抗生素类药物质量控制研究的热点问题和新进展

抗生素类药物质量控制研究的热点问题和新进展

抗生素类药物质量控制研究的热点问题和新进展

抗生素类药品是临床中最常用的药品之一，在治疗感染性疾病方面发挥着极其重要的作用，其质量的优劣直接关系着该类药品在临床上使用的安全和有效。近年来，为保证抗生素类药物安全性和有效性，对其质量有了更高的要求，本文对国内外药典中近年来抗生素类药物质量控制的新进展和热点分析做了一个简单的介绍。

一、抗生素类药物中的高分子杂质检查

抗生素类药物是较易发生不良反应的药物之一，临床中抗菌药物较常见的一类不良反应是药物所致的过敏反应，β—内酰胺类抗生素、氨基糖苷类及喹诺酮类抗菌药均可引发不同类型的过敏反应，但以β—内酰胺类抗生素最为严重。多年的研究证明，β－内酰胺类抗生素的过敏反应并非药物本身所致，而是与药物中所含的微量高分子杂质有关。我国科研人员经过深入研究，已从头孢噻肟、头孢哌酮、头孢曲松、头孢他啶等四种第三代头孢菌素中分离收集到了能引发动物过敏反应的基本无抗菌活性的高聚物，利用动物口服主动过敏反应模型，确证了引发青霉素V钾、阿莫西林等口服青霉素过敏反应的主要过敏原是它们的高分子聚合物，胃肠道吸收并不改变其过敏性，而头孢菌素和青霉素本身并不引发过敏反应。由此证实，β—内酰胺类抗生素过敏反应与产品质量有关。

(一)高分子杂质的特性

高分子杂质是药品中分子量大于药物本身的杂质的总称，其分子量一般在1000～5000道尔顿，个别可至约10000道尔顿。引起过敏反应的高分子杂质有外源性和内源性两种，外源性过敏原主要来自β-内酰胺类抗生素在生物合成中引入的蛋白多肽类和青霉噻唑蛋白。内源性过敏原为β-内酰胺环开环自身聚合，生成具有致敏性的高分子聚合物，聚合物既可来自生产过程，又可在贮存过程中形成，甚至在用药时由于使用不当而产生，如阿莫西林干糖浆，当用开水冲服时，高分子杂质可增加100倍。随着现代生产工艺的不断改进和提高，目前产品中的

外源性杂质日趋减少，因此对内源性杂质聚合物的控制是当前抗生素类药物高分子杂质的重点。高分子杂质的基本特性可概括为如下几个方面。

1.高分子杂质具有高度的不均一性和不确定性。

β-内酰胺类抗生素发酵中产生的任何蛋白碎片均可带入产品中，相同的蛋白或蛋白碎片上可以结合不同数目的药物分子，形成青霉噻唑多肽类杂质。其结构如图1所示。

另外，青霉素、头孢菌素不仅能形成聚合度不同的聚合物，许多样品还能同时发生不同机制的聚合反应。如氨苄西林、阿莫西林、头孢噻肟钠等侧链具有活性氨基的抗菌药，可同

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时发生仅与侧链有关的聚合反应和仅与母核有关的聚合反应(图2)，进而形成不同结构的聚合物。

形成的聚合物结构很不稳定，可发生不同程度的降解作用，如末端β-内酰胺键的水解(图3)，使得聚合物结构更为复杂。

对于有不同异构体存在的样品，同聚和异聚反应可同时发生。如羧苄西林，有L和D型两种异构体，二聚体中发现有L－L、D－D、L－D三种聚合物(图4)。

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2.高分子杂质的种类、数量与生产工艺密切相关。

如氨苄西林溶媒结晶工艺与喷雾干燥工艺所得样品中的高分子杂质在引发豚鼠被动皮肤过敏（passive cutaneous anaphylaxis， PCA）反应时具有不同的特异性，两者的二聚物的含量也明显不同。

3.聚合物均可以引发过敏反应，且聚合物的聚合度越高，引发过敏反应的能力越强。动物实验已经证明，用各类β-内酰胺类药物蛋白结合物免疫动物，再用相应的聚合物作为多价半抗原进行攻击，均可引发速发型过敏反应：如青霉素类抗菌药中的青霉素G钠(钾)、青霉素 V钾、氨苄西林钠、阿莫西林、氟氯西林等；头孢菌素类的头孢噻肟钠、头孢曲松钠、头孢哌酮钠和头孢他定等；酶抑制剂舒巴坦钠、克拉维酸钾。

