植物内生细菌的研究现状-洪永聪-06.11.10

其它
DNA和RNA探针法、 同位素示踪法等
绿色荧光蛋白基因（gfp）标记
法的优点
作为报告基因，gfp基因表达出来的绿色荧光蛋白 （GFP）折叠效率高，可以在多种生物体内表达， 对细胞或组织都无毒害作用
GFP的激发不消耗生物能量，不需要任何底物或辅 因子
GFP还具有稳定性好，能耐受穿透、毒素、光漂白 等，如GFP在甲醛固定、65℃处理半小时以及pH值 6~12范围内表现稳定
国内植病生防菌的研究
何红等（2002）从辣椒体内分离的内生细菌，对枯萎病菌
（Fusarium sp.）、黄萎病菌(Verticillium sp.)、炭疽病 菌(Colletotrichum sp.)等16种病原真菌有较强的拮抗作用，
其中2株分别来自辣椒叶和茎内的枯草芽孢杆菌，对辣椒、白 菜和香蕉等炭疽病具有良好的生防效果，并对辣椒、白菜等 植物有明显的促生效果 邱思鑫等（2004）从烟草、茄子和番茄体内分离的对辣椒疫 霉、黄瓜枯萎等15种病原有拮抗作用的内生解淀粉芽孢杆菌、 枯草芽孢杆菌，在室内对辣椒疫病具有良好防治效果，并且 对黄瓜枯萎病也有一定的控制作用，且其中TBF2菌株可在烟 草和辣椒体内传导
因此，内生细菌在作物病害生防上的应用广泛 受到人们的重视，目前已有不少相关报道
国外植病生防菌的研究
Kunal et al.（1996）从水稻中分离到了7株内生
细菌，电镜观察表明，内生细菌主要分布于水稻 幼苗根的中柱区域，对多种水稻病原菌表现出很 强的体外拮抗活性
Adhikari et al. （2001）从水稻根茎内外分离到
研究发现，内生细菌在与寄主植物长期的协同 发展过程中，彼此形成了相互依存、相互作用 的生态学关系，植物内生细菌对植物生长发育、 抵抗不良外界环境、抵御病虫害等具有广泛的 生物学作用
植物内生细菌的生物学作用
按内生细菌对植物的作用效果可分为有 益、有害和中性3类
其中大部分对植物的作用是中性的，约 5~10%的内生细菌对植物有益，10~20%对 植物可能有害或无益
国外植病生防菌的研究
Van Buren（1993）从马铃薯块茎中分离到192株内 生细菌，通过筛选发现32%的菌株可用于防治
Coynebacterium michgnense subsp sepedonicum引
起的马铃薯病害
Sturz et al. （1999）对马铃薯块茎中不同部位内生 细菌对土传病原真菌接骨木镰孢（Fusarium sambucinum），燕麦镰孢（F. avenaceum），尖孢 镰孢（F. oxysporum），致病疫霉（Phytophthora infestans）等的拮抗作用测定表明，外皮层内生细
生活部史分或腐某生个菌阶、段
普遍 能潜进伏入性活病体原植菌物和组菌织根内菌，等 认可 并也不应引包起涵明在显内组生织菌变化
的真范菌畴或之细内菌
生活史的 一定阶段或 全部阶段
生活于植物组织 的细胞间隙 或细胞内
植物内生细菌 Endophytic bacteria
不引起寄主组织 结构的明显改变
有一定的 寄主范围
促生作用
生物固氮作用
外源基因载体
防病作用 focus
植物内生细菌的 生物学作用
污染生物治理
组培污染
病理学作用
生长抑制作用
植物内生细菌的防病作用
关于内生细菌的研究主要是集中在内生细菌的 有益生物学作用，及内生细菌与寄主植物互作 的生态学研究
植物内生细菌由于其与寄主植物具良好的亲合 能力，可系统的分布于植物细胞间隙或细胞内， 有足够的营养物质，并受到植物组织的保护， 可避免外部恶劣环境的影响，相对于植物附生 细菌更易发挥生防作用
用荧光显徽镜、激光共聚焦扫描显微镜、流式细胞 仪、荧光分光光度计等仪器可以对标记的目标菌进 行实时、原位的监侧或定量计算其荧光强度
植物内生细菌的生物学作用
植物内生细菌的生物学作用
早期主要把内生细菌当作一种污染和潜在病原 菌看待；近年来的研究证明内生细菌可以促进 作物生长，减轻植物病害症状，甚至认为无菌 苗的抗逆性较弱部分原因是缺乏内生微生物
大部分是中性的， 通常情况下不 导致植物病害
植物内生细菌的研究简史
