基因转染
细胞转染实验实验报告
细胞转染是基因工程、分子生物学研究等领域中常用的一种技术，用于将外源基因或RNA导入细胞内，研究基因表达、基因调控等功能。
本实验旨在利用脂质体介导的方法将目的基因转染入HEK293细胞，并观察转染效率及目的基因的表达情况。
二、实验材料1. 细胞：HEK293细胞2. 载体：pEGFP-C1（绿色荧光蛋白基因）3. 试剂：胎牛血清、DMEM培养基、转染试剂（如Lipofectamine 3000）、Trizol 试剂、PCR试剂盒、DNA marker等三、实验方法1. 细胞培养：将HEK293细胞接种于6孔板，培养于含10%胎牛血清的DMEM培养基中，置于37℃、5%CO2的培养箱中培养至对数生长期。
2. 转染：按照Lipofectamine 3000说明书进行操作，将pEGFP-C1质粒与转染试剂混合，室温孵育5分钟，然后加入细胞培养液中，将细胞培养板放入培养箱中继续培养。
3. 检测转染效率：转染后24小时，观察细胞绿色荧光表达情况，以判断转染效率。
4. RT-PCR检测目的基因表达：收集转染后的细胞，使用Trizol试剂提取细胞总RNA，进行RT-PCR扩增目的基因，以判断目的基因的表达情况。
5. Western blot检测目的蛋白表达：收集转染后的细胞，提取细胞总蛋白，进行SDS-PAGE电泳，转膜，加入一抗和二抗，进行Western blot检测目的蛋白表达。
四、实验结果1. 转染效率：转染后24小时，显微镜下观察细胞绿色荧光表达情况，结果显示大部分细胞呈现出绿色荧光，说明转染效率较高。
2. RT-PCR结果：RT-PCR扩增目的基因，结果显示目的基因扩增条带清晰，说明目的基因已成功转染入细胞。
3. Western blot结果：Western blot检测目的蛋白表达，结果显示目的蛋白条带清晰，说明目的蛋白已成功表达。
1. 脂质体介导的转染方法具有操作简单、转染效率高、安全性好等优点，适用于多种细胞类型的转染。
阳离子脂质体基因转染
阳离子脂质体基因转染脂质体（lipofectinregeant，LR）试剂是阳离子脂质体N-[1-2，3-Dioleyoxy，Propyl]-n，n，n-Trimethylammonium Chloride（DOTMA）和Dioleoylphotidye-thanolamine（DOPE）的混合物[1：1（w/w）]。
它适用于把DNA转染入悬浮或贴壁培养细胞中，是目前条件下最方便的转染方法之一。
转染率高，优于磷酸钙法，比它高5~100倍，能把DNA和RNA转染到各种细胞。
用LR进行转染时，首先需优化转染条件，应找出该批LR对转染某一特定细胞适合的用量、作用时间等，对每批LR都要做：第一，先要固定一个DNA的量和DNA/LR混合物与细胞相互作用的时间，DNA可从1~5μg和孵育时间6小时开始，按这两个参数绘出相应LR需用量的曲线，再选用LR和DNA两者最佳的剂量，确定出转染时间（2~24小时）。
因LR对细胞有一定的毒性，转染时间以不超过24小时为宜。
细胞种类：COS-7、BHK、NIH3T3、Hela和Jurkat等任何一种细胞均可作为受体细胞。
1、操作步骤[方法一]：（1）细胞培养：取6孔培养板（或用35mm培养皿），向每孔中加入2mL含1~2×105个细胞培养液，37℃CO2培养至40%~60%汇合时（汇合过分，转染后不利筛选细胞）。
（2）转染液制备：在聚苯乙稀管中制备以下两液（为转染每一个孔细胞所用的量）A液：用不含血清培养基稀释1-10μg DNA，终量100μL，B液：用不含血清培养基稀释2-50μgLR，终量100μL，轻轻混合A、B液，室温中置10-15分钟，稍后会出现微浊现象，但并不妨碍转染（如出现沉淀可能因LR或DNA浓度过高所致，应酌情减量）。
（3）转染准备：用2mL不含血清培养液漂洗两次，再加入1mL不含血清培养液。
（4）转染：把A/B复合物缓缓加入培养液中，摇匀，37℃温箱置6~24小时，吸除无血清转染液，换入正常培养液继续培养。
瞬时转染实验步骤
瞬时转染实验步骤全文共四篇示例，供读者参考第一篇示例：瞬时转染实验是一种常用的基因转染技术，可用于将外源DNA或RNA导入到目标细胞中，以研究基因表达和功能。
本文将介绍瞬时转染实验的步骤及注意事项。
一、实验前准备1.1 制备转染试剂：根据所需的转染试剂种类，准备相应的试剂。
常用的转染试剂包括有机溶剂转染试剂（如Lipofectamine 2000）、阳离子聚合物转染试剂（如Polyethylenimine，简称PEI）等。
1.2 制备转染质粒：准备含有目标基因的转染质粒。
转染质粒应进行质粒提取、纯化并测序确认。
1.3 培养细胞：细胞应在培养皿中充分培养至70%～90%的浓度，以保证转染效率。
1.4 预热培养基：将足够的培养基提前预热至37℃，以用于细胞培养和转染。
二、转染操作步骤2.1 向细胞培养皿中加入转染试剂：按照转染试剂的使用说明书，向培养皿中加入适量的转染试剂，并在无血清培养基中混合均匀。
2.2 加入转染质粒：将准备好的转染质粒溶液滴加入培养皿中，注意避免空气泡。
2.3 孵育细胞：将培养皿放置在37℃的培养箱中孵育一定时间，通常为4～6小时。
2.4 更换培养基：在转染后适当时间内更换含有血清的培养基，以保证细胞正常生长。
2.5 收获样品：根据实验设计和研究目的，选择合适的时间点收获转染后的细胞样品。
三、注意事项3.1 转染试剂浓度：转染试剂的浓度应根据实验目的和细胞类型进行优化，以达到最佳的转染效果。
3.2 转染时间和转染效率：转染时间过长或过短都可能影响转染效果，应根据实际情况进行调整。
