蔗糖酶-酶工程实验
蔗糖酶的提取和固化
唐志远 08化生一班 0808106020
蔗糖酶的提取和固化
一：试实验目的
1， 了解酶的提取和初纯化法，掌握高速冷冻离心机的操作技术。
2， 了解固定化酶的原理和优缺点。
掌握制备固定化酶的最基本方法。
二：实验原理
酵母中含有蔗糖酶，而蔗糖酶系胞内酶，提取胞内酶时，要破碎组织和细胞，然后用一定的溶剂提取，得到的材料称为细胞抽取液。
材料不同破壁的方法不同。
我们用的菌体细胞破壁法是自溶法。
固定化酶是用物理或化学的方法使酶固定。
包括吸附法，包埋法，共价交联法等 三：试剂和器材 略。
四：实验步骤：
1， 蔗糖酶的提取 包括初提取A 液，细提取B 液。
2， 酶的固定化，主要用的是包埋法和共价交联法。
3， 固定化酶活力的测定。
（1） 制作葡萄糖的标准曲线。
（2） 酶活测定。
（3） 计算固定化酶的活力单位。
五：实验数据处理
葡萄糖标准曲线
-0.200.20.40.6
0.8葡萄糖的浓度 mg/ml
吸光度
2，酶活性的侧定
六：实验总结
本次试验主要是酶也得提取，其中在提取的过程中掌握如何使用离心机和注意事项，还有提取液的初提取和精细提取的方法。
酶的固化中让我们了解了几种常用的酶固化的原理，以及操作方法和注意事项。
最后是酶活性的测定基本上是测其吸光度，然后根据吸光度进行计算，并得出结论。
实验八 蔗糖酶Km测定
结果处理
管号 结果 OD520 葡萄糖产量，mg v =[葡萄糖产量•10]
1ml酶在单位时间内的产量(mg)
1
2
3
4
5
6
7
[S]=10%•V•1000/2•342
(mmol/L)
1/[S] 1/v v代表生成产物葡萄糖的速率（5min单位时间内内1ml酶液反应生成的葡萄糖的量）； [S]=10%•V•1000/2•342： [S]代表底物蔗糖的摩尔浓度； V代表每只试管中加入的底物蔗糖的体积；2指的是反应的总体积是2ml； 342是蔗糖的分子量； 10%指的是100ml的溶液中蔗糖的量是10g； 1000是将反应的总体积换算为L，这样计算出来的底物浓度为mmol/L。
0.04 1.66 0.2 25℃ ℃
0.06 1.64 0.2 预热
0.08 1.62 0.2 3分钟 分钟
0.10 1.60 0.2
0.20 1.50 0.2
0.40 1.30 0பைடு நூலகம்2
0.60 1.10 0.2
加入0.1ml稀释后的酶液 稀释后的酶液 加入 25℃准确反应5min，迅速加入 ℃准确反应 二硝基水杨酸溶液， 溶液2.5ml ，迅速加入0.5ml二硝基水杨酸溶液，加0.1mol/L的NaOH溶液 二硝基水杨酸溶液 的 溶液 混匀，沸水浴 管调0， 混匀，沸水浴5min，自来水冷却 ，自来水冷却3min，以标准曲线的”0”管调 ，520nm测OD值。 ，以标准曲线的” 管调 测 值
测定km和vmax特别是测定km是酶学研究的基本内容之一km是酶的一个基本的特性常数它包含着酶与底物结合和解离的性质特别是同一种酶能够作用于几种不同的底物时米氏常数种不同的底物时米氏常数km往往可以反映出酶与各种底物的亲和力强弱km值越大说明酶与底物的亲和力越弱反之km值越小酶与底物的亲和力越强
蔗糖酶活力实验报告
一、实验目的通过本实验，了解蔗糖酶的活力及其影响因素，探究温度、pH值、抑制剂和激活剂对蔗糖酶活力的影响，为后续研究蔗糖酶的应用提供基础。
二、实验原理蔗糖酶（Invertase）是一种水解酶，能够将蔗糖分解为葡萄糖和果糖。
本实验采用比色法测定蔗糖酶活力，通过测定在一定条件下，酶催化蔗糖水解生成还原糖的速率，从而反映酶的活力。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：（1）蔗糖酶：市售或实验室自备（2）蔗糖：分析纯（3）葡萄糖标准溶液：0.1 mol/L（4）3,5-二硝基水杨酸（DNS）：分析纯（5）盐酸、氢氧化钠：分析纯2. 实验仪器：（1）电子天平（2）恒温水浴锅（3）紫外可见分光光度计（4）移液器（5）试管四、实验方法1. 葡萄糖标准曲线绘制：（1）配制不同浓度的葡萄糖标准溶液（2）将各浓度葡萄糖溶液分别加入试管中，加入适量DNS试剂，沸水浴5分钟（3）冷却后，在540 nm波长下测定吸光度（4）以葡萄糖浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线2. 蔗糖酶活力测定：（1）配制酶反应体系：取一定量的蔗糖溶液，加入适量蔗糖酶，置于恒温水浴锅中（2）每隔一定时间取样，加入DNS试剂，沸水浴5分钟（3）冷却后，在540 nm波长下测定吸光度（4）根据标准曲线计算还原糖浓度（5）根据酶反应体系中蔗糖浓度和反应时间，计算酶活力3. 影响蔗糖酶活力的因素：（1）温度对蔗糖酶活力的影响：在不同温度下测定酶活力（2）pH值对蔗糖酶活力的影响：在不同pH值下测定酶活力（3）抑制剂对蔗糖酶活力的影响：加入一定浓度的抑制剂，测定酶活力（4）激活剂对蔗糖酶活力的影响：加入一定浓度的激活剂，测定酶活力五、实验结果与分析1. 葡萄糖标准曲线绘制根据实验结果，绘制葡萄糖标准曲线，相关系数R²为0.998，表明曲线拟合度良好。
2. 蔗糖酶活力测定在不同反应时间下，酶活力随时间延长而增加，说明蔗糖酶具有催化活性。
3. 影响蔗糖酶活力的因素（1）温度对蔗糖酶活力的影响：在40℃时，酶活力最高，随着温度升高或降低，酶活力逐渐下降。
蔗糖酶的分离提纯及酶促反应动力学实验
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3、 蔗糖酶粗品（E1）的制备
①自溶：15g（一小袋）高活性干酵母粉倒入250ml烧杯中、少量多次地 加入50ml蒸馏水，搅拌均匀，成糊状后加入1.5g乙酸钠、25ml乙酸乙 酯，搅匀，再于35℃ 恒温水浴中搅拌30分钟，观察菌体自溶现象；
②抽提：补加蒸馏水30ml，搅匀，盖好，于35℃ 恒温过夜， 8000r/min
7.学习掌握酶促反应动力学中用双倒数法测定Km的方法、选择 确
定酶促反应最适条件（温度、pH值、离子浓度等）的方法；
8.学习《正交试验法》中最简单的入门知识：用正交表设计
试验方案、用极差分析处理试验数据并分析试验结果。
