发现，属于λ Int酶超基因家族。
Cre重组酶基因编码区序列全长1029bp（EMBL数据库登录号X03453），编码38kDa蛋白质。
是一种位点特异性重组酶，能介导两个LoxP位点（序列）之间的特异性重组，使LoxP位点间的基因序列被删除或重组。
LoxP（locus of X-over P1）序列：来源于P1噬菌体，是有两个13bp反向重复序列和中间间隔的8bp序列共同组成，8bp的间隔序列同时也确定了LoxP的方向。
Cre在催化DNA链交换过程中与DNA共价结合，13bp的反向重复序列是Cre酶的结合域。
其序列如下：ATAACTTCGTATA - GCATACAT -TATACGAAGTTATCre-LoxP系统的特性Cre重组酶介导两个LoxP位点间的重组是一个动态、可逆的过程，可以分成三种情况：1、如果两个LoxP位点位于一条DNA链上，且方向相同，Cre重组酶能有效切除两个LoxP位点间的序列；2、如果两个LoxP位点位于一条DNA链上，但方向相反，Cre重组酶能导致两个LoxP位点间的序列倒位；3、如果两个LoxP位点分别位于两条不同的DNA链或染色体上，Cre酶能介导两条DNA链的交换或染色体易位。
另外，Cre不仅可以识别LoxP的2个13bp的反向重复序列和8bp的间隔区域，而且当一个13bp的反向重复序列或者8bp的间隔区发生改变时仍能识别并发生重组。
利用这一特点，人们在构建载体时可以根据需要改造LoxP位点序列，以用于特定的基因突变或修复，增加了该系统的应用范围。
Cre-LoxP重组酶系统在基因打靶中的应用策略基于Cre-LoxP的基因打靶要分两步来进行。
条件性敲除小鼠
条件性敲除小鼠定义：条件性基因敲除小鼠（也叫Flox小鼠）是指在目的基因中含有成对的loxp位点的小鼠，与Cre工具小鼠交配后可在特定的组织或细胞中敲除目的基因。
CKO如何实现？重组酶系统（如：Cre-loxP）介导的位点特异性重组技术。
Cre是重组酶（38kDa），可识别34bp 长的DNA 序列loxP。
loxP 两侧各13bp 构成回文结构，中间8bp为非回文结构，因此loxp具有方向性。
（当DNA 分子上存在两个同向loxP 序列时，Cre可将两个loxP 序列之间的DNA 片段切出并环化，同时将loxP 两侧的序列进行连接；当DNA 分子上存在两个方向相反的loxP 序列时，Cre 可导致loxP 之间的序列发生反转。
）CKO敲除的是什么？条件性基因敲除的靶基因中必须带有可以被Cre 重组酶识别的loxP 序列，这种基因称为floxed gene。
带有floxed 靶基因的小鼠称为flox 小鼠。
在这种小鼠中，通常采用DNA 同源重组方法，在拟敲除基因片段的两侧分别放置一个同向的loxP 位点。
loxP 位点的存在应不影响该基因的功能，故选择对照为flox/flox小鼠CKO敲除何时何地发生？除了flox 小鼠以外，重组酶系统介导的条件性基因敲除还需要另一类重要的基因工程小鼠的参与——Cre 工具鼠。
Cre 工具鼠中，将Cre 重组酶的编码序列置于特定的基因启动子下，Cre 的表达特性决定了靶基因何时何地发生敲除。
Cre 在哪一种组织细胞中表达，靶基因的敲除就发生在哪种组织细胞；Cre 的表达水平将影响靶基因在此种组织细胞中进行修饰的效率；使用诱导型Cre 重组酶可以通过给予诱导剂，决定在特定的发育时期或疾病发生阶段，定时地进行基因敲除。
（范衡宇老师课件）实验时，将flox 小鼠和Cre 工具鼠进行交配，最后获得flox 纯合且Cre 杂合的小鼠。
在这类小鼠中，凡是表达Cre 的细胞，两个loxP 之间的序列被切除，从而实现组织特异性基因敲除。
顶端外胚层嵴表达Cre重组酶转基因小鼠的鉴定
顶端外胚层嵴表达Cre重组酶转基因小鼠的鉴定【摘要】顶端外胚层嵴（AER）是中胚层间质细胞诱导其外侧的外胚层细胞形成突起结构，位于肢芽的远端边缘背腹交界处，是肢体生长发育的主要信号中心。
利用转基因技术构建在AER中表达Cre重组酶的转基因小鼠（Col10a1-Cre），使Cre重组酶在AER中特异性表达，从而可以特异性地在AER中敲除被LoxP 序列锚定的目的基因。