3.3 质粒浓度和纯度：转染质粒应具有足够的纯度和浓度，以确保转染效果。
3.4 细胞密度和状态：细胞应在良好的状态下进行转染，过高或过低的细胞密度都会影响转染效果。
3.5 实验控制组：应设置适当的对照组，以进行比较和验证实验结果的可靠性。
总结：瞬时转染实验是一种常用的基因转染技术，通过适当的实验操作步骤和注意事项，可获得可靠的实验结果。
转化和转染
转染和转化的区别转染的定义是“将具生物功能的核酸转移或运送到细胞内并使核酸在细胞内维持其生物功能”。
其中，核酸包括DNA（质粒和线性双链DNA），反义寡核苷酸及RNAi（RNA interference）。
基因转染技术已广泛应用于基因组功能研究（基因表达调控，基因功能，信号转导和药物筛选研究）和基因治疗研究。
基因转染需要一定的转染试剂将带有目的基因的载体运送到细胞内。
早期的磷酸钙转染法转染效率很低，且对很多细胞株无效，因此不能满足很多科研工作的需要。
目前，最常用的转染试剂是阳离子脂质体和阳离子聚合物，它们在克服细胞屏障方面跟病毒有很相象的特征，容易透过细胞膜。
其中，阳离子脂质体在体外基因转染中有很高的效率，然而在体内，它迅速被血清清除，在肺组织内累积，诱发强烈的抗炎反应，这将导致高水平的毒性，因此，在很大程度上限制了其应用。
由于阳离子脂质体的局限性，阳离子聚合物转染试剂日益受到重视。
转化特指将质粒DNA或以其为载体构建的重组DNA导入细菌体内，使之获得新的遗传特性的一种方法。
它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术之一。
受体细胞经过一些特殊方法（如：电击法，CaCl2等化学试剂法）处理后，使细胞膜的通透性发生变化，成为能容许外源DNA分子通过的感受态细胞。
进入细胞的DNA分子通过复制、表达实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。
由外来DNA引起生物体遗传性状改变的过程称为转化(transformation)。
噬菌体常常可感染细菌并将其DNA注入细菌体内，也可引起细菌遗传性状的改变。
通过感染方式将外来DNA 引入宿主细胞，并导致宿主细胞遗传性状改变的过程称为转染(transfection)。
转染是转化的一种特殊形式。
基因工程:有目的的通过分子克隆技术，人为的操作改造基因，改变生物遗传性状的系列过程。
载体:能在连接酶的作用下和外源DNA片段连接并运送DNA分子进入受体细胞的DNA分子。
转化和转染的概念和区别
转染和转化的区别转染的定义是“将具生物功能的核酸转移或运送到细胞内并使核酸在细胞内维持其生物功能”。
其中，核酸包括DNA（质粒和线性双链DNA），反义寡核苷酸及RNAi（RNA interference）。
基因转染技术已广泛应用于基因组功能研究（基因表达调控，基因功能，信号转导和药物筛选研究）和基因治疗研究。
基因转染需要一定的转染试剂将带有目的基因的载体运送到细胞内。
早期的磷酸钙转染法转染效率很低，且对很多细胞株无效，因此不能满足很多科研工作的需要。
目前，最常用的转染试剂是阳离子脂质体和阳离子聚合物，它们在克服细胞屏障方面跟病毒有很相象的特征，容易透过细胞膜。
其中，阳离子脂质体在体外基因转染中有很高的效率，然而在体内，它迅速被血清清除，在肺组织内累积，诱发强烈的抗炎反应，这将导致高水平的毒性，因此，在很大程度上限制了其应用。
由于阳离子脂质体的局限性，阳离子聚合物转染试剂日益受到重视。
转化特指将质粒DNA或以其为载体构建的重组D NA导入细菌体内，使之获得新的遗传特性的一种方法。
它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术之一。
受体细胞经过一些特殊方法（如：电击法，CaCl2等化学试剂法）处理后，使细胞膜的通透性发生变化，成为能容许外源DNA分子通过的感受态细胞。
进入细胞的D NA分子通过复制、表达实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。
由外来DNA引起生物体遗传性状改变的过程称为转化(transfo rmati on)。
噬菌体常常可感染细菌并将其DNA注入细菌体内，也可引起细菌遗传性状的改变。
通过感染方式将外来DNA引入宿主细胞，并导致宿主细胞遗传性状改变的过程称为转染(transfectio n)。
细胞分子生物学研究中常用的技术和方法
细胞分子生物学研究中常用的技术和方法细胞分子生物学是指研究细胞内发生的生物分子互作及其调控的学科。
随着生命科学技术的不断发展和完善，许多技术和方法得以应用于细胞分子生物学的研究中。
本文将从多个方面介绍细胞分子生物学研究中常用的技术和方法。
一、基因克隆技术基因克隆技术是一种常用的细胞分子生物学研究方法。
它可以通过将感兴趣的DNA序列插入载体DNA上，构建含有特定目的基因的重组DNA，最终将重组DNA引入宿主细胞中来研究某一基因的生物学功能。
基因克隆技术的核心是重组DNA技术，其中最常用的重组DNA方法包括限制性内切酶切割、DNA连接、转化及放大等步骤。
特别是在近年来的分子克隆技术中，基因编辑技术的应用使得基因克隆技术更加得到精细化和精确化。
二、蛋白质结构分析技术蛋白质是生物体中极其重要的分子之一，其结构对蛋白质的生物学功能有着至关重要的作用。
蛋白质的功能在很大程度上取决于其三维结构，因此蛋白质结构的研究是细胞分子生物学的重要研究领域。
蛋白质结构分析技术包括X射线晶体学、核磁共振、电子显微镜等。
其中，X射线晶体学是目前分析蛋白质最为常用的方法之一，其原理是利用X射线的衍射来确认蛋白质的三维结构。
