β—胡萝卜素和番茄红素提取分离与测定

β—胡萝卜素和番茄红素提取分离与测定

一、实验目的

1、学习从天然产物中提取有机化合物的方法。

2、学习用薄层层析法检验有机化合物的基本原理，点样，展开和计算Rf值的方法。

二．仪器和试剂

仪器三角瓶（50ml）、分液漏斗（150ml）、蒸馏瓶（50ml）、普通蒸馏装置（或减压蒸馏装置）、漏斗、色谱柱、硅胶薄层板、量筒、烧杯、层析缸。试剂胡萝卜、丙酮、石油醚（bp30~60℃）、硅胶（层析用，200~300 目）、无水硫酸钠、石油醚（bp60~90℃）、丙酮：石油醚（1：9）（V/V）。

三．实验方案

1、含类胡萝卜素石油醚溶液的制备

将新鲜胡萝卜洗净、擦干,切去尾部，切碎。称取碎鲜胡萝卜【1】10g 于小研钵中,研碎。碎胡萝卜移至50mL 三角烧瓶中，每次用丙酮10mL 萃取2 次，再用石油醚（bp30~60℃）萃取固体两次，每次10mL。把石油醚溶液加到丙酮液中。在分液漏斗中将混合液与50mL饱和氯化钠溶液【2】振荡，分去下层，用蒸馏水洗涤上层液两次，每次50mL，分去水，用无水硫酸钠干燥石油醚液（约1h）,把混合液倒入50mL 圆底烧瓶中，热水浴加热蒸馏，除去溶剂，得固体。在制得的固体物加入3mL 石油醚（bp60~90℃）拌硅胶1g，在通风橱内抽干，得黄色硅胶颗粒，待上柱。

2、装柱和分离

取20cm*1cm 色谱柱一根，垂直装置，以50ml 三角烧瓶作洗脱液的接受器。用镊子取少许脱脂棉【3】放于干净的色谱柱底部，轻轻塞紧，再在脱脂绵上盖一层厚0.5cm 的海石砂（或用一张比柱内径略小的滤纸代替），关闭活塞，向柱内倒入石油醚（bp60－90℃）至约为柱高的3／4 处，打开活塞，控制流出速度为1 滴/s。通过一干燥的玻璃漏斗慢慢加入层析硅胶。用洗耳球轻轻敲打柱身，使填装紧密。当装填到3/4 时，再在上面加一层0.5cm 厚的海石砂，操作时一直保持上述流速，注意不能使液面低于砂子的上层。当液面流至离海石砂面1cm 时，立即从玻璃漏斗加入已制备好的含胡萝卜素的黄色硅胶，随后用0.5ml 石油醚洗下管壁的硅胶，如此连续2—3 次，直至洗净为止，然后在色谱柱上装上滴液漏斗，用石油醚（bp60－90℃）作洗脱剂进行洗脱，洗1 滴/s。当有一黄色的谱带分出，待黄色组分绝大部分洗出时，把洗脱剂换成1：9 丙酮一石油醚（bp60－90℃）混液作洗脱剂进行洗脱，控制流出速度如前（这混液洗脱剂有助于混合物中极性较大的组分移动），又可分出两个黄色组分。在45—90min 内，柱中物料将全部洗脱出来。观察这些物料通过柱子的移动情况。在三角烧瓶中收集3 份洗出液。用纸色谱、薄层色谱对各段洗出液进行色谱分析。

3.薄层色谱法

样品：柱色谱法中洗脱出的份样品液

展开剂：1：9 丙酮一石油醚溶液

薄层板的制备：取3 片载波体，洗净，晾干。

在50ml 烧杯中放置3g 硅胶G，逐渐加入0.5%cmC 水溶液8ml，调成均匀的糊状，将此糊状物倾于上述洁净的载玻片圣桑，用手将带浆的载玻片在水平的桌面上做上下轻微的颤动，并不时转动方向，制成厚薄均匀，表面光洁的平整的薄层板，然后放在水平桌面上，在室温放置晾干后放入烘箱中，缓慢升温至110℃，恒温0.5h，取出，稍冷后置干燥器中备用。