确定此转基因小鼠Cre重组酶的表达的时间和空间特异性。
实验结果证明Cre重组酶在顶端外胚层嵴中能够特异性表达并能介导LoxP 间的重组。
在顶端外胚层嵴发现特异性的蓝染，将Cre重组酶的表达范围限定在此区域。
【关键词】顶端外胚层嵴;Cre重组酶;LoxP;特异性敲除1.实验原理1.1顶端外胚层嵴（apical ectodermal ridge，AER）概述AER是由中胚层细胞诱导其外侧的外胚层形成，它位于肢芽的远端边缘、背腹之交界处，是肢体生长的主要信号中心。
多指症、并指症、无肢症、短指症等先天性肢体畸形的发生与AER发育的异常和功能的失调都有着密切的联系。
1.2 Col10a1-Cre转基因小鼠我们构建了在8.2 kb小鼠X型胶原基因（Col10a1）启动子和3.2 kb小鼠X 型胶原基因第二内含子控制下表达Cre重组酶的转基因小鼠品系（Col10a1-Cre）。
采用显微注射法将14.7 kb的转基因片段导入小鼠基因组，获得了3只在基因组上整合有Cre重组酶基因。
图1-1 Col10a1-Cre转基因载体构建图1.3 条件基因打靶技术运用Cre-LoxP系统与基因打靶技术相结合的条件基因打靶，靶基因或重要功能域片段被两个LoxP序列锚定，经同源重组被引入ES细胞，通过显微注射获得靶基因被两个LoxP序列锚定的条件打靶小鼠，该小鼠只有在与组织或细胞特异性表达Cre的转基因小鼠交配后，Cre介导的重组发生在特定的组织活细胞中，导致这些组织活细胞中靶基因被删除，而其他组织或细胞中由于Cre不表达，靶基因不会被改变[1,2]。
Cre-Loxp
2、如果两个LoxP位点位于一条DNA链上，但方向相反，Cre重组酶能导致两个LoxP位点间的序列倒位；
3、如果两个LoxP位点分别位于两条不同的DNA链或染色体上，Cre酶能介导两条DNA链的交换或染色体易位。
另外，Cre不仅可以识别LoxP的2个13bp的反向重复序列和8bp的间隔区域，而且当一个13bp的反向重复序列或者8bp的间隔区发生改变时仍能识别并发生重组。利用这一特点，人们在构建载体时可以根据需要改造LoxP位点序列，以用于特定的基因突变或修复，增加了该系统的应用范围。
Cre-LoxP重组酶系统的应用策略.
基于Cre-LoxP的基因打靶要分两步来进行。首先要在胚胎干细胞的基因组中引入LoxP序列，这一步可以通过打靶载体的设计和对同源重组子的筛选来实现。下一步通过Cre介导的重组来实现靶基因的遗传修饰或改变。Cre-LoxP系统既可以在细胞水平上用Cre重组酶表达质粒转染中靶细胞，通过识别LoxP位点将抗性标记基因切除，又可以在个体水平上将重组杂合子小鼠与Cre转基因小鼠杂交，筛选子代小鼠就可得到删除外源标记基因的条件性敲除小鼠。或者将Cre基因置于可诱导的启动子控制下，通过诱导表达Cre重组酶而将LoxP位点之间的基因切除（诱导性基因敲除），实现特定基因在特定时间或者组织中的失活。
Cre （Cause Recombination Enzyme）是一种重组酶，特异地识别Loxp位点，并催化两个Loxp位点之间的片段发生删除、倒位或交换。
Loxp是一段34bp长的回文序列，在两段反向重复的13bp片段之间有8bp的间隔序列，这8bp的序列决定Loxp位点的方向。
Loxp位点的方向非常重要，当两个位点方向一致时，发生片段去除；当两个Loxp位 点反向时，发生片段倒位；当两个Loxp分别位于不同的染色体上时，可以发生片段交换。
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基因打靶
基因打靶包括：胚胎干细胞的获得和培养、打靶载体的构建、重组ES细胞的筛选、嵌合体小鼠的制备、基因敲除小鼠的建立、Cre-loxP系统、FLP/FRT系统和条件性基因敲除、基因敲入和大规模ES细胞突变库的建立。
基本概念：
1.基因打靶：是利用同源重组技术来定点改变物种的基因组顺序和结构，从而在突变的个体内来研究基因及基因组的功能。
2.基因敲除：是使用基因组中某个/某几个基因或基因的顺式元件产生缺陷，从而在突变体内。