三、荧光素酶标记技术酶标记技术是研究酶在细胞中的分布和功能的重要方法，其中荧光素酶标记技术则成为近年来应用最广泛的方法之一。
荧光素酶由日本学者O. Shimomura于1962年首次发现，可以发出明亮的荧光，被广泛应用于生物学研究中。
目前，荧光素酶标记技术被用来研究蛋白质的定位和运动等生物学过程，其原理是将荧光素酶标记的免疫球蛋白等物质与荧光素底物结合，从而通过荧光显微镜来研究生物分子的动态变化。
四、蛋白质互作筛选技术蛋白质在细胞中的互作是细胞分子生物学研究的重要问题之一。
蛋白质互作筛选技术则可以用来鉴定蛋白质之间的相互作用关系。
目前常见的蛋白质互作筛选技术包括酵母双杂交法、共免疫共沉淀、荧光共聚焦显微镜等。
外源基因获得方法
外源基因获得方法
外源基因获得方法指的是将生物体的外源基因导入到另一个生物体中的方法。
以下列举了常见的外源基因获得方法：
1. 转染法（Transfection）：将外源基因通过转染试剂或者电击等方式导入到细胞中。
常用于体外培养细胞。
2. 病毒载体介导转导法（Viral Vector-mediated Transduction）：利用病毒载体作为基因导入的工具，将外源基因导入到目标细胞中。
常用的病毒载体包括腺病毒、腺相关病毒和慢病毒等。
3. 转座子介导转导法（Transposon-mediated Transduction）：利用转座子（Transposon）作为基因导入的工具，将外源基因导入目标细胞中。
常用的转座子有睡莲转座子和福寿螺转座子等。
4. 细胞融合法（Cell Fusion）：通过将外源基因带有的细胞与目标细胞进行融合，使外源基因导入目标细胞中。
5. 离子注射法（Ion Injection）：利用高压来注射外源基因到目标细胞中。
6. 基因枪法（Gene Gun）：将外源基因包裹在微小金属粒子上，通过高压气流射击到目标细胞中。
7. 微注射法（Microinjection）：利用显微镜下的微细玻璃针将外源基因直接注射到目标细胞中。
8. 基因编辑技术（Gene Editing）：利用CRISPR-Cas9等基因编辑技术，直接在细胞内实现外源基因的导入和定点修饰。
需要注意的是，外源基因获得方法的选择取决于研究目的、细胞类型和研究限制等因素。
不同方法具有各自的优缺点和适用范围，研究人员需要根据具体情况选择合适的方法。
接合、转化、转染、转导、感染相关的概念
在真核生物中，与原核生物的转化完全相同的过程被称为：
3、Transfection 中文翻译为“转染”
The introduction of DNA into mammalian cells is called transfection. Eukaryotic microorganisms and animal and plant cells can take up DNA in a process that resembles bacterial transformation. Because the word transformation in mammalian cells is used to describe the conversion of cells to the malignant (tumorous, cancerous) state, the introduction of DNA into mammalian cells has been called transfection. Brock p998
又分为普遍转导（ generalized transduction）通过完全缺陷噬菌体对供体菌任何DNA小片段的“误包”而实现其遗传性状传递至受体菌的转导现象；局限转导（restricted transduction ）通过部分缺陷的温和噬菌体把供体菌的少数特定基因携带到受体菌中，并获得表达的转导现象。
接合、转化、转染、转导、感染等等几个与基因（主要是 DNA ）转移相关的概念
1、Conjugation 中文翻译为“结合”
Conjugation is the mechanism by which genetic material is transferred between two bacterial cells by plasmids. A cell containing a conjugative plasmid(F+,fertility+)forms a mating pair with a cell that does not contain a conjugative-plasmid(F-)by means of an F-pilus on the surface of the cell.The pilus contracts,pulling the two cells into contact, and the conjugative plasmids(typified by the F plasmid of E.coli ) is transferred from the plasmid-containing cell, the donor, to the recipient(in some cases,pieces of chromosomal DNA is also transfered to the recipient). The tra genes, carried on the F plasmid, contain all the information for the conjugative process.
