杀菌和抑菌试验操作规范
药品抑菌效力测定操作规程
1 目的： (2)2 使用范围： (2)3 责任者： (2)4 正文 (2)4.1 概述: (2)4.2 产品分类 (2)4.3 抑菌效力判断标准 (2)4.4 实验仪器及器具： (3)4.5 实验材料 (3)4.6 菌种 (3)4.7 菌液制备： (3)4.8 供试品接种 (4)4.9 存活菌数测定 (4)4.10 结果判断 (4)4.11 记录及报告的书写 (5)4.12 注意事项 (5)5 相应文件 (5)6 附件 (5)7 文件变更历史 (5)8 参考文献 (5)文件颁发部门质量检验部复印件分发单位质量保证部、质量检验部、研发部1 目的：规范产品抑菌效力测定正确操作，确保实验结果准确可靠。
2 使用范围：适用于需要测定抑菌效力的各类产品。
3 责任者：质量检验部经理、主管、检验员4 正文4.1 概述:抑菌剂效力检查法系用于测定灭菌、非灭菌制剂中抑菌剂的活性，以评价最终产品的抑菌效力，同时也可用于指导生产企业在制剂研发阶段抑菌剂的确定。
4.2 产品分类4.3 抑菌效力判断标准注：表中“不增加”是指对前一个测定时间，试验菌增加的数量不超过0.5 lg。
4.4 实验仪器及器具：净化工作台、生化培养箱、霉菌培养箱、高压蒸汽灭菌器、恒温干燥箱、恒温水浴锅、电冰箱、接种环、酒精灯、培养皿（9cm）、天平、锥形瓶、量筒、试管、硅胶塞、刻度吸管、钢锥、消毒缸、试管架、记号笔、酒精棉球、乳胶手套、薄膜过滤器、滤膜4.5 实验材料酪蛋白大豆消化琼脂培养基、沙氏--葡萄糖琼脂培养基、酪蛋白大豆消化肉汤培养基、沙氏--葡萄糖肉汤培养基、pH7.0 氯化钠-蛋白胨缓冲液、0.9%氯化钠溶液、大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉菌4.6 菌种试验所用的菌株传代次数不得超过5代（从菌种保存中心获得的冷冻干燥菌种为第0代），并采用适宜的菌种保藏技术，以保证试验菌株的生物学特性。
若需要，制剂中常见的污染微生物也可作为试验菌株。
抗菌实验规范操作
抗菌实验具体实验步骤一、共培养及换液1.开灯，开风扇，用浸过酒精的纸巾擦次超净工作台台面，点酒精灯2.取出4根10ml的管子3.往管子中分别加入1ml的样品药液：（（在超净台中用0.22um的绿色滤膜与10ml针筒过滤5ml团簇银，并用pbs稀释药物）注：绝大多数细菌的直径大小在0.5μm之间.所以用一张0.22um的滤膜,把样品倒入一次性针管中,在超净工作台中过滤.容器也要注意灭菌）AgNCS：1# Co 、2# 1/2 、3#1/4 、4# 1/8，5#PBS4.先用震荡器摇菌10S（管子均水平放置震荡，以下震荡与此一样）再往这4个管子中分别加入100微升的（P）金葡菌液5.再往这4个管子中分别加入5mlLB,写上标记6.最后用封口膜封好肉汤和共培养的样品7.把共培养的样品拿去摇菌（摇菌参数：37度，6h，150rpm）8.清理桌面，拿走自己的样品和垃圾，用浸过酒精的纸巾擦次超净工作台台面二、涂板（晚上7点开始涂板子）1.开灯，开风扇，用浸过酒精的纸巾擦次超净工作台台面，点酒精灯；后分别把PBS和样液拿进超净工作台2.放好两个架子的位置（左边放样液，前方放小型试管架）3.把三角涂板器在火焰上灼烧（每个顶点，每条边，均来回灼烧3次）4.取2ml的管子放好，每组样品3个，共12个5.