酶工程实验

4、酶催化产物检测
取5支试管，分别加入反应物：
试管编号
反应液
DNS试剂
1
0.5 ml A
0.5 ml
2
0.5 ml B
0.5 ml
3
0.5 ml C
0.5 ml
4
0.5 ml D
0.5 ml
5（空白）
0.5 ml 蒸馏水
0.5 ml
试管中反应物在沸水浴中反应5 min，然后冷却。加入4 ml蒸馏水。将各试管摇匀，用空白管溶液（5号管）调零点，测定它们的吸光度值A540。
还原糖在碱性条件下加热被氧化成糖酸及其它产物，3,5-二硝基水杨酸则被还原为棕红色的3-氨基-5-硝基水杨酸。在一定范围内，还原糖的量与棕红色物质颜色的深浅成正比关系，利用分光光度计，在540nm波长下测定光密度值，查对标准曲线并计算，便可求出样品中还原糖和总糖的含量。
实验三蔗糖酶包埋及固定化酶活测定
3、酶反应
取四支试管，分别按顺序加入反应物：
试管编号
①酶液
②氢氧化钠溶液
③醋酸缓冲液
④蔗糖溶液
A（对照管）
0.5 ml
1 ml
1 ml
1 ml
B
0.5 ml
---
2 ml
1 ml
C（对照管）
0.5 ml
1 ml
1 ml
1 ml
D
0.5 ml
---
2 ml
1 ml
试管中反应物在55 ℃水浴中反应5 min（秒表计时）后，B、D管立即各加入1 ml氢氧化钠溶液（2 mol/L）终止反应，A、C管中各加入1 ml蒸馏水。
本实验以马铃薯提供过氧化氢酶，以1/ν~1/[S]作图求Km
三、实验器材
1.锥形瓶100～150ml（×6）。
2.吸管1.0ml（×2）、0.5ml（×2）、2.0ml（×2）、5ml（×2）、10.0ml（×1）。
3.温度计（0～100℃）。
4.微量滴定管5ml（×1）。
5.容量瓶1000ml（×1）。
将反应液定容至20 ml，取0.5 ml稀释至5 ml，得D液。
取2支试管，分别加入反应物：
试管编号
反应液
DNS试剂
1
0.5 mlD
0.5 ml
2（空白）
0.5 ml 蒸馏水
0.5 ml
试管中反应物在沸水浴中反应5 min，然后冷却。加入4 ml蒸馏水。将各试管摇匀，用空白管溶液调零点，测定它们的吸光度值A540。
4、酶活回收率的计算：
酶活回收率=
附：
还原糖和总糖的测定——3,5-二硝基水杨酸比色法
还原糖的测定是糖定量测定的基本方法。还原糖是指含有自由醛基或酮基的糖类，单糖都是还原糖，双糖和多糖不一定是还原糖，其中乳糖和麦芽糖是还原糖，蔗糖和淀粉是非还原糖。利用糖的溶解度不同，可将植物样品中的单糖、双糖和多糖分别提取出来，对没有还原性的双糖和多糖，可用酸水解法使其降解成有还原性的单糖进行测定，再分别求出样品中还原糖和总糖的含量（还原糖以葡萄糖含量计）。
用注射器（7号针头）将C液滴入CaCl2溶液，滴时不断搅拌溶液。静置20 min，固化胶珠。纱布过滤得到胶珠，用蒸馏水清洗胶珠，称取湿胶珠质量（W1），并记录。
6、催化
取1 g湿胶珠置于烧杯中，加入20 ml 5%蔗糖溶液，37℃反应10 min，取出反应液，与胶珠分离，反应终止。
7、酶催化产物检测
(10)激活剂：用0.1mol/L磷酸缓冲液(pH值7.2)配制，含20mmol/L半胱氨酸、1mmol/LEDTA的混合液。
(11)0.5%酪蛋白溶液：用0.1mol/L磷酸缓冲液(pH值7.2)配制。
(12)10%三氯乙酸(TCA)溶液。
四、操作步骤
1、固定化酶的制备
(1)每组取5块尼龙布洗净、晾干，浸入含18.6%CaCl2溶液10s，再浸入18.6%水的甲醇溶液中，轻轻搅拌5min以上至尼龙发粘。取出后用水洗涤，用滤纸吸干。
(5)从酶液中取出尼龙布，用0.5mol/L NaCl溶液(用0.1mol/L磷酸缓冲液(pH值7.2)配制)，洗去多余的酶蛋白，即为尼龙固定化酶。
2、酶活力测定
A．0.2ml 木瓜蛋白酶+1.8ml激活剂+1ml酪蛋白液
B．0.2ml 木瓜蛋白酶+1.8ml激活剂+2ml 10%三氯乙酸+1ml酪蛋白液
图1产淀粉酶菌落形成的透明圈
三、材料、试剂和仪器
1、菌的来源
取不同地点的表层土壤。
2、试剂：