基因转染的名词解释
基因转染的名词解释基因转染是一种生物学技术，用于将外源基因导入到目标细胞中。
该技术广泛应用于生命科学研究和生物医学领域，为我们深入了解基因功能、疾病治疗和农作物改良等方面提供了重要手段。
本文将对基因转染的定义、方法和应用进行解释和探讨。
一、基因转染的定义基因转染是一种将外源DNA序列导入目标细胞并使其表达的过程。
通常情况下，外源DNA序列被插入到可导入细胞的载体中，通过各种转染方法引入目标细胞。
基因转染技术的核心在于导入外源DNA，使其能够被目标细胞识别、复制和表达。
二、基因转染的方法1. 瞬时转染瞬时转染是一种转染效果较短暂的方法，适用于对细胞的短期基因表达研究。
常用的瞬时转染方法包括离子穿孔、脂质体介导转染和电穿孔等。
这些方法通过短暂地破坏细胞膜，使外源DNA能够进入细胞，并在一段时间内进行表达。
2. 稳定转染稳定转染是指外源基因在细胞中得以稳定表达的转染方法。
这种方法通常采用载体的长期表达构建，如质粒或病毒载体，使外源基因在细胞的染色体中稳定地整合并表达。
稳定转染方法包括病毒介导转染和基因枪等。
三、基因转染的应用1. 基因功能研究基因转染技术广泛应用于基因功能研究，帮助科学家理解基因在生物体中的作用机制。
通过将特定基因导入目标细胞，并观察其表达是否导致特定现象的改变，可以揭示基因的功能和相互作用。
2. 疾病治疗基因转染技术在疾病治疗中具有潜力。
例如，在基因治疗中，病人的细胞可以被转染以表达特定的基因，从而产生受体蛋白、酶或激素等。
这种技术可以用于治疗遗传病、癌症和心血管疾病等。
3. 农作物改良基因转染技术在农作物改良中发挥着重要作用。
通过将外源基因导入农作物的基因组中，可以使作物表达特定的性状，如耐病性、抗虫性和抗旱性等。
这种技术旨在提高农作物的产量和质量，增加农产品的抗病能力。
四、基因转染的挑战与争议尽管基因转染技术在科学研究和应用中具有巨大潜力，但也面临一些挑战和争议。
其中之一是生物伦理问题。
动物转基因的方法
动物转基因的方法
动物转基因是一种将外源基因导入到动物体内，使其产生新的表型或性状的技术。
主要有以下几种方法：
1. 质粒转染法：将外源基因克隆到质粒中，然后通过电穿孔、化学转染等方法将质粒导入到动物细胞内，使外源基因被表达。
2. 病毒载体法：将外源基因植入到病毒基因组中，通过病毒感染动物细胞，将外源基因导入到细胞内。
3. 胚胎干细胞法：将外源基因导入到胚胎干细胞中，使其成为转基因动物的基础。
4. 克隆法：将外源基因直接克隆到转基因动物的基因组中，使其成为转基因动物。
转基因动物技术在医学、农业、生态等领域具有广阔的应用前景，但同时也带来了一定的安全和伦理问题，需要在科学研究和应用中加以控制和规范。
- 1 -。
细胞转染
2.哺乳动物细胞表达载体的选择
哺乳动物细胞表达载体有2大类：质粒型载体和病毒 型载体
（1）质粒型载体
哺乳动物细胞质粒型载体大多数是通过细菌质 粒而获得的，主要是在质粒的基础上插入了一些病 毒或其他一些物种及人的基因表达调控序列。
• 当neo基因被整合进真核细胞基因组合适的 地方后，则能启动neo基因编码的序列转录 为mRNA，从而获得抗性产物氨基糖苷磷 酸转移酶的高效表达，使细胞获得抗性而 能在含有G418的选择性培养基中生长。目 前G418的这一特性已在基因转移，敲除， 抗性筛选以及转基因动物等方面得以广泛 应用。
• 转染是否成功的影响因素很多，如需要转 染的细胞类型（对于困难的细胞系尤其如 此），需要被转染的分子（DNA、RNA、 寡核苷酸、蛋白质），转染试剂等。但无 论在何种情况下，转染的成功均取决于转 染效率、低细胞毒性以及重现性这几个要 素。
• 利用脂质体转染法最重要的就是防止其毒 性，因此脂质体与质粒的比例，细胞密度 以及转染的时间长短和培养基中血清的含 量都是影响转染效率的重要问题，通过实 验摸索的合适转染条件对于效率的提高有 巨大的作用。
• 此图为脂质体转染后荧光蛋白的表达
物理方法
包括电穿孔、显微注射及基因枪等方法。
（1）电穿孔法
病毒型载体已被广泛地用于将外源基因导入哺乳 动物细胞或替换哺乳动物细胞中的缺陷基因，这类载 体将来在基因治疗中将具有非常重要的价值。目前应 用的病毒类型包括：逆转录病毒、腺病毒、牛痘病毒 和杆状病毒等。
A．逆转录病毒载体
逆转录病毒的优点是，可以使外源基因整合到基 因组中，因而可以被稳定传代和表达。但是，由于逆 转录病毒的插入位点是随机的，因而在基因组内的整 合有可能破坏一些内源基因的结构，尤其是当插人到 一些重要的基因位点时会导致细胞的异常。
转染效率低的原因
转染效率低的原因1.细胞类型：不同细胞株在基因转染上的敏感性和响应性各不相同。