每组管子命名为A,B,C号管子，先往A,B管中加入990ulPBS，再往C管中加入900ulPBS6.摇菌，取10微升菌液，先加入到A中，盖上盖子震荡10S，再取A管10微升液体加入到B中，震荡10S，最后取B管100微升液体到C中7.取C管中50微升液体均匀地滴加到板子的四个正方形顶点位置上，后用三角涂板器顺时针涂100次以上（应涂到干透为止），同时板子也要不停地转动，最后再标记好姓名，日期，菌名，封口，调节移液枪量程至最大，收拾桌面，取出所有相关物品，倒掉大烧杯中垃圾并在喷酒精后放回，用浸过酒精的纸巾擦次超净工作台台面，开半小时紫外，之后务必关闭，后将板子一个一个地倒放在生化培养箱里8.等待12—16h,取出板子观察，数菌，拍照9.清理板子：板子拉开一个口子，并喷上酒精，倒入垃圾桶三、换液（菌落培养24h后换液）1.开灯，开风扇，用浸过酒精的纸巾擦次超净工作台台面，点酒精灯2.将昨天培养的菌落震荡10S3.取出一只10ml管子，加入100ul菌液4.再加入5mlLB5.封口，标记日期，姓名，菌名6.清理桌面，拿走自己的样品和垃圾，用浸过酒精的纸巾擦次超净工作台台面备注一、倒板子用500ml的锥形瓶装配好LB溶液（配琼脂，500ml超纯水+12.5g肉汤粉+10g琼脂：2瓶；1000ml超纯水+25g肉汤粉+20g琼脂：1瓶）1.先用铝箔纸盖上瓶口，再放入铁篮子里，之后放入高压灭菌锅里（121摄氏度，升温1h，恒温0.5h，降温1h），两个小时之后取出样品2.最后在超净工作台上将琼脂用锥形瓶倒满板子表面二、制LB1.将配好的LB aq （10gLB+400ml水）装进80ml的瓶子，瓶子的盖子半松开状态，之后放入高压灭菌锅中（121摄氏度，升温1h，恒温0.5h，降温1h）,两个小时之后取出样品，之后等降到室温时，在锅内把盖子拧紧，封口，放入冰箱。
抑菌实验方案
抑菌实验方案抑菌实验方案一、菌种大肠杆菌ATCC25922 金黄色葡萄球菌ATCC6538二、培养基LB培养基：胰蛋白胨10g/L、酵母膏5g/L、氯化钠10g/L、琼脂15~20g，用10mol/LNaOH调pH，范围7.0~7.4倒平板（平板培养基）1.将培养皿洗净、干燥，使各培养皿盖方向一致，用牛皮纸包好，或放入特制铁罐内，注明皿盖的方向。
高压灭菌或干燥灭菌后备用。
2.取刚灭菌后尚未凝固的培养基置于无菌箱或超净工作台内，先左手持三角瓶,右手反转手掌用中指和无名指拨出棉塞或硅胶赛(或不翻转手掌用小指和手掌拨出棉塞) ,同时将三角瓶转换至右手，而后左手拿平皿,以大拇指和中指将皿盖打开一缝，至瓶口刚好伸入。
三角瓶口经火焰烧灼后，倾入灭菌或溶化、冷却至55~60°C的培养基约15mL(勿使瓶口靠在平皿壁上，以免沾染皿壁)，迅速盖好皿盖，置于桌上轻轻旋转平皿,使培养基均匀分布于整个平皿底部,冷凝后即为平板培养基。
有时凝固后的培养基表面有冷凝水，可将平皿盖打开倒置于37℃温箱，除去冷凝水，否则将影响平板分离培养效果。
为防止冷凝水过多，也可将培养基冷却至45 ~ 50°C再倒平板。
培养基在30℃下放置一天，无污染的即可使用。
一般用牛皮纸包裹好存放于2-8℃冰箱中备用三、器械培养皿（90mm）、滤纸、三角耙、接种环、试管四、实验步骤（一）、抑菌圈的测定(滤纸片法)1、菌种接种将大肠杆菌、金黄色葡萄球菌反复转种2次，使菌种新鲜，置30℃恒温培养箱培养1d，备用。