点样：取出上述制好的薄层板，分别在距一端点1cm 处用铅笔轻轻划一横线作为起始线。用毛细管吸取少量样品液，在一块板的起点线上点第一个色带的样品液，根据柱色谱分离的色带，依次点样，如果样点颜色较浅，可重复点样，重复点样前必须待前次样点挥干后进行。样点直径不超过2mm。

展开：待样点干燥后，小心地放入已加入展开剂的250ml 广口瓶中进行展开。在瓶的内壁贴一张高5cm，环绕周长4/5 的滤纸，下面浸入展开剂中，以使容器内被展开剂蒸气饱和。点样一端浸入展开剂0.5cm（样点不浸泡在展开剂中）。盖好瓶塞，观察展开剂前沿上升离板的上端1cm 处取出，尽快用铅笔在展开剂上升的前沿处划一记号，晾干后，量出展开剂和样点移动的距离，计算Rf 值。

四、注意事项

1，本实验采取的工艺不同于其他工艺，体现在原料粉碎时加入了稳定剂（5ml 氨水和35ml 乙醇）来防止β－胡萝卜素被氧化，由此可提高提取率。

2、色谱柱填装紧密与否，对分离效果很有影响。若柱中留有气泡或各部分松紧不匀（更不能有断层或暗沟）时，会影响渗滤速度和显色的均匀。但如果填装时过分敲击，又会因太紧密而流速太慢。

3、加入砂子的目的是。在加料是不致把吸附剂冲起，影响分离效果。

4、为了保持色谱柱的均一性，使整个吸附剂浸泡在溶液或溶液中是必要的。否则当柱中溶液流干时。柱身干裂，影响渗滤和显色的均一性。

5、若不用滴液漏斗，也可用每次倒入10ml 洗脱剂的方法进行洗脱

6、载玻片上涂层要均匀，既不应有纹路、带团粒，也不应有能看到玻璃的薄涂料点。

7、点样用的毛细管必须专用，不得弄混。

8、点样时，使毛细管液面刚好接触到薄层（滤纸）既可，均匀点样过重而使薄层破坏。

从番茄中提取番茄红素和β－胡萝卜素

1．目的要求

掌握色素提取方法、柱层析分离方法及薄层色谱初步定性方法。了解β－胡萝卜素与番茄红素性质的差别。

2．方法原理

番茄中含有番茄红素和少量的β－胡萝卜素，二者均属于类胡萝卜素。类胡萝卜素为多烯类色素，不溶于水而溶于脂溶性有机溶剂。本实验先用乙醇将番茄中的水脱去，再用二氯甲烷萃取类胡萝卜素。因为二氯甲烷与水不混溶，故只有除去水分后才能有效地从组织中萃取出类胡萝卜素。根据番茄红素与β－胡萝卜素极性的差别，用柱层析可以将它们分离。分离效果可以用薄层层析进行检验。

3．主要实验仪器及材料

新鲜番茄（或番茄酱）。95％乙醇，二氯甲烷，石油醚（60℃～90℃），氯仿，中性或酸性氧化铝（柱层析用），环己烷，硅胶G，饱和氯化钠溶液，无水硫酸钠。

4．掌握要点

层析柱装填与操作方法，薄层点样与展开方法。

5．实验内容

1）原料处理与色素提取

称取新鲜番茄浆20 g于100 mL圆底烧瓶中，加95％乙醇40 mL，摇匀，装上回流冷凝管，在水浴上加热回流5min，趁热稠滤，只将溶液倾出，残渣留在瓶内，加入30 mL二氯甲烷，水浴上加热回流5 min，冷却，将上层溶液倾出抽滤，固体仍保留在烧瓶内，再加10 mL二氯甲烷重复萃取一次。合并乙醇和2次二氯甲烷提取液，倒入分液漏斗中，加5 mL饱和氯化钠溶液（有利分层），振摇，静止分层。分出橙黄色有机相，使其流经一个在颈部塞有疏松棉花且在棉花上铺一层1 cm厚的无水硫酸钠的三角漏斗，以除去微量水分。将此溶液贮存于干燥的有塞子的锥形瓶中。层析之前，将此溶液在通风橱中用热水浴蒸发至干。