一些细胞株对基因转染过程中用的化学试剂和转染载体的特异性反应较弱，从而导致转染效率低。
2.细胞状态：在基因转染前，细胞的状态也会对转染效率产生影响。
例如，细胞过度密集化时，细胞的生理状态可能会发生改变，从而降低了细胞对外源基因的摄取和表达能力。
3.细胞数量：正确选择合适的细胞数量进行转染也是一个重要因素。
如果细胞数量太少，可能会使细胞的可见表达效应降低。
4.转染试剂和载体的选择：不同的细胞株可能对不同的试剂和载体具有不同的敏感性。
因此，在选择试剂和载体时应根据细胞类型进行优化选择，以提高转染效率。
5.转染方法：转染方法不正确或不合适也是转染效率低的原因之一、例如，电穿孔法可能会导致细胞膜破裂，细胞死亡，从而影响转染效率。
6.微环境：转染过程中，细胞所处的微环境也会影响转染效率。
细胞培养温度、pH值、离子浓度、细胞培养液成分等都可能对细胞的生长和基因表达产生影响。
7.DNA质量：外源基因的质量也是影响转染效率的一个重要因素。
如果外源基因的质量不好，可能会导致转染效率低。
8.转染时间：转染的时间可能会影响转染效率。
如果转染时间太短，细胞未能充分与外源基因接触；而如果转染时间太长，则可能导致细胞受损或死亡。
9.细胞状态：细胞生长阶段也会影响转染效率。
例如，细胞处于分裂期或静止期时，可能不容易转染成功。
10.细胞培养条件：培养基的成分、温度、CO2浓度等因素都会影响细胞生长和基因表达，从而影响转染效率。
综上所述，基因转染效率低的原因有很多，包括细胞类型、细胞状态、细胞数量、转染试剂和载体的选择、转染方法、微环境、DNA质量、转染时间、细胞状态以及细胞培养条件等。
为了提高转染效率，需要对这些因素进行优化和调整，以满足实验要求。
脂质体转染原理
脂质体转染原理
脂质体转染是一种常用的基因转染方法，通过将外源基因载体包裹在脂质体内，使其能够穿过细胞膜并进入细胞内，从而实现基因的转染和表达。
脂质体转染原理主要包括脂质体的结构特点、转染机制和影响因素等内容。
首先，脂质体是由磷脂双分子层和蛋白质组成的囊泡结构，其外层为亲水性头部，内层为疏水性尾部。
这种特殊的结构使得脂质体能够与细胞膜融合，释放内部载体进入细胞质。
其次，脂质体转染的机制主要包括吸附、内化、溶酶体逃逸和核内释放等步骤。
当脂质体与细胞表面结合后，通过内化形成内体，随后内体融合成溶酶体，脂质体内的载体得以逃逸进入细胞质，最终进入细胞核并释放出目的基因。
最后，影响脂质体转染效率的因素包括细胞类型、脂质体与基因载体的比例、转染时间和温度等。
不同的细胞类型对脂质体转染的敏感性不同，而适当的脂质体与基因载体比例、转染条件的优化则能够提高转染效率。
总的来说，脂质体转染原理是通过脂质体与细胞膜的融合，将内部携带的基因
载体释放到细胞质中，最终实现基因转染和表达。
了解脂质体转染的原理和影响因素，对于基因转染实验的设计和结果解读具有重要的指导意义。
因此，在进行脂质体转染实验时，需要充分考虑脂质体的特点和转染机制，合理设计实验方案，以提高转染效率，为后续的基因功能研究奠定基础。
希望本文能够帮助读者更好地理解脂质体转染的原理和应用，为科研工作者提
供一定的参考价值。
基因渗入方法
基因渗入方法
基因渗入方法是指将外源基因或修饰的基因导入到目标生物体中的技术手段。
以下是常见的基因渗入方法：
1. 转染法：将外源基因通过化学方法或物理方法导入目标细胞，使其表达特定蛋白或产生特定表型。
常用的转染方法包括钙磷共沉淀法、电穿孔法、脂质体转染法等。
2. 病毒载体介导的基因传递：利用经过改造的病毒作为基因载体，将目标基因导入到目标细胞中。
常用的病毒载体包括腺病毒、逆转录病毒和腺相关病毒等。
3. 基因枪法：利用高速微粒轰击技术，将外源基因以微粒的形式直接射入目标细胞的核内。
这种方法通常用于植物细胞的基因转化。
4. 转座子介导的基因转移：利用转座子（跳跃基因）的能力，将目标基因插入到目标生物体的基因组中。
转座子可以通过人工合成或自然存在。
5. 电转化法：利用高电压脉冲作用于目标细胞，改变细胞膜的通透性，使外源基因能够进入细胞内。
这种方法适用于细菌、酵母等微生物的基因转化。
6. 通过细胞融合实现基因渗入：将目标细胞与带有外源基因的细胞进行融合，使外源基因导入目标细胞中。
不同的基因渗入方法适用于不同的生物体和细胞类型，选择合适的方法需要根据具体的研究目的和条件进行判断。
此外，在进行基因渗入实验时，还需要考虑生物安全性、目标基因的选择和筛选以及表达效率等因素。
转染试剂使用说明书
2. 3).
配制转染工作液： （ 6 孔板或 35 mm 平皿， 2 ml 培养液） 取 5~8μ g DNA （起始用量 5μ g） ，加入稀释液中至总体积为 100μ l，轻轻混匀，室 温放置。
4).