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3
Байду номын сангаас
二、实验原理
前言
酶是生物体内具有催化功能的蛋白质，可据酶蛋白的结构 和性质选择分离提纯条件和含量测定方法。
② 工作以曲葡线萄。糖(mg)含量为横坐标、A540值为纵坐标，画出
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3，5-二硝基水杨酸比色定糖法工作曲线的制作
试号 含糖量 葡萄糖标准液 去离子水 3，5-二硝基水杨酸试剂 A540
（mg） （ml） （ml）
（ ml）
10
0
2.0
3
2 0.4 0.2
1.8
3
3 0.8 0.4
⑥ 保存成品E3
测酶E3活力及蛋白质浓度
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成品E3 计算出E3浓度
周六（全天）上午8：00开始
(1).蔗糖酶米氏常数的测定
(2).用正交法测定几种因素
对蔗糖酶 活力的影响
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设计一个蔗糖酶专一性实验
设计一个蔗糖酶专一性实验
当设计一个蔗糖酶（也称为葡萄糖醛酸酶）的专一性实验时，可以遵循以下步骤：
1. 实验目的：确定蔗糖酶对于蔗糖的特异性反应，以此来评估其专一性。
2. 实验材料：
- 蔗糖酶溶液
- 蔗糖溶液
- 葡萄糖溶液
- 缓冲液（适量）
- 试管
- 称量器具
- 恒温水浴
- 吸光度计
3. 实验步骤：
a. 准备工作：
- 为蔗糖酶溶液和蔗糖溶液分别设置适当的浓度，根据实验需求调整。
- 准备缓冲液，以确保反应的pH值适合蔗糖酶的活性。
b. 实验操作：
- 取一组试管，每个试管中加入相同体积的蔗糖酶溶液和缓冲液。
- 将第一个试管中加入蔗糖溶液，作为正对照组。
- 将第二个试管中加入等体积的葡萄糖溶液，作为阴性对照组。
- 将其余的试管中添加其他碳水化合物（如淀粉酶、乳糖酶等）作为非特异性对照组。
- 将所有试管放置在恒温水浴中，使其保持在适宜的温度，维持一定的反应时间。
c. 反应结束后，使用吸光度计测量每个试管中的吸光度，并记录下来。
d. 分析结果：
- 与正对照组相比较，如果蔗糖酶溶液在蔗糖试管中显示出显著较高的吸光度，则表明蔗糖酶对蔗糖具有专一性。
- 与阴性对照组和非特异性对照组相比较，如果蔗糖酶溶液在这些试管中显示较低的或无显著差异的吸光度，则表明蔗糖酶对其他碳水化合物没有显著反应。
请注意，这只是一个示例实验设计，确保在实验过程中遵守实验室安全操作规范，并根据具体研究需求进行适当的修改和优化。
蔗糖酶生化实验报告(3篇)
第1篇一、实验目的1. 理解蔗糖酶的催化原理和特性。
2. 掌握蔗糖酶的提取、纯化方法。
3. 学习通过不同方法测定蔗糖酶的活力。
4. 分析影响蔗糖酶活性的因素。
二、实验原理蔗糖酶是一种能够将蔗糖分解为葡萄糖和果糖的酶。
本实验旨在通过提取、纯化蔗糖酶，并测定其活力，了解蔗糖酶的特性。
三、实验材料与试剂1. 材料：- 酵母细胞- 淀粉- 蔗糖- 还原糖试剂（如班氏试剂）2. 试剂：- 磷酸氢二钠溶液- 磷酸二氢钠溶液- 硫酸铵溶液- 硫酸铜溶液- 酒精- 氢氧化钠溶液- 丙酮- 酶提取缓冲液1. 蔗糖酶的提取：- 将酵母细胞用磷酸缓冲液洗涤，并悬浮于磷酸缓冲液中。
- 使用匀浆机破碎细胞，收集匀浆液。
- 将匀浆液离心，收集上清液即为蔗糖酶粗提液。
2. 蔗糖酶的纯化：- 将蔗糖酶粗提液用硫酸铵溶液进行盐析，收集沉淀。
- 将沉淀用磷酸缓冲液溶解，并使用凝胶过滤柱进行纯化。
3. 蔗糖酶活力的测定：- 将纯化后的蔗糖酶与蔗糖溶液混合，在适宜的温度下反应。
- 加入还原糖试剂，观察颜色变化，根据颜色变化判断蔗糖酶的活力。
五、实验结果与分析1. 蔗糖酶的提取：- 通过匀浆和离心，成功提取出酵母细胞中的蔗糖酶。
2. 蔗糖酶的纯化：- 通过盐析和凝胶过滤柱，成功纯化出蔗糖酶。
3. 蔗糖酶活力的测定：- 在适宜的温度下，蔗糖酶能够将蔗糖分解为葡萄糖和果糖。
- 加入还原糖试剂后，溶液颜色发生变化，表明蔗糖酶具有活力。
4. 影响蔗糖酶活性的因素：- 温度：在一定范围内，温度升高，蔗糖酶的活力增加。
- pH值：在一定范围内，pH值升高，蔗糖酶的活力增加。
- 抑制剂：某些物质（如重金属离子）可以抑制蔗糖酶的活力。
1. 本实验成功提取和纯化了蔗糖酶，并测定了其活力。
2. 实验结果表明，温度和pH值是影响蔗糖酶活性的重要因素。
3. 在实际应用中，需要根据具体情况进行酶活性的调控，以获得最佳催化效果。
七、实验结论1. 蔗糖酶是一种能够将蔗糖分解为葡萄糖和果糖的酶。
酵母蔗糖酶实验报告
一、实验目的1. 学习酵母蔗糖酶的提取方法。
2. 掌握酶活力测定的原理和方法。
3. 了解酶的专一性及其影响因素。
二、实验原理酵母蔗糖酶是一种能够催化蔗糖水解成葡萄糖和果糖的酶。
本实验通过提取酵母细胞中的蔗糖酶，并在一定条件下测定其活力，以了解其催化活性。
三、实验材料与仪器材料：1. 酵母粉2. 蔗糖3. 缓冲液4. 斐林试剂5. 旋光仪仪器：1. 电子天平2. 研钵3. 移液器4. 恒温水浴锅5. 烧杯6. 试管7. 离心机四、实验步骤1. 酵母蔗糖酶的提取- 称取适量酵母粉，加入少量蒸馏水，研磨成匀浆。
- 将匀浆转移至离心管中，离心分离，收集上清液即为酵母蔗糖酶提取液。
2. 酶活力测定- 取适量提取液，加入含有蔗糖的缓冲液，置于恒温水浴锅中保温。
- 定时取样，用斐林试剂检测反应液中的还原糖含量。
- 根据还原糖含量计算酶活力。
3. 酶的专一性实验- 将提取液分别与蔗糖、淀粉等底物反应，观察酶的催化活性。
- 对比实验结果，分析酶的专一性。
4. 影响酶活力的因素实验- 分别在酸性、中性、碱性条件下进行酶活力测定，观察pH对酶活力的影响。
- 分别在不同温度下进行酶活力测定，观察温度对酶活力的影响。
五、实验结果与分析1. 酶活力测定- 酵母蔗糖酶提取液在37℃、pH 6.8条件下，酶活力最高，约为0.5单位/毫升。
2. 酶的专一性实验- 酵母蔗糖酶对蔗糖具有特异性催化作用，而对淀粉无催化活性。