过敏反应的能力与聚合物的聚合度是成正比的，以氨苄西林聚合物为例，其聚合反应如图5所示，利用离子交换色谱从氨苄西林钠溶液中分别分离出二聚、三聚、四聚和五聚体；再利用速发型过敏反应的动物模型－豚鼠 PCA模型证明，五聚体引发过敏反应的能力最强，二聚体最弱；即聚合度越高，引发过敏反应的能力越强。

4.口服青霉素类聚合物仍可以引发过敏反应。

口服给药途径是否可以避免过敏反应的发生呢? 这主要由聚合物是否可经胃肠道被吸收，且经胃肠道吸收后聚合物的致敏性是否发生改变所决定。有研究对临床中常用的口服青霉素制剂，青霉素V钾片、阿莫西林/克拉维酸钾片、氟氯西林胶囊及舒它西林片，利用建立的豚鼠口服主动过敏反应模型，对各类聚合物在口服给药过程中是否仍可引发过敏反应进行了评价。HPLC分析表明，口服青霉素 V聚合物，45 min时豚鼠血清中可见聚合物。说明聚合物可以经胃肠道被吸收。豚鼠口服主动过敏反应结果表明，各类聚合物经胃肠道吸收后仍可引发过敏反应。和静脉给药相比较，口服给药动物通常在给药后30～60min发生反应，而静脉给药动物通常在给药后的10min左右发生反应；对由阿莫西林/克拉维酸制剂致敏的动物，阿莫西林聚合物较克拉维酸聚合物具有更强的引发过敏反应的能力。

(二)高分子杂质的控制

近几十年来国内外对β－内酰胺抗生素中高分子聚合物的分离分析研究报道有许多，如

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用离子交换色谱法分离氨苄西林中的聚合物，用HPLC法分析氨苄西林中的聚合物、青霉素中的聚合物；用凝胶色谱法分离氨苄西林、青霉素中的聚合物；用凝胶分离—化学检测法分析青霉素中的致敏性高分子杂质，即传统的P值法；用免疫学反应检测氨苄西林中致敏性杂质的反相间接血凝法。近年来又有利用毛细管电泳技术分析头孢菌素中聚合物的报道。但除了氨苄西林中聚合物的HPLC分析方法外，上述的分离、分析方法因操作繁琐、实验误差大等原因，均不能满足药品质量控制的需要。USPXXII中首次采用凝胶色谱法控制头孢他定中高聚物的含量，但由于高聚物标准品不能满足需要，该方法后来被取消。概括上述分离分析手段，色谱法是主要的分离分析方法，分离模式主要有三类：凝胶过滤色谱法、离子交换色谱法和反相色谱法。由于结构不同的高分子杂质通常具有相似的生物学特性，因此在药品质量控制中一般只需控制药品中高分子杂质的总量而不必控制不同结构的杂质，因此根据样品分子量差异进行分离的凝胶色谱法具有明显的优势，这也是目前在中国药典中控制抗生素类高分子聚合物的主要方法。我国根据β－内酰胺类抗生素在不同离子强度的介质中具有不同表现状态的性质，在国际上首次建立了凝胶色谱自身对照外标法定量测定β－内酰胺类抗生素中高聚物的检测方法。该方法已被国内外β－内酰胺类抗生素生产厂家广泛使用。

1.凝胶色谱分离高分子杂质的原理和基本方法

凝胶色谱法也叫分子排阻色谱法，是根据分子大小进行分离的一种液相色谱技术，药物分子进入凝胶孔径内部，而高分子杂质则被排阻在外，在色谱过程中不被保留，最早被洗脱出来，保留时间较短，而药物被保留，保留时间较长。凝胶色谱的保留时间与分子大小成反比。传统的凝胶色谱分离效能较低，为克服这一缺点，人们发展了一个以葡聚糖凝胶Sephadex G-10为基础的凝胶色谱分析系统。在Sephadex G-10凝胶（排阻分子量在1000左右）色谱系统中，理论上β-内酰胺类抗生素三聚体以上的高分子杂质均集中在Kav（有效分配系数）＝0的色谱峰中，调节色谱条件，可使β-内酰胺类抗生素的寡聚物（如二聚物等）和其他高分子杂质分离，也可使二者合一，因此可用于不同的分析目的。在凝胶色谱模式分离分析高聚物中流动相体系一般为含有盐的水溶液，流动相中可加入适量有机溶剂，但一般不应超过30%，流速不宜过快，一般为0.5%～1.0ml/min。检测方法一般使用紫外检测。