先将 GenFectin TM 涡旋振荡混匀。取 GenFectinTM 1~4μl（起始用量 2μl,） ，加入稀 释液中至总体积为 100μl，轻轻混匀，室温放置 5 分钟。
5).
将稀释的 GenFectinTM 逐滴加入稀释的 DNA 溶液中，轻轻混匀，所得的转染工作 液在室温放置 15 分钟。
6).
将转染工作液轻轻混匀，逐滴加入 2 ml 培养液中，轻轻混匀培养液，置 37℃，5% CO 2 培养。
3. 细胞后续处理： 7). 24~48 小时后，观察或收取细胞。
-4-
8).
稳定转染时，于转染后 24~48 小时消化细胞分至 3~5 个培养皿中，加适当浓度的 相应抗生素（如 G418）筛选。
建议的起始转染条件 : 培养容器
96 孔板 24 孔板 6 孔板 35mm 培养皿 60mm 培养皿
转染前一天 接种细胞数
1-1.510 个 0.5-1 10 个 2-4 10 个 2-4 10 个 4-6 105 个
5 5 5 4
转染时 培养液体积
0.1 ml 0.5 ml 2 ml 2 ml 4 ml
DNA 用量 与稀释后体积
0.25 μg 1.25 μg 5 μg 5 μg 10 μg 5 μl 25 μl 100 μl 100 μl 200 μl
GenFectin 量 与稀释后体积
0.1 μl 0.5 μl 2 μl 2 μl 4 μl 5 μl 25 μl 100 μl 100 μl 200 μl
转染步骤及经验(精华)
转染步骤及经验（精华）一、基础理论转染是将外源性基因导入细胞内的一种专门技术。
分类：物理介导方法：电穿孔法、显微注射和基因枪；化学介导方法：如经典的磷酸钙共沉淀法、脂质体转染方法、和多种阳离子物质介导的技术；生物介导方法：有较为原始的原生质体转染，和现在比较多见的各种病毒介导的转染技术。
理想细胞转染方法，应该具有转染效率高、细胞毒性小等优点。
病毒介导的转染技术，是目前转染效率最高的方法，同时具有细胞毒性很低的优势。
但是，病毒转染方法的准备程序复杂，常常对细胞类型有很强的选择性，在一般实验室中很难普及。
其它物理和化学介导的转染方法，则各有其特点。
需要指出的一点，无论采用哪种转染技术，要获得最优的转染结果，可能都需要对转染条件进行优化。
影响转染效率的因素很多，从细胞类型、细胞培养条件和细胞生长状态到转染方法的操作细节（见后文）。
二、转染操作流程（以常用的6孔板为例）(1) 细胞培养：取6孔培养板，以3x104/cm2密度铺板，37℃5%CO2培养箱中培养至70%～90%汇合。
(不同细胞略有不同，根据实验室优化的条件进行，汇合过分，转染后不利筛选细胞)。
(2) 转染液制备：在EP管中制备以下两液(为转染每一个孔细胞所用的量)A液：用不含血清培养基稀释1-10μg DNA，终量100μL，B液：用不含血清培养基稀释对应量的转染试剂，终量100μL；轻轻混合A、B液（1:1混匀），室温中置15分钟，稍后会出现微浊现象，但并不妨碍转染。
(3) 转染准备：用2mL不含血清培养液漂洗两次，再加入2mL不含血清及PS的培养液。
(4) 转染：把A/B复合物缓缓加入培养液中（缓慢滴加），轻轻摇匀，37℃温箱置6～8小时，吸除无血清转染液，换入正常培养液继续培养。
三、转染注意事项1. 血清A. DNA-阳离子脂质体复合物形成时不能含血清，因为血清会影响复合物的形成。
B．一般细胞对无血清培养可以耐受几个小时没问题，转染用的培养液可以含血清也可以不加，但血清一度曾被认为会降低转染效率，转染培养基中加入血清需要对条件进行优化。
sirna转染原理
sirna转染原理Sirna转染技术是一种新型的基因治疗技术，它能够抑制特定基因的表达，以达到治疗某些疾病的目的。
Sirna转染是利用特殊的RNA分子通过特殊的方式来抑制特定基因表达的。
Sirna转染的原理具体为，在细胞内，可以通过特殊的载体蛋白（比如受体）将 Sirna送至细胞核， Sirna细胞核中会与目标基因的 mRNA合，合后的 Sirna/mRNA合体会被蛋白酶切割，致目标基因不能正常表达，以达到抑制目标基因表达的目的。
Sirna染技术在疾病治疗领域有着重大意义，其仅仅针对特定基因发挥抑制作用，不会影响到其他基因，有效降低治疗所带来的副作用，例如用于癌症治疗的 Sirna，可以有效抑制肿瘤基因的表达，从而减轻患者的症状，减少化疗毒性。
此外，Sirna染技术也可以用于病毒感染的治疗，通过 Sirna够有效抑制病毒致病基因的表达，从而阻断病毒感染。
Sirna染技术虽然在医学上具有许多优势，但是仍有一些问题没有被解决。