3.丧生正常的功能，来推测这些基因或元件原来在体内的功能。
基因敲入：在个体基因组中定点加入某个/某几个基因或顺式元件，使之表达或发挥作用，从而研究该基因或顺式元件在体内的功能。
4.基因打靶技术是一种定向改变生物活体遗传信息的实验手段。
它的产生和发展建立在胚胎干细胞技术和同源重组技术成就的基础之上，并促进了相关技术的进一步发展。
自1987年早期胚胎干细胞技术建立及第一例基因剔除小鼠诞生以来，基因打靶的研究进展迅速，给现代生物学和医学研究带来了革命性的变化，并直接引发了现代生物学和医学研究各个领域中许多突破性的进展，成为后基因组时代研究基因功能最直接和最有效的方法之一。
一、胚胎干细胞的获得和培养基因打靶中用的小鼠ES细胞系有：D3、E14、R1、J1、CCE，均来源于129小鼠品系和其杂交品系（因为这类小鼠具有自发突变形成畸胎瘤和畸胎肉瘤的倾向，是基因敲除的理想实验动物）。
ES 623和B6-III
ES细胞系，来源于C57BL/6小鼠品系。
BALB/c-I，来源于BALB/c小鼠品系。
常用的饲养层细胞为PMEF（小鼠原代胚成纤维细胞。
PMEF需6 Gy的X 射线照射或丝裂霉素C处理细胞抑制生长后才能用作饲养细胞）。
建立ES细胞的过程中，最好采用只传了2-3代的原代小鼠胚胎成纤维细胞作为饲养细胞，所取得的ICM（内细胞团）只有10％-30％的几率建立ES细胞系。
一旦ES 克隆被确定，接下来应该考虑检查ES细胞的核型。
2、ES 细胞的核型分析建立的ES细胞有相当的比例（30-50％）不具备正常核型，故需进行核型分析。
C带技术进行核型分析：小鼠细胞有40条染色体（19对加两条性染色体）。
常染色体和X染色体的中心着色很深，而Y染色体的着色很浅。
3、ES 细胞的扩增一旦ES细胞系中高比例的细胞被确定有正常二倍体染色体数目，这一ES细胞需要较大量扩增和冻存。
每5－6天ES细胞需经胰蛋白酶消化，以有效的低密度接种到新鲜培养基中，以保持细胞的不分化状态。
60mm平皿最大细胞密度1-2×107。
二、打靶载体的构建打靶载体通常包括2个同源重组臂，用于指导打靶载体和染色体上的靶基因序列发生同源重组。
同源重组臂上含有一个正筛选基因（neo），通过G418筛选，一个负选择标记的胸苷激酶（tk）基因。
三、重组ES细胞的筛选 1. 饲养细胞的准备；2. ES细胞的准备；3. 转染ES细胞；4. 挑取ES克隆；5. 96孔板ES细胞备份与细胞冻存；6. Southern 杂交。
四、嵌合体小鼠的制备 1. ES细胞的复苏；2. ES细胞的囊胚注射。
注意：每天留一些ES细胞备第二天注射，注射通常持续1-2周；ES细胞注射到3.5天的小鼠囊胚，每只囊胚可注射10-20个ES细胞，注射的胚胎移入2.5天
的假孕小鼠的子宫，每个子宫可接受9-10个囊胚。
五、基因敲除小鼠的建立选择嵌合率高的雄性子鼠×野生型雌性小鼠。
六、Cre-loxP系统、FLP/FRT系统和条件性基因敲除 Cre/loxP：来自P1噬菌体，Cre重组酶基因和loxP序列位于P1噬菌体基因组内，loxP是Cre酶的识别序列。
FLP/FRT：来自酵母，FRT是FLT酶的识别序列。
Cre（FLP）重组酶有删除/整合、倒位、转位等功能。
基本策略是通过类似于基因敲除的方法将两个loxP位点同向引入倒要删除的基因片段两侧。
建立条件性基因敲除需要分三步进行：1、通过同源重组的方法在待测删除片断的两侧引入同向的loxP位点（此步同ES细胞的打靶，只是载体不同），用Cre的瞬时表达载体转染ES细胞克隆，在Cre酶下发生DNA重排。
2、构建一个在特定组织和发育阶段表达Cre酶的转基因小鼠。
3、将前两步获得的小鼠杂交，在子代小鼠转筛选特定组织中基因敲除的小鼠。
七、基因敲入基因敲入：用一个设计好的基因片段来取代基因组中的特定片段和将一个设计好的基因片段插入到基因组的特定片段中，这一技术也是建立在Cre－loxP系统基础上。
基因敲入有两条途径删除选择标记基因：第一条途径是引入loxP位点的同源重组后，引入Cre基因瞬时表达载体，在ES细胞内瞬时表达Cre，删除两个loxP位点之间的序列，然后用该ES细胞建立相应的小鼠品系。