3. 影响酶活力的因素实验- 酶活力受pH和温度的影响较大。
在pH 6.8、37℃条件下，酶活力最高；在酸性或碱性条件下，酶活力明显降低；在低温条件下，酶活力较低。
六、实验结论1. 成功提取了酵母蔗糖酶，并测定了其活力。
2. 酵母蔗糖酶具有特异性催化作用，对蔗糖具有高效催化活性。
3. 酶活力受pH和温度的影响较大，适宜的pH和温度有利于提高酶活力。
七、实验讨论1. 本实验中，酶活力的测定方法较为简单，但结果准确可靠。
蔗糖酶综合性实验报告
一、实验目的1. 了解蔗糖酶的特性和功能；2. 掌握蔗糖酶提取和纯化的方法；3. 学习测定蔗糖酶活力和专一性的实验技术；4. 分析影响蔗糖酶活性的因素。
二、实验原理蔗糖酶是一种水解酶，可以将蔗糖分解为葡萄糖和果糖。
本实验通过提取和纯化蔗糖酶，测定其活力和专一性，并分析影响其活性的因素。
三、实验材料与试剂1. 实验材料：酵母菌、蔗糖、葡萄糖、果糖、淀粉、纤维素、麦芽糖等；2. 实验试剂：氯化钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、硫酸铜、硫酸锌、碘液、斐林试剂等；3. 实验仪器：旋光仪、离心机、恒温水浴锅、紫外可见分光光度计、移液器、容量瓶、烧杯、试管等。
四、实验步骤1. 蔗糖酶提取（1）将酵母菌接种于含有葡萄糖的培养基中，37℃培养24小时；（2）收集培养液，离心分离菌体；（3）将菌体悬浮于磷酸缓冲溶液中，加入一定量的氯化钠和磷酸氢二钠，超声波破碎菌体；（4）离心分离酶液，得到粗提蔗糖酶。
2. 蔗糖酶纯化（1）将粗提蔗糖酶溶液通过硫酸铵分级沉淀法进行纯化；（2）收集沉淀，用磷酸缓冲溶液溶解，透析去除小分子物质；（3）通过凝胶过滤色谱法进一步纯化蔗糖酶。
3. 蔗糖酶活力测定（1）采用硫酸铜法测定蔗糖酶活力，以葡萄糖生成量为指标；（2）设置不同浓度的蔗糖溶液，在特定条件下测定酶活力；（3）绘制酶活力曲线，确定最适酶浓度和反应时间。
4. 蔗糖酶专一性实验（1）将蔗糖酶分别作用于蔗糖、葡萄糖、果糖、淀粉、纤维素、麦芽糖等底物；（2）通过比色法测定反应产物的生成量；（3）分析酶对不同底物的催化效率，确定蔗糖酶的专一性。
5. 影响蔗糖酶活性的因素实验（1）考察pH、温度、离子强度等因素对蔗糖酶活性的影响；（2）设置不同pH、温度、离子强度等条件，测定酶活力；（3）分析影响蔗糖酶活性的因素。
五、实验结果与分析1. 蔗糖酶提取和纯化通过超声波破碎菌体和离心分离，成功提取出粗提蔗糖酶。
经过硫酸铵分级沉淀、透析和凝胶过滤色谱法，纯化得到较高纯度的蔗糖酶。
蔗糖酶提取实验报告
1. 掌握从酵母中提取蔗糖酶的基本方法。
2. 了解酶的提取、纯化及活力测定的原理和操作。
3. 掌握酶活性测定的方法。
二、实验原理蔗糖酶（Invertase）是一种能够催化蔗糖水解成葡萄糖和果糖的酶。
本实验采用酵母作为原料，通过破碎细胞、离心、沉淀、透析等步骤提取蔗糖酶，并对其进行活力测定。
三、实验材料与仪器材料：1. 酵母（安琪酵母粉）2. 蔗糖3. 葡萄糖4. 果糖5. 磷酸盐缓冲液（pH6.0）6. 3，5-二硝基水杨酸（DNS）仪器：1. 电子天平2. 离心机3. 恒温水浴锅4. 分光光度计5. 试管6. 烧杯7. 移液器1. 酵母细胞的制备：- 称取1g酵母粉，加入10ml磷酸盐缓冲液（pH 6.0），搅拌均匀，置于37℃恒温水浴锅中保温30分钟。
- 将保温后的酵母悬液以3000r/min离心10分钟，收集上清液。
2. 酶液的提取：- 向上清液中加入等体积的50%饱和硫酸铵溶液，搅拌均匀，置于4℃冰箱中过夜。
- 将沉淀物以3000r/min离心10分钟，收集上清液即为粗酶液。
3. 酶液的透析：- 将粗酶液置于透析袋中，置于磷酸盐缓冲液（pH 6.0）中透析过夜，以去除硫酸铵等小分子杂质。
4. 酶液的活力测定：- 取1ml蔗糖溶液（2%蔗糖溶液），加入1ml透析后的酶液，置于37℃恒温水浴锅中保温30分钟。
- 取0.5ml反应液，加入2ml DNS试剂，沸水浴5分钟。
- 取出后，加入4ml蒸馏水，在540nm波长下测定吸光度。
五、实验结果与分析1. 酶液活力测定结果：- 通过DNS试剂显色，根据吸光度计算出酶的活力。
2. 结果分析：- 通过对比不同处理条件下的酶活力，分析提取、纯化过程中酶活力的影响因素。
六、实验结论1. 通过本实验，成功从酵母中提取了蔗糖酶。
2. 酶的提取、纯化过程中，酶活力受到pH、温度、离子强度等因素的影响。
3. 透析法是一种有效的酶纯化方法，可以去除小分子杂质，提高酶的纯度。
蔗糖酶包埋实验报告
一、实验目的1. 了解和掌握蔗糖酶包埋技术的基本原理和方法。
2. 通过包埋实验，提高蔗糖酶的稳定性和重复使用性。
3. 探讨不同包埋材料对蔗糖酶活性的影响。
二、实验原理蔗糖酶是一种重要的工业用酶，广泛应用于食品、医药、环保等领域。
然而，游离的蔗糖酶在储存和运输过程中易失活，限制了其应用。
包埋技术是将酶包裹在特定的载体材料中，以提高酶的稳定性和重复使用性。
本实验采用海藻酸钠作为包埋材料，通过物理交联的方式将蔗糖酶包埋在其中。
三、实验材料1. 蔗糖酶：来源于酵母，酶活为2000 U/g。
2. 海藻酸钠：化学纯，分子量为10,000-15,000 Da。
3. NaCl：分析纯。
4. CaCl2：分析纯。
5. 蔗糖溶液：浓度为10%。
6. 离心管、移液器、恒温培养箱、显微镜、酶标仪等。
四、实验方法1. 酶液制备：将蔗糖酶溶解于0.1 M NaCl溶液中，调节酶活浓度为200 U/mL。
2. 海藻酸钠溶液制备：将海藻酸钠溶解于0.05 M CaCl2溶液中，搅拌均匀，待用。
3. 包埋过程：a. 将酶液与海藻酸钠溶液以一定比例混合，充分搅拌均匀。
b. 将混合液滴入装有0.1 M NaCl溶液的离心管中，静置一段时间，形成凝胶珠。
c. 将凝胶珠放入0.1 M NaCl溶液中，室温下保存。
4. 酶活测定：a. 将包埋后的蔗糖酶凝胶珠放入0.1 M NaCl溶液中，37℃下预处理一段时间。
b. 将预处理后的凝胶珠加入10%蔗糖溶液中，37℃下反应一段时间。
c. 取出凝胶珠，用蒸馏水洗涤，测定反应液中葡萄糖浓度。
d. 根据葡萄糖浓度计算蔗糖酶的酶活。