首先是 Sirna抗性，即 Sirna能会被细胞分泌的酶分解，从而导致转染的不稳定性；其次， Sirna染所涉及的分子机制也很复杂，需要研究人员充分理解才能正确开展转染操作；最后，Sirna 染目前仍属于新型技术，尚未进入临床应用阶段，仍需经历许多实验和临床试验，才能达到临床应用标准。
尽管 Sirna染技术存在着一些问题，但是通过科技的进步，克服这些问题的可能性是很大的。
随着科技的进一步发展，Sirna染技术可能会被用于更多的疾病治疗，有望成为一种重要的生物医学技术。
综上所述，Sirna染技术是一种新型的基因治疗技术，它能够抑制特定基因的表达，以达到治疗某些疾病的目的。
尽管 Sirna染技术仍存在一些问题，但随着科技的发展，它可能会成为一种重要的生物医学技术。
polyplus转染试剂INTERFERin的应用
polyplus转染试剂INTERFERin的应用近年来，基因转染技术在生物医学研究中发挥着越来越重要的作用。
Polyplus是一家专门从事转染试剂研发的公司，其INTERFERin转染试剂在研究领域得到了广泛的应用。
本文将探讨INTERFERin在多个研究领域的应用，旨在帮助读者更好地了解该转染试剂的功能和优势。
一、INTERFERin转染试剂概述INTERFERin转染试剂是Polyplus公司专门为RNA干扰实验设计的一种转染试剂。
其特点是可以高效地导入siRNA和miRNA到细胞内，并且具有良好的毒副作用。
采用INTERFERin进行基因转染，可以有效地抑制靶向基因的表达，从而实现基因功能的研究。
该转染试剂适用于各种哺乳动物细胞，包括常用的人类和小鼠细胞系。
二、INTERFERin在研究中的应用1. RNA干扰实验INTERFERin转染试剂在RNA干扰实验中得到了广泛应用。
研究人员可以将设计好的siRNA或miRNA转染到感兴趣的细胞系中，通过靶向基因的沉默来研究其在细胞中的功能。
INTERFERin在转染过程中可以高效地导入RNA分子，从而实现RNA干扰的目的。
2. 基因表达调控实验除了RNA干扰实验，INTERFERin转染试剂还可用于基因表达调控实验。
研究人员可以将设计好的表达载体转染到目标细胞中，通过增加目标基因的表达来研究其生物学功能。
INTERFERin的高转染效率可以确保表达载体能够高效地导入细胞，并达到较高的表达水平。
3. 蛋白质相互作用研究INTERFERin转染试剂在蛋白质相互作用研究中也有重要的应用。
研究人员可以将编码不同融合蛋白的表达载体转染到不同的细胞系中，通过共转染的方式研究这些蛋白质之间的相互作用。
INTERFERin的高转染效率和低毒性可以确保共转染的有效率，从而提高实验的可靠性。
4. 疾病模型的构建基因转染技术在构建疾病模型方面也能发挥重要作用。
INTERFERin转染试剂可以用于将特定基因或突变基因转染到相关细胞中，从而模拟与某种疾病相关的生理过程或病理过程。
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•COS细胞
它来源于非洲绿猴肾细胞系（CV-1），能组成性表达 SV40的大T抗原。 ①细胞来源丰富； COS细胞 的特点
②细胞易于培养和转染；
③能使转染到该细胞中的带有SV40复制子 的转录载体快速扩增；
④能瞬时大量表达外源基因的产物。
由于转染质粒在COS细胞中无节制复制，最终将导致细 胞无法忍受而死亡。利用COS细胞作为外源基因瞬时表达的 受体细胞可广泛用于哺乳动物基因的表达与调控、蛋白结构 与功能分析等研究。
黄嘌呤-鸟嘌呤转移酶 （XGPRT）基因
哺乳动物细胞无XGPRT酶，不能利用黄嘌呤形成黄 嘌呤磷酸（XMP），但有鸟嘌呤磷酸核糖转移酶 （HGPRT），可催化黄嘌呤形成次黄嘌呤磷酸 （IMP）。哺乳动物细胞可通过IMP生成GMP。当 用IMP脱氢酶抑制剂霉酚酸，抑制了GMP的合成， 使细胞失去合成DNA能力而死亡。 将含XGPRT基因的重组体导入真核细胞后，在转化 细胞中就能表达XGPRT酶，可在含有黄嘌呤的培养 基中通过XMP中间体补救合成GMP，使DNA合成正 常进行，加入霉酚酸后，阳性克隆因不受霉酚酸的 抑制而存活，而未转化的阴性细胞则受霉酚酸的抑 制而死亡，以此可用来筛选阳性细胞。
一、胸苷激酶基因选择标记
TK是核苷酸补救合成途径的一个关键酶 内源性缺陷tk的宿主细胞——小鼠LMTK—细胞 HAT选择法 • H：次黄嘌呤；补救合成三种核苷酸的原料 • A：氨基喋呤；抑制四氢叶酸合成 • T：胸苷；补救合成dTTP的原料 tk—细胞的鉴别与获得：5`-溴脱氧核糖尿苷 （BUdR）筛选
新霉素（neo）：即G418，一种氨基糖苷类抗 生素，影响80S核糖体功能核蛋白质的合成 新霉素抗性基因编码3`-磷酸转移酶降解G418 适用于所有的真核细胞