20世纪30年代以前：争论期
1926年Perotti等在许多健康植物的根组织内发现 了细菌，但被认为是污染所至
20世纪50~60年代：定论期
Tervet(1948)和Hollis(1949,1951)从马铃薯、胡萝 卜、萝卜、红甜菜、甘薯、番茄和球茎甘蓝贮藏器官 等分离获得内生细菌，并进行了分类鉴定
内生细菌定殖在植物特定的区域同菌株和种的特 异性有关，选择定居点的原则一是没有其它内生 细菌的干扰，二是能满足自己的营养需要
有的研究者认为，内生细菌一旦进入植物体内就 寻找适于自己生存的植物组织定殖下来，而不是 在整个植物体内的各种组织间到处扩散
也有的研究者认为，内生细菌进入植物后定殖于 特定植物组织如根皮层，可以穿过植物皮层进入 木质部导管中，随着植物的生长可以将内生细菌 运送到植物上部营养器官或繁殖器官中
Kleopper 1992
与“E表nd生op菌hy（teE”p一ip词hy最te早） 用来相特区指别那，些首不先引提起出症了状、
种子内携生带菌的的内概生念真菌
能够定殖在植物 细突胞出间强隙调或了细内胞生内菌，与 寄并主与植寄物主的植共物生建关立系， 包涵和根谐瘤联菌合和关菌系根的菌等
一类微生物
Wilon 1995
内生细菌不仅将植物作为其栖息场所，而且对 寄主植物广泛有益的生物学作用
普遍认为，内生细菌是植物病害生物防治的天 然资源菌
植物内生细菌具有广阔的理论研究价值和开发 应用前景，已成为植物学、微生物学、植物保 护学及植物育种学等多学科的研究热点
植物内生细菌的概念
De Bary 1866
植物内生菌 Endophyte
取样称量
表面消毒
植物内生细菌 的分离流程
不同培养基、 不同消毒方式、 不同寄主品种 等对内生细菌 的种群数量均 有较大的影响
纯化、保存
剪碎、研磨 梯度稀释 平板涂布 培养、计数
植物内生细菌的鉴定
常规鉴定：形态特征、培养特性、生理 生化特征等
分子生物学鉴定：16SrRNA碱基测序、 G+C百分比、DNA同源性杂交、原位PCR 与16SrRNA多态性分析
菌的拮抗作用显著高于其内层的内生细菌，从外皮 层到块茎中心，其内生细菌的拮抗作用逐渐下降
国内植病生防菌的研究
夏正俊等（1996）从棉花组织内分离到294株细菌，
6.8%的菌株对棉花黄萎病菌（Verticillium dahliae）有较强的拮抗作用，其中73a菌株对病害
表现出67.21%诱导抗性作用
内生细菌是由根向茎部传播的，内生细菌的种群密 度在根部最高、茎部较低，并向顶部减少
一般情况下，非致病的植物内生细菌种群数量比发 病植物内病菌的数量少
内生细菌接种后，其种群数量表现“由增到减”趋 势，接种前期寄主植物体内细菌数量逐渐上升，达 到最高峰，接种后期有所下，但会保持在一定的水
植物 内生 细菌 定殖 检测 方法
杨海莲等（1999）从水稻越富品种幼苗根内分离到 一株阴沟肠杆菌，其在体外对水稻白叶枯病菌
（Xanthmonas oryzae）、稻瘟病菌（Pyricuiaria oryzae）以及水稻纹枯病菌（Rhizoctonia solani）
并没有拮抗作用，但其发酵液浸种处理或喷洒水稻 叶片处理可以明显提高寄主对这些病害的抗性
Hebbar et al. （1992）报道了洋葱伯克赫尔德氏 菌对玉米的土传病菌串珠镰刀菌（Fusarium moniliforme）有拮抗作用并且有促生作用
Hinton et al. （1995）研究表明，分离自玉米的 阴沟肠杆菌（Enterobacter cloacae）对串珠镰
刀菌等病原菌有明显的拮抗作用，如将其作为种 子保护剂，将会有效的防治玉米病害 Bevivino（1998）发现玉米根部分离的洋葱伯克 赫尔德氏菌培养物进行玉米种子处理，可以降低 病害发生并促进作物生长
102株细菌，其中37%的菌株对水稻病原菌异丝
绵霉（Achlya klebsiana）和刺腐霉（Pythium spinosum）有明显的抑制作用，其中荧光假单胞 菌、托拉氏假单胞菌(P. tolaasii), 维罗纳假单胞 菌(P. veronii)等菌株可减轻50~73%的发病率