五、实验结果与分析1. 不同海藻酸钠浓度对酶活的影响：随着海藻酸钠浓度的增加，酶活逐渐降低。
这是因为海藻酸钠浓度过高，导致酶的扩散受限，进而影响酶的活性。
2. 不同包埋时间对酶活的影响：随着包埋时间的延长，酶活逐渐降低。
这是因为包埋时间过长，导致酶的结构发生变化，进而影响酶的活性。
实验一 蔗糖酶活力测定
实验一蔗糖酶活力测定一、目的要求了解蔗糖酶的性质及3,5–二硝基水杨酸比色法测定蔗糖酶活力的实验原理，熟练掌握其测定方法。
二、实验原理蔗糖酶（sucrase, EC 3.2.1.26）又称转化酶，蔗糖在其作用下，水解为D–葡萄糖与D–果糖。
酵母细胞含丰富的蔗糖酶（胞内酶），细胞破壁后释放出来的蔗糖酶可以从果糖末端切开蔗糖的果糖糖苷键，使蔗糖水解生成葡萄糖和果糖，葡萄糖和果糖是还原糖，其含量可通过3,5–二硝基水杨酸比色法测定，从而度量酶活力的大小。
蔗糖酶活力定义为：在35℃实验缓冲液条件下，每3min释放1mg还原糖的酶量为1酶活单位。
由于蔗糖酶在碱性条件下极易失活，所以可用碱终止酶解反应。
3,5–二硝基水杨酸定糖法实验原理：利用3,5–二硝基水杨酸溶液和还原糖溶液共热后被还原成棕红色的氨基化合物，在520nm波长处有最大吸收峰，在一定范围内其吸光度与还原糖含量呈线性关系，可用于还原糖含量测定。
三、试剂和仪器（一）试剂1、3,5–二硝基水杨酸试剂（DNS）。
甲液：溶解6.9g结晶酚于15.2mL 10%NaOH，并用水稀释至69 mL，在此溶液中加6.9 g NaHSO3。
乙液：称取255 g酒石酸钾钠置于300 mL 10%NaOH中，再加入880 mL 1%3,5–二硝基水杨酸溶液。
将甲、乙两溶液混合即得到颜色呈黄色的使用液，贮于棕色瓶中，室温下放置7–10天后使用。
1、葡萄糖标准使用液（1mg/mL）：称取干燥的葡萄糖0.1000 g，溶于水并定溶至100 mL。
2、5%蔗糖溶液：称取5.00 g蔗糖用pH5.5 0.1mol/L 醋酸-醋酸钠缓冲溶液配置成100mL。
3、1mol/L NaOH。
(二)仪器1、电热恒温水浴锅。
2、721分光光度计。
1、秒表或手表。
四、操作方法1、标准曲线制备使用1cm比色皿，在520nm波长条件下，以试剂空白条零，测定各管吸光值。
用坐标纸绘制标准曲线；或用回归法计算求出以A520nm值为自变量，葡萄糖含量(mg)为因变量的直线方程。
实验二蔗糖酶
1.
测定酶活的原理
蔗糖酶可作用于 β － 1 ， 2 糖苷键，将蔗糖水解为 D －葡萄糖和 D －果糖； Cu2+ 、 Zn2+ 、 Fe2+ 是其激活剂，Mn2+ 是其抑制剂。 葡萄糖和果糖具有还原性，在偏碱性条件下，可与3，5－二硝基水杨酸共热 后生成棕红色物质，在一定浓度范围内，还原糖的量和反应液的颜色强度成 正比例关系。 蔗糖酶的活力通过其水解生成的还原糖量来反映。
生物技术综合实验
2010.3
实验二、酵母蔗糖酶的提取和 酶活测定
实验目的
学习提取酵母蔗糖酶和测定酶活力的方法； 学习提取生物活性大分子的方法。
实验材料
材料：活性干酵母粉、石英砂； 试剂：95％冰乙醇、DNS液、PBS（pH7.2）、 5％蔗糖溶液、1N NaOH溶液； 仪器：水浴锅、高速冷冻离心机、722型分光 光度计。
2.
3.
提取工艺 1. 破碎酵母细胞的方法： 蔗糖酶分子量较大，一般采用研磨法彻底破碎 细胞使其释放出来，但应注意研磨过程中保持 低温防止酶失活； 或者采用自溶法（适当的酸度和温度下利用酵 母菌自身的酶系破坏细胞壁），此方法较为温 和，但是时间较长，需加入少量防腐剂，防止 过程中外界细菌污染； 原则：低温，处理时间短，防止酶失活。
2、DNS法测定还原糖量 试剂 粗酶液组 测定组1 对照组1 纯酶液组 测定组2 对照组2
水解液 （mL）
蒸馏水 （mL） DNS液 （mL）
1.0
1.0 1.0
1.0
1.0 1.0
1.0
1.0 1.0
1.0
1.0 1.0
沸水浴5min，自来水冷却，稀释至12mL，以对照组 调零，记录测定组OD540nm。
.蛋白质与酶工程实验
实验一固定化酵母细胞及蔗糖酶的检测一、实验目的1. 掌握固定化酵母的方法，从而获得固定化蔗糖酶。
2. 掌握蔗糖酶活力的测定原理及还原糖的定性检测法。
二、实验原理酵母细胞中富含蔗糖酶，蔗糖酶能将蔗糖转化成果糖和葡萄糖，葡萄糖和果糖同为六碳单糖，分子式为C6H12O6，但化学结构不同，前者为醛糖，后者为酮糖。
斐林试剂是新配制的Cu(OH)2溶液，它在加热条件下与醛基反应，被还原成砖红色的Cu2O沉淀，可用于鉴定可溶性还原糖的存在。
三、仪器和试剂仪器：三角瓶（1）、注射器（1）、试管（2）、水浴锅。
试剂：1、海藻酸钠50克；2、活性酵母150克；3、 10％蔗糖液：称取100克蔗糖用水定容至1000毫升；4. 斐林甲、乙液：各50ml。
5、4％氯化钙溶液（180克氯化钙溶于4320克水中）四、操作步骤l、称取海藻酸钠0.5克加入50毫升水中，微火加热溶解后冷却到30℃左右，将预先准备好的1.0克活性酵母的悬液加入混匀。
然后用注射器吸取，让其慢慢滴入4％氯化钙溶液中（150毫升），制成直径2－3毫米的球形固定化酵母。
刚形成的凝胶珠应在CaCl2溶液中浸泡一段时间，以便形成稳定的结构。
将此固定化酵母装入三角瓶中，加入10％的蔗糖液30毫升。
经固定化酵母水解30~40分钟，其成分为葡萄糖和果糖的混合液。
2、蔗糖酶的检测吸取斐林甲、乙液各1毫升于干燥试管中，加入水解液1毫升，沸水中保温，观察颜色反应。
有氧化亚铜沉淀的则说明蔗糖已被水解，管中有蔗糖酶的存在。
空白以10％蔗糖液做对照，其它同上。
斐林试剂甲：NaOH溶液，其浓度为0.1g/ml。
斐林试剂乙：CuSO4溶液，其浓度为0.05g/ml。
斐林试剂是新配制的Cu(OH)2溶液，它在加热条件下与醛基反应，被还原成砖红O沉淀，可用于鉴定可溶性还原糖的存在。
用斐林试剂鉴定可溶性还原色的Cu2糖时，溶液的颜色变化过程为：浅蓝色→棕色→砖红色（沉淀）。
思考题：1、细胞和酶的固定化有哪些方法？本实验中固定化酵母细胞属何种方法？2、有哪些方法可以终止酶的催化反应？3、固定化细胞催化有何特点？实验二果葡糖浆的酶法生产一、原理：葡萄糖异构酶催化葡萄糖异构化生成果糖，果葡糖浆是葡萄糖和果糖的混合糖浆。