2、菌悬液制备在超净台里将转接后生长良好的菌种试管斜面注入适量无菌水(约5mL)，接种环轻刮菌落，摇晃混匀。
3、涂布在超净台里用枪取0.1ml菌悬液注入平板，放置5min左右后用三角耙涂布均匀，每种菌设置两个重复平板4、贴片在超净台里将平板平均分为6个区，对角设置平行组，同时用无菌水做对照组,硫酸链霉素(10U)作阳性对照。
每两张滤纸片(直径1.1cm或0.6cm)为一贴，用镊子夹着滤纸片在样品中轻轻蘸一下后，取出贴在平板的指定位置，轻摁一下使滤纸片牢固，置(正放)4℃冰箱中放24h。
卫生部2002年版《消毒技术规范》-2.1.8.4最小抑菌浓度试验(营养肉汤法)
2.1.8.4 最小抑菌浓度测定试验（营养肉汤稀释法）2.1.8.4.1 原理本试验将不同浓度的抑菌剂混合溶解于营养肉汤培养基中，然后接种细菌，通过细菌的生长与否，确定抗（抑）菌剂抑制受试菌生长的最低浓度，即最小抑菌浓度(Minimal Inhibitory Concentration，MIC)。
本方法式用于可溶性抑菌产品。
2.1.8.4.2 试验器材（1）试验菌株：金黄色葡萄球菌ATCC 6538 ，大肠杆菌8099 或ATCC 11229。
可根据抑菌剂的用途，选择特定的菌株。
（2）营养肉汤培养基，见附录A。
（3）稀释液，见附录A。
（4）吸管、试管（5）37℃培养箱。
2.1.8.4.3 操作步骤（1）按 2.1.1.2 所示方法制备的金黄色葡萄球菌、大肠杆菌悬液（2）含抗菌剂培养基配制：将抗（抑）菌溶液用蒸馏水做对倍系列稀释成不同浓度的受试液，取各稀释度受试液2.5ml 加入到含2.5ml 双倍浓度营养肉汤的试管中。
（3）取0.1ml 含菌量约为108cfu/ml 菌悬液接种于含抗（抑）菌剂的营养肉汤的试管中，作为试验组样本。
（4）以同样方法接种不含抗（抑）菌剂的营养肉汤的试管中，作为阳性对照组样本。
（5）取2 支含营养肉汤的试管中，作为阴性对照组样本。
（6）将试验组样本、阳性对照组样本及阴性对照组样本放置37℃培养箱中，培养48h，观察结果。
（7）试验中应将试验用菌悬液进行活菌培养计数，其作用浓度应为5×105cfu/ml～5×106cfu/ml。
2.1.8.4.4 评判规定当阳性对照管有细菌生长(混浊)，阴性对照管无菌生长(透明)，试验用菌悬液的作用浓度为5×105cfu/ml～5×106cfu/ml 时，试验组无菌生长的最高稀释度所对应的抗（抑）菌剂浓度，为该样品对受试菌的MIC。
2.1.8.4.5 注意事项接种时，应由低抗（抑）菌剂浓度向高浓度依次接种。
抑菌试验步骤
1.培养基的制作（PDA培养基）：制作：新鲜土豆200g（去皮后），切成小块（差不多宫保鸡丁的小块那么大），加入蒸馏水约1000mL（可以适当多加点，因为煮的过程中水分要蒸发），水煮沸时开始计时，30min 后，停止加热，用纱布过滤（3层），补充滤液至1000mL，滤液中加入2%的葡萄糖（即是20g），滤液加热后，加入1.5%琼脂（15g），即制作好了培养基分装：趁热将制作好的培养基用20mL移液管移至玻璃管中，每管19mL。
灭菌：将装好的培养基，包扎，灭菌。
（121℃20min）需要灭菌的物品还有：移液枪枪头；玻璃棒（直径小于5mm的）；内直径5mm的塑料小管2.药液的配制：万分之一天平称取待测物质0.02g于10mL离心管中，加入二甲桠枫将其溶解（尽量少用溶剂，一般200uL加入后即可，如果不能溶解，再加。