氯霉素乙酰转移酶（CAT）基 因选择系统
CAT：大肠杆菌Tn9转座子编码的催化氯霉素乙 酰化反应的蛋白质 真核细胞缺乏CAT 导入CAT可作为报告基因 常用于瞬时表达研究
二氢叶酸还原酶（DHFR）基 因选择系统
DHFR：真核细胞生物合成核苷酸的关键酶，功 能是催化二氢叶酸还原成四氢叶酸 筛选剂：叶酸类似物——氨基喋呤或氨甲喋呤 dhfr—缺陷型细胞——CHO细胞 正常细胞可通过提高氨甲喋呤浓度筛选 突变型dhfr基因的导入扩大筛选宿主细胞的范围
新霉素抗性基因选择系统
②适合多种蛋白质的分泌表达和胞内表达； ③对培养基的要求较低，可在无血清培养基中培养； ④细胞可进行贴壁培养，也可进行大规模悬浮培养。
该细胞株是目前应用最广泛的哺乳动物基因表达受体细胞 之一，已有多种外源基因如人组织型纤溶酶原激活剂（tPA）、 干扰素β、干扰素γ 、凝血因子Ⅷ等在CHO细胞中得到表达。
常用宿主细胞
哺乳动物基因表达宿主细胞选择的基本原则：来 源丰富、转化效率高、表达效果好。
在哺乳动物基因表达过程中，与正常细胞生理特 性尽可能接近的肿瘤细胞常被选择为基因转移的受 体细胞。 目前用作哺乳动物基因表达系统的受体细胞主要 有：CHO-K1细胞、COS细胞、鼠骨髓瘤细胞等。
•CHO-K1细胞
基因转染
基因转染是指将外源基因导入靶细胞的技术。常 用的基因转染技术是将纯化的含有靶基因的质粒 DNA送入细胞内，并在细胞内表达。
影响转染效率的因素
1.转染方法 2.操作技术 3.质粒DNA的纯度 4.靶细胞的生长状态
用于转染的质粒DNA必须无内毒素，无RNA和 其了化学物质的污染，OD260/280比值应在 1.8以上。应用酚-氯仿抽提法制备的质粒DNA 一般难以达到此标准，目前大多采用质粒提取纯 化试剂盒。 被用于作靶基因转染的细胞，其生长状态如何， 将直接决定了基因转染效率。如为贴壁生长的细 胞，一般要求在转染前一日，必需应用胰酶处理 成单细胞悬液，重新接种于培养皿或瓶，细胞密 度以铺满培养器皿的80%左右为宜，转染当日， 在转染前4小时换一将近新鲜培养液。对于悬浮 细胞，也需在转染前4小时换一次新鲜培养液 。
细胞的DNA合成有主要途径和旁路途径两种方式 1.主要途径就是利用谷氨酰胺或单磷酸脲甘酸在二 氢叶酸还原酶的催化下合成DNA 2.旁路途径则是利用次黄嘌呤或胸腺嘧啶在次嘌呤 鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT)或胸腺嘧啶激酶 （TK）的催化下补救合成DNA。 氨基喋呤是二氢叶酸还原酶的抑制剂，能够有效地 阻断DNA合成的主要途径。
•鼠骨髓瘤细胞
鼠骨髓瘤细胞如Sp2/0、NSO和J558L等已被用作基因表 达的受体细胞。目前已有免疫球蛋白（Ig）、tPA等多种外 源基因在鼠骨髓瘤细胞中得到表达。
鼠骨髓瘤细 胞的特点
①细胞易于培养和转染，可在无血清培 养基中进行高密度悬浮培养； ②能进行分泌表达，且表达量高；
瞬时表达
质粒转染到细胞中，一部分转运进入细胞核， 进行转录输出mRNA进行蛋白质合成。几 天内大部分的质粒都会被降解或传代而稀 释。一周以后几乎检测不到。转染的质粒 不整合到染色体上，出现短暂的（24-96h） 高水平表达，依赖于质粒纯度、浓 度和转染效率。
CHO-K1细胞是从中国仓鼠卵巢中分离出的一株上皮细胞。 目前被用于基因表达的受体细胞是一株缺乏二氢叶酸还原酶 （dhfr－）的突变株，它可在氨甲蝶呤选择压力下，使外源基因 拷贝数扩增并得到较高水平的表达，表达量可达10μg/ml以上。
①外源基因在没有选择压力的情况下能稳定保持 方 法
理想的细胞转染方法，应该具有转染效率高、细 胞毒性小等特点。病毒介导的转染技术，是目前 转染效率最高的方法，同时具有细胞毒性很低的 优势。但是，病毒转染方法的准备程序复杂，常 常对细胞类型有很强的选择性，在一般实验室中 很难普及。目前非病毒介导的转染技术中，转染 效率最高的方法是以阳离子非脂性物质为主的混 合物配方。该类转染物质介导的细胞转染具有广 谱、细胞毒性小、性能稳定等特点，而且不受培 养液中的血清和抗生素的干扰，比脂质体介导的 转染方法更方便，因而在转染技术领域逐渐占据 主流地位。
稳定表达
转染的质粒DNA整合到染色体上可以持续 存在，转染的细胞可以长期表达。 整合的概率比较小，要获得稳定转染的细 胞株需要筛选标记共同转染，通过选择压 力维持表达稳定。需要长时间的抗性选择 培养。
遗传性标记
胸苷激酶基因（tk）选择系统
二氢叶酸还原酶基因（dhfr）选择系统 新霉素抗性基因（neo）选择系统 氯霉素乙酰转移酶基因（cat）选择系统 黄嘌呤-鸟嘌呤转移酶基因（XGPRT）选择系统