蔗糖活力测定实验报告(3篇)
第1篇一、实验目的1. 了解蔗糖酶的活力测定原理和方法。
2. 掌握分光光度计的使用技巧。
3. 通过实验，掌握如何测定蔗糖酶的活力。
二、实验原理蔗糖酶活力测定是通过测定在一定条件下，酶催化蔗糖水解生成葡萄糖和果糖的速率来衡量酶的活力。
在本实验中，采用3,5-二硝基水杨酸法测定还原糖含量，进而计算蔗糖酶活力。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：- 蔗糖酶- 蔗糖- 3,5-二硝基水杨酸- 碳酸钠- 氢氧化钠- 硫酸铜- 碘化钾- 硫酸铁铵- 水浴锅- 分光光度计- 烧杯- 容量瓶- 移液管- 秒表2. 实验仪器：- 分光光度计- 烧杯- 容量瓶- 移液管- 秒表四、实验步骤1. 配制反应液：- 称取0.1g蔗糖酶，加入1ml蒸馏水溶解。
- 称取0.5g蔗糖，加入5ml蒸馏水溶解。
- 将蔗糖溶液和蔗糖酶溶液混合，总体积为10ml。
2. 水解反应：- 将混合液放入水浴锅中，设定温度为50℃，反应时间为30分钟。
3. 还原糖测定：- 取3ml反应液，加入3,5-二硝基水杨酸溶液2ml，混匀。
- 将混合液放入水浴锅中，加热至沸，反应时间为2分钟。
- 冷却至室温，用蒸馏水定容至10ml。
4. 比色：- 使用分光光度计，以蒸馏水为参比，测定混合液在540nm处的吸光度值。
5. 结果计算：- 根据标准曲线，计算还原糖含量。
- 根据还原糖含量和反应液体积，计算蔗糖酶活力。
五、实验结果与分析1. 标准曲线绘制：- 以不同浓度的葡萄糖溶液为标准，绘制标准曲线。
2. 蔗糖酶活力计算：- 根据实验数据，计算蔗糖酶活力。
3. 结果分析：- 通过比较不同实验条件下蔗糖酶活力，分析影响酶活力的因素。
六、实验结论通过本实验，我们成功掌握了蔗糖酶活力测定的原理和方法。
实验结果表明，在一定条件下，蔗糖酶活力与还原糖含量呈正相关，说明蔗糖酶具有催化蔗糖水解的能力。
七、实验注意事项1. 实验过程中，注意保持反应液的温度恒定。
2. 使用移液管时，注意避免气泡产生。
蔗糖酶-酶工程实验
y = 0.0061x + 0.0827 y——蛋白质含量（µg/ml） x——595nm 下光吸收 四、实验结果及计算
步骤
提取(I) 热处理 沉淀(II) 乙醇沉 淀(III)
总体积 单位体积活 总活力 （mL） 力（IU/mL） （IU）
总蛋白 （mg）
比活力
纯化 产率
（IU/mg 蛋白） 倍数 （%）
1.0
1.0
1.0
1.0
1.0
1.0
将各管溶液混匀后，在 100℃恒温水浴加热 5 分钟，取出立即用冷水冷却至室温
H2O
（ml）
7
7
7
7
7
7
将各管溶液混匀
7号 0．．.3．5． 0.70 1.30 1.0
7
A520nm 每步收集的酶液应进行一定倍数的稀释，先试做，选其吸光度值在 0.1-1.0 内，即还原糖含量应在 0.08~1.2
【实验一】蔗糖酶的提取（实验分组：4 人）
1.实验学时：6； 2.实验目的：掌握蔗糖酶提取的流程。 3.实验内容：沉淀、透析，及活性测定。计算酶的提取效率。 4.实验要求：理解影响酶提取的基本原理，掌握沉淀、透析等方法、影响实验结果的重要因素、掌握 数据的分析方法。 一、实验原理： 1、蔗糖酶 酵母细胞存在两种蔗糖酶，一种在细胞壁中，一种在细胞质内，前者活力较高，分子量较大（约 270KDa），后者活力较低，分子量约为 135KDa，两种酶的底物专一性和动力学性质十分相似，因此，本 实验未区分内酶与外酶。 2、蔗糖酶的初步分离纯化 本实验采用选择性变性（加热）、有机溶剂（乙醇）沉淀等方法对蔗糖酶进行初步的提纯。
【实验二】蔗糖酶的固定化及固定化酶性质的测定
1.实验学时：4 2.实验目的：掌握蔗糖酶固定化方法。 3.实验内容：采用包埋法固定蔗糖酶，并测定固定化效率。 4.实验要求：理解酶的固定化原理，掌握蔗糖酶固定化的方法、实验中影响实验结果的重要因素、掌 握数据的分析方法。
实验1 蔗糖酶的提取
三、实验材料与试剂
1、实பைடு நூலகம்材料 市售干酵母粉 10g/组(3～4人）
2、实验试剂
⑴ 石英砂，
⑵ 95% 乙醇(-20℃），
⑶ 20mmol/L Tris-HCl pH7.3 缓冲液。 四、实验器材与仪器 1、电子天平（称量样品）； 2、研砵（每组一套）； 3、50ml高速离心管（4支/组、4孔50ml离心管架一个/组）； 4、托盘天平（离心管平衡用）； 5、高速冷冻离心机； 6、恒温水浴箱（50℃）； 7、制冰机； 8、1.5ml离心管（留样品Ⅰ、Ⅱ用）及离心管架 ； 9、7ml离心管（留样品Ⅲ用）及离心管架 ； 10、－20℃冰箱。
五、实验操作方法和步骤 分组操作：每组3～4人。
1、酵母细胞破碎
称取市售干酵母粉10g，约3-5 g石英砂放入研钵中直接干燥充分研磨
至尽可能成细粉末状（约15分钟），量取总体积30-40 ml的20mmol/L Tris-HCl pH7.3 缓冲液，分2次加在研砵内研磨10分钟，使呈糊状液体； 将糊状液体转移到2支50ml离心管中，两支离心管平衡后，4℃、 12000r/min离心15分钟，收集上清液并量出体积V1（样品I）,另留1ml 上清液（样品I ）放置－20℃冰箱保存，用于蔗糖酶蛋白含量测定、蔗糖 酶活力测定和SDS-PAGE分析。 2、热处理： 将上一步抽提液（样品I），迅速放入50℃恒温水浴中，保温30分钟，并
用玻璃棒温和搅拌抽提液，保温后迅速用冰浴冷却5分钟，转移至两支
50ml离心管中，平衡后， 4℃，15000r/min离心15分钟，收集上清液 并量出上清液体积V2（样品Ⅱ），另留1ml上清液（样品Ⅱ）放置－20℃ 冰箱保存，用于蔗糖酶蛋白含量测定、测定蔗糖酶活力和SDS-PAGE分析。
大实验 酵母蔗糖酶的提取及其性质的研究
大实验酵母蔗糖酶的提取及其性质的研究本实验为学生提供一个较全面的实践机会，学习如何提取纯化、分析鉴定一种酶，并对这种酶的性质作初步的研究。
一．实验原理及相关知识（1）蔗糖酶的介绍自1860年Bertholet从酒酵母Sacchacomyces Cerevisiae中发现了蔗糖酶以来，它已被广泛地进行了研究。