一般加入溶剂后稍微加热即可溶解）；再加入配制好的千分之一的吐温804.8mL（使溶液体积为5mL），即配制好了100ppm（此时的浓度并非100ppm，而是后面加入培养基后的浓度）的药液，梯度稀释成50ppm、25ppm、12.5ppm、6.25ppm。
空白的也要加入二甲桠枫和吐温80.50ppm（都是最后在培养基中的浓度）硫酸链霉素的配制：精确称取硫酸链霉素0.05g 于25mL比色管中，蒸馏水定容。
（加入该物质是为了抑制细菌生长的）3.倒平板：培养基灭菌完成后趁热拿到超菌台，分别加入0.5mL的药液和0.5mL的硫酸链霉素溶液（此操作最好两人分别完成），然后，一人将培养基摇匀，另一人将摇匀的培养基倒入事先已灭菌烘干的平板中（在酒精灯旁完成）。
两人合作实验时，分别坐在超菌台的两边。
4.接种：待培养基凝固后，一人A用直径5mm的塑料管戳取菌种菌饼，另一人B左手拿培养皿，打开盖子，A将有菌饼的小管移至培养皿中心，B右手用灭菌的玻璃棒将其戳出，粘于培养皿中心，即可。
（此操作在酒精灯旁进行）5.培养：25℃培养玉米小斑病菌、水稻立枯丝病菌、小麦赤霉菌、灰葡萄孢；28℃培养油菜菌核菌。
抑菌试验方法
抑菌试验方法一、引言抑菌试验是一种常用的实验方法，用于评估不同物质对微生物生长的影响。
该试验可用于评估抗菌剂的效果、食品、药品和化妆品的微生物安全性，以及环境中抗菌材料的性能等。
本文将介绍抑菌试验的一般步骤和常用方法。
二、试验步骤1. 试验前准备在进行抑菌试验前，首先要准备好所需的试验材料和设备。
包括培养基、试验物质、细菌菌株、培养皿、试管、移液器等。
同时，要保持实验环境的清洁和无菌。
2. 菌种培养选择合适的细菌菌株，将其接种到含有适当培养基的试管中，并在37℃恒温培养箱中培养过夜，使其达到指定的细菌浓度。
3. 制备菌液将过夜培养的菌株转移到新的培养基中，通过菌液稀释法，制备出所需的菌液浓度。
菌液的浓度应根据试验要求进行调整。
4. 试验组装将试验物质分别添加到培养基或培养皿中，使其与菌液充分接触。
同时，设置对照组，用无抑菌物质的培养基或培养皿进行对照。
5. 培养条件将试验组和对照组置于适当的培养条件下，如温度、湿度等。
根据不同的试验要求，可选择不同的培养时间和培养条件。
6. 菌落计数在培养结束后，使用显微镜或肉眼观察试验组和对照组的菌落情况，并进行菌落计数。
菌落计数可通过平板计数法或滴定法进行。
7. 数据分析根据菌落计数结果，对试验组的抑菌效果进行评估。
常用的评估指标包括菌落形成率、抑菌率、最小抑菌浓度等。
三、常用方法1. 纸片扩散法该方法常用于评估固体试样的抑菌效果。
将试验物质涂布于纸片上，然后将纸片放置在含菌液的培养基表面上，通过观察菌落的生长情况来评估抑菌效果。
2. 悬浮液法该方法常用于评估液体试样的抑菌效果。
将试验物质与菌液混合，通过培养一定时间后，观察菌液的浑浊度或使用菌落计数法来评估抑菌效果。
3. 筛选法该方法常用于筛选具有抑菌活性的试验物质。
将试验物质与菌液混合后，通过培养一定时间后，观察菌落情况，筛选出对菌株有明显抑制作用的试验物质。
4. 斑点法该方法常用于评估试验物质对特定细菌菌株的抑菌效果。
抑菌实验程序