国外植病生防菌的研究
假单胞菌属 Pseudomonas 黄单胞菌属 Xanthomonas 木杆菌属
Xyella
植物内生细菌的来源
植物内生细菌的来源很多，而且不同植 物、不同细菌种类，其来源可能不同
有的细菌来自植物体表或根际土壤，暂 时栖息于植物体内
有的细菌进入植物体内后，可长期在植 物体内生存，并可以随种子或无性繁殖 材料在植物各世代之间传播，成为后代 内生细菌的主要来源
植物内生细菌 的研究现状
武夷学院茶学与生物系 辛伟
主要内容
植物内生细菌的概念 植物内生细菌的种类 植物内生细菌的内生定殖 植物内生细菌的生物学作用
前言
植物病害是农业生产中自然灾害之一，每年病 害对农作物产量的损失可达30~40%
植物病害化学农药防治的缺点：
引起病害抗性 杀伤天敌，破坏生态平衡 污染环境 危及人们身体健康
生物防治（biological control）是最具潜力的 植物病害安全有效防治措施
前言
植病生防菌大多数是从土壤或植物根际 土壤微生物中分离筛选的
易受外界条件的影响wenku.baidu.com不易在植物病原 菌生存环境中定殖
严重影响它们的实际防病效果，成功的 事例不多
前言
近年来的研究表明，健康植物体内含有大量的 内生细菌
植物内生细菌的的多样性不仅在于其宿主植物 器官与种类的多样性，也在于细菌本身分类地 位的多样性，一种植物可同时定殖许多不同种 类的内生细菌
已经报道
植物内生细菌的种类
属名 食酸菌属 气单胞菌属 节杆菌属
拉丁学名
属名
拉丁学名
属名
拉丁学名
Acidovorax
放线菌属 Actinomyces 产碱菌属 Alcaligenes
Aeromonas
土壤杆菌属
Agrobacterium
交替单胞菌 属
Alteromonas
Arthrobacter 固氮菌属 Azotobacter 伯克氏菌属 Burkholderia
芽生杆菌属 Blastobacter 芽单胞菌属 Blastomonas 芽孢杆菌属 Bacillus
棒杆菌属 Coryebacterium 肠杆菌属 Enterobacter 根瘤菌属 Rhizobium
内生细菌在植物体内的定殖
内生细菌一般在植物细胞间隙或在植物细 胞壁围成的空间内定殖，由于内生细菌能 合成植物细胞壁水解酶，所以植物细胞壁 不会成为内生细菌进一步侵染扩散的障碍
也有少数内生细菌在细胞内定殖的报道
内生细菌在植物体内的定殖
一般认为，自然植株体内的内生细菌数量在 1×103~1×105 CFU/FW(g)这个变化范围内，但有时 也可达107 CFU/FW(g)
细菌自动鉴定系统：如Biolog细菌自动鉴 定系统
植物内生细菌的内生定殖
内生细菌
组织伤口、 机械伤口、
虫伤等
伤口 自然孔口
气孔、皮孔、 水孔、蜜腺等
植物内生细菌的侵入途径
内生细菌在植物体内的定殖
内生细菌在植物组织中的存在方式，可分 为四种：依赖性、忍耐性、专一性和定位， 不同的植物中内生细菌的存在方式不同
抗生素标记法 免疫学方法 基因标记法
通过诱变筛选出抗高浓度 抗生素的突变体，以此作 利发抗用生体最为用啶抗特去常标的酮原异检用记抗酸与性测进生、相反相行素链应应应回有霉抗，的收利素体用抗检福等测平；、常萘 原，如电镜免疫胶体 金、Western印迹法等
转入外源基因， 表达后可与环境 中其它微生物相 区别，如绿色荧 光蛋白基因（gfp） 标记法
有的内生细菌可以在植物的整个生育期内 生活，而大部分内生细菌只存在于植物的 某生育期内
内生细菌在植物体内的定殖
有些内生细菌可以在多种寄主植物中存 在，而有些只存在于单一的寄主中
不同植物体内内生细菌的多样性有所不 同，不同植物之间内生细菌的种群数量 和消长动态各不相同
内生细菌在植物体内的定殖
20世纪80年代以后：活跃期
以内生细菌对寄主植物的生物学作用最为引人注 目
植物内生细菌的种类
植物内生细菌的多样性
内生细菌存在于单子叶和双子叶植物中，从水 稻、小麦、棉花、柑桔、香蕉、甘蔗、马铃薯、 甘蓝等农作物、果树、蔬菜中均可分离到内生 细菌
从种子、胚珠、块茎、块根、茎、叶及果肉等 几乎所有的植物组织都可以分离到内生细菌