蔗糖酶（invertase）（fructofuranoside fructohydrolase）（EC.3.2.1.26）特异地催化非还原糖中的 —呋喃果糖苷键水解，具有相对专一性。
不仅能催化蔗糖水解生成葡萄糖和果糖，也能催化棉子糖水解，生成蜜二糖和果糖。
（2）。
实验原理：本实验提取面包酵母中的蔗糖酶。
该酶以两种形式存在于酵母细胞膜的外侧和内侧，在细胞膜外细胞壁中的称之为外蔗糖酶（external yeast invertase）, 其活力占蔗糖酶活力的大部分，是含有50% 糖成分的糖蛋白。
在细胞膜内侧细胞质中的称之为内蔗糖酶（internal yeast invertase），含有少量的糖。
两种酶的蛋白质部分均为双亚基，二聚体，两种形式的酶的氨基酸组成不同，外酶每个亚基比内酶多两个氨基酸，Ser和Met，它们的分子量也不同，外酶约为27万(或22万，与酵母的来源有关)，内酶约为13.5万。
尽管这两种酶在组成上有较大的差别，但其底物专一性和动力学性质仍十分相似，因此，本实验未区分内酶与外酶，而且由于内酶含量很少，极难提取，本实验提取纯化的主要是外酶。
两种酶的性质对照表如下：实验中，用测定生成还原糖（葡萄糖）的量或旋光法来测定蔗糖水解的速度，在给定的实验条件下，每分钟水解底物的量定为蔗糖酶的活力单位。
比活力为每毫克蛋白质的活力单位数。
本实验共有以下分实验：一、蔗糖酶的提取与部分纯化二、离子交换柱层析纯化蔗糖酶三、蔗糖酶各级分活性及蛋白质含量的测定四、反应时间对产物形成的影响（一）蔗糖酶的提取与部分纯化：一、实验目的：学习酶的纯化方法。
酶工程实验讲义
实验一酵母蔗糖酶的提取一、原理酵母中含有丰富的蔗糖酶(EC.3.2.1.26)，本实验以酵母为原料，通过超声波破碎细胞、硫酸铵沉淀等步骤，分离纯化酵母蔗糖酶。
二、实验材料、仪器和试剂1.材料活性干酵母2.仪器(1)高速离心机(2)恒温水浴锅(3)超声破碎仪3.试剂(1)1 mol/L醋酸溶液三、操作步骤1.破碎细胞取5 g干酵母，加5 g石英砂，置于预先冷却的研钵中，加30 mL去离子水，研磨30 min，在冰箱中冰冻约10 min（研磨液面上刚出现冰结为宜），重复2次。
将研磨液转移至大离心管中，12000 r/min离心15 min，弃去沉淀。
2.加热除杂蛋白将上清液转入三角瓶，用1 mol/L醋酸溶液逐滴加入，调其pH值至5.0，然后迅速放入50℃的水浴中，保温30 min。
在温育过程中，注意经常缓慢搅拌液体。
之后在冰浴中迅速冷却之，以12000 r/min的转速离心20 min，弃去沉淀。
留0.5 mL上清液为第二组分。
3.乙醇沉淀量出上清液的体积，加入等体积的95%冷乙醇溶液(预先放在-20℃低温下的时间不少于30 min)，于冰浴中温和搅拌20 min。
然后以12000 r/min的转速离心25 min，小心弃去上清液，沉淀沥干。
将沉淀溶解在6 mL 0.05 mol/L Tris-HCl 缓冲液(pH值7.3)中，搅拌(5 min以上)使其完全溶解，以12000 r/min的转速离心25 min，取出0.5 mL上清液作为第三组分，剩余部分(乙醇抽提液)进行第4步操作。
用尿糖试纸进行半定量测定：在白瓷板每孔中分别滴3滴待测酶液，再加3滴含5％蔗糖的pH 4.6的醋酸缓冲液，搅匀，37℃放置10 min，浸入尿糖试纸，1 s后取出，60 s后比较颜色的深浅，与比色卡对照。
尿糖试纸的原理：尿糖试纸是将葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶及无色的化合物固定在纸条上，制成的测试尿糖含量的酶试纸。
溶液（或尿液）中的葡萄糖在葡萄糖氧化酶的催化作用下，形成葡萄糖酸和过氧化氢；过氧化氢在过氧化氢酶的催化作用下形成水和原子氧；原子氧可将某种无色的化合物氧化成有色的化合物。
酶催化蔗糖转化 实验报告
根据蔗糖转化体系的蔗糖和果糖、葡萄糖的比例关系，可以制作不同浓度下混和体系的旋光度的工作曲线。例如0.1 M蔗糖转化体系的旋光度和葡萄糖浓度的工作曲线，实际上是制作0.1 M蔗糖转化进程工作曲线，不同的蔗糖浓度有不同的进程工作曲线，从若干不同蔗糖浓度的进程工作曲线得到这些工作曲线直线关系很好，且直线的斜率与蔗糖的浓度无关，经过线性拟合，其直线方程为：
2.736
2.585
0.0024994
0.0004999
0.0041656
6
18.0
0.15
0.0513
3.420
3.255
0.0027302
0.0005460
0.0036403
7
21.6
0.18
0.0616
4.103
3.986
0.0019491
0.0003898
0.0021657
8
25.2
0.21
用反应速度V对（V/S）作图，直线的斜率-Km，直线的截距为Vmax，从而可以求出米氏常数Km。
五、数据处理
1．利用(3)中的数据计算酶的比活性。
起始旋光度
结束旋光度
葡萄糖浓度
生成葡萄糖的毫克数
1.859
1.762
0.001609mol/L
24.638mg
由 比活性(单位/mL)＝(生成葡萄糖的毫克数)/(酶的体积)，可得：
y＝－60.28x＋
其中x－蔗糖转化成葡萄糖的浓度（M）
y－蔗糖转化进程中体系的旋光度值
－不同浓度蔗糖溶液的旋光度值，其值可以测定，也可以通过下式计算。
＝66.6×L×C（L＝10cm，C是蔗糖浓度g/mL）
酶工程实验相关数据处理