RBV-Starch（Sigma）, NaNO3, K2HPO4, MgSO4, KCl,2 mol/L NaOH无菌水和琼脂粉等。
二、原理
产淀粉酶的菌株能分泌淀粉酶到菌落周围的培养基中，从而水解培养基中的淀粉，由于使用的是经活性染料标记的带颜色的淀粉（本实验为RBV-淀粉，呈鲜艳的紫红色），当其被淀粉酶作用后便形成可溶，且较易扩散的小分水解物，从而在该菌落周围形成颜色较浅的透明圈。而透明圈直径与菌落直径之比则可反应菌落分泌淀粉酶能力的高低。本方法有快速、简单易行等优点。
六、目的：
了解凝胶包埋法及固定化酶活测定方法。
七、原理：
海藻酸钠在遇到Ca2+时成胶，从而把酶包埋在其中。（请参考相关教材）
八、试剂与仪器
1、试剂与材料：
(8)干酵母
(9)海藻酸钠
(10)无水氯化钙
(11)5%蔗糖溶液
(12)DNS（3,5-二硝基水杨酸）试剂
2、仪器：
电子天平、分光光度计、水浴锅、电炉、烧杯、玻棒、量筒、试管、量筒、移液管、注射器（带7号针头）、纱布。
(3)1 mol/L醋酸溶液
(4)2 mol/L氢氧化钠溶液
(5)醋酸缓冲液（pH 4.6）
(6)5%蔗糖溶液
(7)DNS（3,5-二硝基水杨酸）试剂
2、仪器：
电子天平、离心机、分光光度计、水浴锅、电炉、研钵、试管、三角瓶、量筒、移液管。
四、操作方法
1、破碎细胞
取2 g干酵母于研钵中，加入2 g石英砂，加30 ml去离子水，研磨15 min，放入冰箱冷冻室（-20℃）冰冻约20min（研磨液面上刚出现冰结为宜）。
4、0.004mol/L KMnO4：准确称取恒重草酸钠0.2g，加250ml冷沸水及10ml浓硫酸，搅拌溶解，用0.02ml/L的KMnO4滴定至微红色，水浴，加热至65℃，继续滴定至溶液微红色并30s不褪，算出KMnO4的准确浓度稀释成0.004mol/L即可。
5、0.05 mol/L H2O2：取30%H2O223ml加入1000ml容量瓶中，加蒸馏水至刻度（约0.2mol/L），用标准KMnO4（0.004mol/L）标定其准确浓度，稀释成0.05mol/L（标定前稀释4倍，取2.0ml，加25%H2SO42.0ml，用0.004mol/LKMnO4滴定至微红色）。
九、操作方法
4、配A液
取0.75 g海藻酸钠溶在25 ml蒸馏水中，沸水浴（勿用电炉直接加热）充分溶胀。自然冷却。
5、配B液
取1 g干酵母溶在25 ml蒸馏水中（室温），搅匀。
6、配C液
A液冷却后，将B液倒入其中，搅匀。
4、配CaCl2液
取2.2 g无水CaCl2溶于200 ml蒸馏水中。
5、制备胶珠
2.酶活回收=
六、注意事项
(1)尼龙布的处理是本实验成败的关键，既要让其充分地活化，又不能使其破碎。
(2)固定化酶溶液浓度最好为0.5～1mg/mL，对每块尼龙布用量不宜超过0.8mL。
(3)酶活性测定的反应时间一定要准确。
实验四、产淀粉酶菌株的快速筛选
一、目的
学习和掌握分泌目的酶菌株的基本原理和筛选方法。
取出冷冻酵母，再研磨5 min后，在5000 r/min条件下离心12 min，小心取出上清液（组分一）并量出体积V1，分别取0.5 ml上清液到试管A、B中，余者倒入三角瓶。
2、纯化
把三角瓶中的上清液用1 mol/L醋酸溶液调pH 5.0（试纸）。然后迅速放入到55 ℃的水浴中，保温30 min。之后在冰浴中迅速冷却。在5000 r/min条件下离心12 min。取出上清液（组分二）并量出体积V2，分别取0.5 ml上清液到试管C、D中。
实验一过氧化氢酶米氏常数的测定
一、目的
了解米氏常数的意义，测定过氧化氢酶的米氏常数。
二、实验原理
H2O2被过氧化氢酶分解出H2O和O2，未分解的H2O2用KMNO4在酸性环境中滴定，根据反应前后H2O2的浓度差可求出反应速度。
E
H2O2--- -->2H2O+O2
2KMNO4+5H2O2------------>2MnSO4+K2SO4+5O2+8H2O
3、试剂
(1)18.6%CaCl2溶液 (2)甲醇溶液 (3)3.65mol/LHCl溶液
(4) 0.2mol/L硼酸缓冲液(pH值8.5)