第二条途径是先引入loxP位点的ES细胞建立一个小鼠品系，与一种Cre转基因小鼠品系杂交，最后建立基因敲入的小鼠品系。
八、大规模ES细胞突变库的建立在ES细胞中利用基因捕获方法建立随机突变的ES细胞库是目前广受瞩目的研究计划。
基因捕获（gene trap）技术有很多形式，在建立ES细胞突变库中最常用有两种：启动子捕获和3‘poly A
信号捕获。
启动子捕获：将不带启动子的筛选基因（LacZ、neo）和完整的polyA信号序列组成打靶载体，在筛选基因前可放一个RNA剪接受体，将载体转染ES细胞，进行随机插入ES细胞染色体。
如果筛选基因恰好插入内源基因启动子下游，并在ES细胞中表达，那么筛选基因就可被转录，通过抗性筛选。
因插入导致基因的失活，相当于进行了基因打靶过程，可以实现高通量的基因突变库，获得大量插入靶点明确的ES细胞克隆。
3‘端加尾信号捕获：利用一个缺失polyA信号的选择基因，置于广泛表达的启动子下游，同时在筛选基因下游放置RNA剪接的共体序列，构建打靶载体，利用该打靶载体转染ES细胞后，如果筛选基因恰好位于某加尾信号上游，那么筛选基因在转录时可以利用内源基因的polyA信号补上polyA序列，使得筛选基因的倒翻译。
筛选具有抗性的ES细胞克隆就能富集这些插入事件。
•Cre-loxp system
Cre-LoxP重组酶系统在新型基因打靶中获得广泛应用，是条件性基因打靶、诱导性基因打靶、时空特异性基因打靶策略的技术核心。
•Cre重组酶：Cre重组酶基因编码区序列全长1029bp，编码38kDa蛋白质。
Cre 重组酶是一种由 343 aa的单体蛋白。
它能识别特异的 DNA 序列，即 loxP 位点，使 loxP位点间的基因序列被删除或重组。
Cre重组酶有70%的重组效率，不借助任何辅助因子，可作用于多种结构的 DNA 底物，如线形、环状甚至超螺旋 DNA。
•LoxP（locus ofX-overP1）序列：由两个13bp反向重复序列和中间间隔
的8bp序列共同组成，8bp的间隔序列同时也确定了LoxP的方向。
Cre在催化DNA链交换过程中与DNA共价结合，13bp的反向重复序列是Cre酶的结合区域。
其序列如下：
5' - ATAACTTCGTATA - ATGTATGC - TATACGAAGTTAT - 3' 3' - TATTGAAGCATAT - TACATACG - ATATGCTTCAATA - 5' •Cre重组酶介导两个LoxP位点间的重组是一个动态、可逆的过程，可以分成三种情况：
1、如果两个LoxP位点位于一条DNA链上，且方向相同，Cre重组酶能有效切除两个LoxP位点间的序列；
2、如果两个LoxP位点位于一条DNA链上，但方向相反，Cre重组酶能导致两个LoxP位点间的序列倒位；
3、如果两个LoxP位点分别位于两条不同的DNA链或染色体上，Cre酶能介导两条DNA链的交换或染色体易位。
•另外，Cre不仅可以识别LoxP的2个13bp的反向重复序列和8bp的间隔区域，而且当一个13bp的反向重复序列或者8bp的间隔区发生改变时仍能识别并发生重组。
利用这一特点，人们在构建载体时可以根据需要改造LoxP位点序列，以用于特定的基因突变或修复，增加了该系统的应用范围。
•折叠编辑本段Cre-LoxP重组酶系统的应用策略
•基于Cre-LoxP的基因打靶要分两步来进行。
首先要在胚胎干细胞的基因组中引入LoxP序列，这一步可以通过打靶载体的设计和对同源重组子的筛选来实现。
下一步通过Cre介导的重组来实现靶基因的遗传修饰或改变。
Cre-LoxP 系统既可以在细胞水平上用Cre重组酶表达质粒转染中靶细胞，通过识别LoxP
位点将抗性标记基因切除，又可以在个体水平上将重组杂合子小鼠与Cre转基因小鼠杂交，筛选子代小鼠就可得到删除外源标记基因的条件性敲除小鼠。
或者将Cre基因置于可诱导的启动子控制下，通过诱导表达Cre重组酶而将LoxP 位点之间的基因切除（诱导性基因敲除），实现特定基因在特定时间或者组织中的失活。