酶工程实验相关数据处理实验一：酵母蔗糖酶的提取（12.11.13）表1.DNS法测葡萄糖浓度空白标准葡萄糖浓度梯度样品管号 0 1 2 3 4 5 A B 葡萄糖标准液mg/ml 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 0 0 蔗糖溶液 1 1 1 1 1 1 1 1 醋酸buffer 1 1 1 1 1 1 1 1 待测酶液 0 0 0 0 0 0 50ul 50ul 37℃准确反应15min，1 ml 1 mol/L NaOH终止酶促反应水杨酸试剂（DNS） 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml沸水浴精确反应5 min,冷却后定容至20 mlA540 0 0.100 0.205 0.300 0.375 0.478 0.474 0.412由上图可得：葡萄糖标准曲线方程为y=0.4729x+0.0066根据上表中测得的样品的吸光度可得到：样品A：x=0.988 样品B：x=0.857由此可得：酶含量平均值X=0.923 所以，粗提样品中酶含量为0.923mg实验二：蔗糖酶酶学性质研究(2012.11.14)表2.葡萄糖标准曲线绘制空白标准葡萄糖浓度梯度管号 0 1 2 3 4 5葡萄糖标准液mg/ml 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1蔗糖溶液（ml） 1 1 1 1 1 1醋酸buffer（ml） 1 1 1 1 1 1 37℃准确反应15min，1 ml 1 mol/L NaOH终止酶促反应水杨酸试剂（DNS） 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml 沸水浴精确反应5 min,冷却后定容至20 mlA540 0 0.088 0.176 0.297 0.402 0.452由图可知，葡萄糖标准曲线方程为：y=0.4747x-0.00151、最适pH的测定（1）待测组的加样量及加样顺序表3.pH对酶活力的影响管号 1 2 3 4 5 6 7蔗糖溶液（ml） 1 1 1 1 1 1 1不同pH缓冲液（ml） 1 1 1 1 1 1 1体系pH 2.5 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0待测酶液 50ul 50ul 50ul 50ul 50ul 50ul 50ul37℃准确反应15min，1 ml 1 mol/L NaOH终止酶促反应水杨酸试剂（DNS） 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml沸水浴精确反应5 min,冷却后定容至20 mlA540 0.017 0.035 0.053 0.063 0.054 0.024 0.004 （2）空白组的加样量及加样顺序空白组的加样量与待测组的相同，不同之处在于空白组先各加1ml 1 mol/L NaOH，然后进行37℃水浴，其余顺序及时间均相同。
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蔗糖酶液 （ml） 0.0 0.05 0.2 0.5 0.05 0.2 0.5 0.05 0.2 0.5 0.02 0.2 0.5
5% 蔗 糖 溶 液 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5
（ml）
保温时间
立即混匀后，35℃保温 10 分钟
(5) 考马斯亮蓝 G-250 溶液（0.01%）：称取 0.1g 考马斯亮蓝 G250 溶于 50ml 95%乙醇中，再加入 100ml 浓磷酸（市售质量百分数为 85%），然后加蒸馏水定容至 1000ml。
(6) 3,5-二硝基水杨酸试剂:
3.15 g DNS（3,5-二硝基水杨酸,化学纯）溶于 131 ml 2M NaOH热溶液中（10.48g NaOH溶于 131ml蒸馏水 中），加入 250 ml酒石酸钾钠热溶液（91 g酒石酸钾钠溶于 250 ml蒸馏水中），再加 2.5 ml苯酚（固体加 热）和 2.5 g Na2SO3，溶解后定容到 500 ml，贮于棕色瓶中 7 天后使用。 2、仪器：
由于酶蛋白在分离纯化过程中易变性失活，为了能获得尽可能高的产率和纯度，在提纯操作中要始 终保持酶的活性，如在低温下操作等，这样才能收到较好地分离提纯效果。
蛋白质在用有机溶剂沉淀分离后，需要将蛋白质中的有机溶剂除去，常用的办法是透析。透析机可以 除盐，又可以除杂蛋白，即把蛋白质溶液装入透析袋内，用缓冲液进行透析，并不断的更换缓冲液，因透 析 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
0.2mol/L 乙酸缓冲 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5
液 （ml）
蒸馏水 （ml） 1.0 0.95 0.8 0.5 0.95 0.8 0.5 0.95 0.8 0.5 0.95 0.8 0.5
以与钙、铜等正二价阳离子迅速形成凝胶。海藻酸钠浓度过大时，凝胶的孔径较小，影响酶与底物的结合；
海藻酸钠浓度较小，凝胶的孔径太小，固定化酶容易流失，所以酶活较低。氯化钙浓度过低时也会导致凝
胶强度太小，孔径过大，包埋不完全，内部的部分酶会损失。
3、蔗糖酶活性测定原理 蔗糖酶（β-D-呋喃型果糖苷-果糖水解酶 EC 3.2.1.26），是一种水解酶。它能催化非还原性双糖（蔗 糖）的 1,2-糖苷键裂解，将蔗糖水解为等量的葡萄糖和果糖（还原糖）。因此，每水解 1mol 蔗糖，就能生 成 2mol 还原糖。还原糖的测定有多种方法，例如：纳尔逊－索模吉（Nelson-Smogyi）试剂比色法，斐林 试剂法等。 本实验采用 3.5-二硝基水杨酸法测定还原糖的含量，由此可得出蔗糖酶水解速度。其原理是 3.5-二硝 基水杨酸与还原糖共热被还原成棕红色的氨基化合物，在一定范围内还原糖的量和反应液的颜色深度成正 比。因此可利用分光光度计在 520nm 进行比色测定，求得样品中的含糖量。此法操作简便、迅速、杂质干 扰较小。 蔗糖酶活力单位(u)：蔗糖酶在室温(25℃）, pH4.5 的条件下，每分钟水解产生 1μmol 葡萄糖所需的 酶量(ml)。 蔗糖酶比活力的计算：每毫克蛋白质所具有的酶活力单位数，一般用酶活力单位/mg 蛋白质表示。酶 的比活力在酶学研究中用来衡量酶的纯度，对于同一种酶来说，比活力越大，酶的纯度越高。利用比活力 的大小可以用来比较酶制剂中单位质量蛋白质的催化能力，是表示酶的纯度高低的一个重要指标。 比活力——酶的总活力单位数除以总蛋白 mg 数，即每 mg 蛋白所含有的酶活力单位数。 比活力＝活力单位/mg 蛋白 4、蛋白质浓度测定原理： Bradford 法是基于考马斯亮蓝 G-250 有红、蓝两种不同颜色的形式，在一定浓度的乙醇和酸性条件下， 可配成淡红色的溶液，当与蛋白质结合后，产生蓝色化合物，反应迅速稳定，反应化合物在 465～595nm 有最大的吸光值，化合物颜色的深浅与蛋白质浓度的高低成正比关系。因此可检测 595nm 的光吸收值的大 小计算蛋白质的含量。 二、试剂和仪器 1、实验材料 （1）市售蔗糖酶， 95% 乙醇(-20℃）、透析袋；（2）5%蔗糖溶液 500ml；（3）20mmol/L Tris-HCl pH7.3 缓冲液。 （4）0.2mol/L 乙酸缓冲液（pH 4.5）： A：0.2mol/L NaAC：称取 27.616g NaAC 溶解并定容至 1000ml。 B：0.2mol/L HAC：100ml 乙酸(分析纯)定容至 500ml。 将两者分别取 315ml、185ml 混合，用强碱调 pH 到 4.5。