(5)5%戊二醛溶液：用0.2mol/L硼酸缓冲液配制，pH值8.5
(6) 0.1mol/L磷酸缓冲液(pH值7.8) (7)1mg/mL木瓜蛋白酶溶液
(8) 0.5mol/L NaCl溶液 (9) 0.1mol/L磷酸缓冲液(pH值7.2)
五、结果计算
1、酶活力单位的定义：
本实验中，蔗糖酶的活力单位指在55℃条件下，每1 min催化底物转化为1 mg还原糖的酶量。
2、酶活计算：
粗酶的计算酶活（组分一）：
纯化后酶的计算酶活（组分二）：
3、总酶活的计算：
总酶活1（组分一，粗酶）：计算酶活×稀释倍数
总酶活2（组分二，纯化后酶）：计算酶活×稀释倍数
十、结果计算
5、酶活力单位的定义：
本实验中，蔗糖酶的活力单位指在37℃条件下，每1 min催化得到1 mg还原糖所需酶量。
6、酶活计算：
1 g固化酶酶活：
十一、思考题
1、海藻酸钙包埋法中钙起什么作用？与豆腐制作中Ca2+的作用有何关系？
2、除了凝胶包埋法，还有哪些包埋方法？其原理是什么？
实验四尼龙固定化木瓜蛋白酶
(2)将尼龙布用3.65mol/L HCI溶液在室温下水解45min，用水洗至pH值中性（pH试纸检测）。
(3)将尼龙布用5%戊二醛溶液在室温下浸泡偶联20min。
(4)取出尼龙布，用0.1mol/L 磷酸缓冲液(pH值7.8)洗涤3次，洗去多余的戊二醛，吸干之后，加入5ml1mg/mL的木瓜蛋白酶液，在室温下固定30min。
一、目的：
了解共价交联法固定酶的原理和步骤
二、原理
尼龙是聚酰胺物质，经HCl水解后暴露出游离NH2，NH2与戊二醛反应，尼龙即成活化载体，可与酶表面NH2反应，把酶连在尼龙上。
三、实验材料、仪器和试剂
1、材料
尼龙布(86或66)，140目，剪成3cm×3cm
2、仪器
(1)恒温水浴锅 (2)紫外分光光度计 (3)冰箱
6、25% H2SO4
五、操作
取锥形瓶6只，按下表顺序加入试剂：
表一过氧化氢酶米氏常数的测定
管号
试剂
0
1
2
3
4
5
0.05mol/LH2O2/ml
蒸馏水/ml
酶液/ml
0
9.5
0.5
1.00
8.50
0.5
1.25
8.25
0.5
1.67
7.83
0.5
2.5
7.0
0.5
5.00
4.50
0.5
先加好0.05mol/LH2O2及蒸馏水，加酶液后立即混合，依次记录各瓶的起始反应时间。各瓶时间达5min时立即加2.0ml25%硫酸终止反应，充分混匀。用0.004mol/LKMnO4滴定各瓶中剩余的H2O2至微红色，记录消耗的KMnO4体积。
ห้องสมุดไป่ตู้六、计算
分别求出各瓶的底物浓度[S]和反应速度v。
[S]=c1V1/10
式中[S]：底物物质的量浓度（mol/L）；
c1：H2O2物质的量浓度（mol/L）；
V1：H2O2体积（ml）；
10：反应的总体积（ml）；
υ：反应速度（m mol/min）；
c2：KMnO4物质的量浓度（mol/L）；
V2：KMnO4体积（ml）；
四、实验试剂
1、0.02mol/L磷酸缓冲液（Ph7.0）
取磷酸二氢钾0.68g，加0.1mol/L氢氧化钠溶液 29.1ml，用水稀释至100ml,即得。
2、酶液：称取马铃薯5g，加上述缓冲液10ml，匀浆，过滤。
3、0.02mol/L KMnO4：称取KMnO4（AR）3.2g，加蒸馏水1000ml，煮沸15min，2d后过滤，棕色瓶保存。
C. 固定化酶一张（剪碎）+2.0ml激活剂+1ml酪蛋白液
取三支试管按上述加入反应液，37℃反应15min，A、C+2ml 10%三氯乙酸。
三支试管过滤上清液到另三支试管中，以B管作空白，测试管A、C吸光值（280nm，紫外）
五、结果计算
1.酶活定义：每15min增加0.001个消光值所需酶量为1个酶活单位。
以1/υ对1/[S]作图求出Km。
实验二酵母蔗糖酶的部分纯化与酶活测定
一、目的：
了解酶的纯化方法。
二、原理：
酵母中含有丰富的蔗糖酶(EC.3.2.1.26)，本实验以酵母为原料，通过破碎细胞方式得到粗酶，并用热变性法除杂蛋白纯化。（请参考相关教材）
三、试剂与仪器
1、试剂与材料：
(1)干酵母
(2)石英砂