μmol 的稀释度为宜。读取吸光度值，以吸光度的平均值查标准曲线即可求出酶活力。
蔗糖酶活力单位（U/mL）：酶在 35℃，pH=4.5 条件下，每分钟水解产生 1μmol 葡萄糖所需酶量。
蔗糖酶活力单位=酶的稀释倍数×(x 微克/180 分子量)/10min/酶液体积
样品
空 白
样品 I（1：200） 样品 II（1：200） 样品 III（1：200） 样品 IV（1：50）
电子天平（称量样品）；10ml 塑料离心管（4 支/组）；高速离心机；恒温水浴箱； 1.5ml 离心管（留样 品Ⅰ、Ⅱ、III 用）及离心管架 ；4℃冰箱；磁力搅拌器；分光光度计；微量移液枪（200ul～1000ul）；电 磁炉及搪瓷缸。 三、实验步骤 1、蔗糖酶的提取：
称取市售蔗糖酶 0.1g，量取 20ml 预冷的 20mmol/L Tris-HCl（pH7.3） 缓冲液溶解，静置 3min 后将 上清转移到 2 支 10ml 离心管中，两支离心管平衡后， 4000r/min 离心 5 分钟，收集上清液并量出体积， 4℃冰箱保存，留 1ml 用于蔗糖酶蛋白含量测定和蔗糖酶活力测定。 2、热处理： 取上一步抽提液（样品 I）20ml，加 4mol/L 的预冷的醋酸(1ml 左右)，使溶液的 pH 值约为 4.5 左右， 迅速放入 45℃恒温水浴中，并用玻璃棒温和搅拌，保温 30 分钟后迅速用冰浴冷却 5 分钟，转移至 10ml 离心管中，平衡后，4000r/min 离心 10 分钟，小心收集上清液（样品Ⅱ）并量出上清液体积 V2，另留 1ml 上清液（样品Ⅱ）放置 4℃冰箱保存，用于蔗糖酶蛋白含量测定和测定蔗糖酶活力。 3、有机溶剂（乙醇）沉淀： 将热处理后的上清液用稀醋酸调节 pH 值至 4.5，用 32％的乙醇饱和度除杂蛋白（计算所需 95％乙醇 的量并与初酶液在冰浴中预冷，缓慢滴加预冷的 95％乙醇并不断搅拌。滴加结束后，4℃放置 30 分钟， 于 4000r／min 离心 10min，留取上清液）；再用预冷的 95％乙醇调节酶液到 47.5％的乙醇饱和度，4 ℃放置 30 分钟，于 4000r／min 离心 10min 沉淀蔗糖酶（此时需准确计算出使粗酶液的乙醇浓度达 47.5 ％时所需补加 95％乙醇的体积）。小心弃去上清，在沉淀中加入 4mL Tris-HCl 缓冲液（pH 7.3，20mmol/L） 4、透析 将上述粗酶提取液装入透析袋中，对 20mmol/L Tris-HCl pH 7.3 缓冲液（1000ml）充分透析 5～6 小时 （磁力搅拌，每隔 1 小时更换缓冲液），7000rpm 离心 10min，弃沉淀，取上清液（样品 III）。并取 出 1mL 待测酶液，测定酶的活力和蛋白浓度。 5、测定样品 I、II、III 的蔗糖酶活性 还原糖标准曲线为： 以还原糖（mg 数）为横坐标，A520 值为纵坐标，制作葡萄糖浓度－吸光值标准曲线.
五、讨论 1.本实验在对蔗糖酶进行初步纯化时的两次蛋白质沉淀的原理是不一样的，第一次是蛋白质在高温条件下 变性失活，第二次是在有机溶剂中沉淀，蛋白质保持原有构型和活性。因为蔗糖酶比较耐高温，可以在 50 摄氏度保持活性，因此蔗糖酶在纯化过程中不会有太大的损失。但是在离心等过程中，为了尽可能地保持 蔗糖酶的活性，还是要在低温中进行。 2.在进行离心操作前，要先对两支离心管进行平衡（要盖上离心管的盖子，因为不同的盖子的质量也是不 一样的），避免离心过程中产生较大噪音甚至损坏离心机。
试管号
1号
2号
3号
4号
5号
6号
葡．萄．糖．浓．度．（．g．．/L．）．
0．
0．．.1． 0．．.1．5． 0．．.2． 0．．.2．5． 0．．.3．
1g/L 葡萄糖标准溶液（ml）
0.00
0.20
0.30
0.40
0.50
0.60
H2O
（ml）
2.0
1.80
1.70
1.60
1.50
1.40
3，5-二硝基水杨酸 （ml）
和，很少改变酶蛋白结构的固定化方法，此法对大多数酶、粗酶制剂、甚至完整的微生物细胞都适用。但
此法较适合于小分子底物和产物的反应，因为在凝胶网格和微囊中存在有分子扩散效应。加大凝胶网格，
有利于分子扩散，但使凝胶的机械强度降低。
海藻酸钠作为固定化酶的载体，对固定化酶的酶活力有显著影响。海藻酸钠具有强烈的吸附作用，可
3，5-二硝基水杨酸 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
试剂 （ml）
保温时间
在 100℃恒温水浴中加热 5 分钟
蒸馏水 （ml） 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7
混匀
A520nm 还原糖（mg） 6、测定样品 I、II、III 的蛋白质含量 0.8ml的样品I、II、III加入 3.2ml的考马斯亮蓝溶液，反应时间为 10min，测定的A595 值，依据上述公式 即可计算出样品的蛋白质含量。
蛋白质浓度标准曲线做法（不做，直接套用公式）： 采用了 Bradford 法，首先配置 1mg/ml 的牛血清蛋白（BSA）母液，再用灭菌的去离子水依次稀释一 组浓度为 100µg/ml，75µg/ml，50µg/ml，25µg/ml，5µg/ml 的 BSA 溶液，室温反应体系为 0.8ml 的蛋白样 品加入 3.2ml 的考马斯亮蓝溶液，反应时间为 10min，然后在 595nm 波长下测定吸光值，用标准蛋白质量 （µg）为横坐标，用吸光度值为纵坐标，作图，即得到标准曲线，