抑菌实验程序2 抑菌实验基本程序，先确定抑菌性，后确定最小抑菌浓度(活性)2(1 抑菌性实验:在灭菌平皿中加入牛肉汤培养基后，中间划一线，两侧点接药物和细菌，35?孵育16~20h，看菌与药物接触处菌落是否变形，若变形即为有抑菌性，可进行下面的实验 2(2 最小抑菌活性确定:思路:菌种准备—抗菌培养基(不同梯度剂量)—温育—观察生长情况—确定最小浓度方法:2(2(1 菌种准备:准备10支试管，排成1排，内置去离子水配成的生理盐水(0.8%), 除第1管加入10 ml外，其余每管加入肉汤9ml，在第1管加入活化的菌1-2环，混匀振荡后，吸取1ml至第2管，混匀后再吸取1ml至第3管，如此连续倍比稀释至第10管，并从第10管中吸取1ml弃去，(使用时可通过预实验数菌落数，也可以直接选用其中的第7，8管)即为浓度为104 CFU,一般可直接用于接种测试。
2(2(2 培养基制备:牛肉浸膏琼脂培养基，以1NNaOH或HCl调pH7.2~7.4,灭菌后备用2(2(3 梯度药物浓度培养基制备:准备十支灭菌水的试管，排成一排，除第1管加入1.6ml无菌水外，其余每管加入肉汤1ml，在第1管加入抗菌药物原液0.4ml混匀，然后吸取1ml至第2管，混匀后再吸取1ml至第3管，如此连续倍比稀释至第9管，并从第9管中吸取1ml弃去，第10管为不含药物的生长对照。
根据实验设计，将已倍比稀释的不同浓度的抗菌药物分别加入已加热溶解，并在45~50?水浴中平衡的MH琼脂中，充分混匀倾倒灭菌平皿，琼脂厚度3~4mm。
通常按1?9比例配制药物琼脂平板，根据需要来选择药物浓度范围。
2(2(4 含药平板上接种:将1中的菌点接在准备好的药物琼脂培养基3中，每点直径可以用灭菌的打孔器打孔，直径5-8mm,接好后置35?孵育16~20h，观察2(2(5 结果评定:将平板置于白色底衬下，确定抑制细菌生长的最低药物浓度，与生长对照比较抑制80%以上细菌生长的最低药物浓度作为终点浓度。
打孔法抑菌试验操作流程
打孔法抑菌试验操作流程下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。
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抑菌效力检查操作规程
抑菌效力检查操作规程抑菌效力检查操作规程一、实验室准备工作1. 确保实验室内环境干净整洁，无杂草杂物。
2. 准备所需的实验设备和试剂，包括培养基、培养皿、试管、培养箱等。
3. 检查设备和试剂的质量，确保其符合检测要求。
4. 检查消毒设备的有效性，保证消毒质量。
5. 确保实验人员了解并熟悉相关的实验操作规程。
二、样品准备1. 根据检测要求，选择需要检测抑菌效力的样品。
2. 样品应具备代表性，以确保检测结果的准确性。
3. 样品应进行有效的消毒处理，以去除可能影响实验结果的外源性菌群。
4. 样品应进行适当的稀释处理，以确保实验过程中的菌落计数在合适的范围内。
三、实验操作1. 预热培养箱至适当的温度，通风静置一段时间以达到温度均一。
2. 准备培养基，按照指定比例配制好培养基。
3. 将培养基倒入培养皿或试管中，确保培养基平均分布。
4. 待培养基凝固之后，使用无菌技术在培养基上均匀地涂布待测样品。
5. 将涂布好的培养皿或试管放入预热好的培养箱中，设定适当的温度和时间。
6. 培养结束后，取出培养皿或试管，进行菌落计数和观察。
7. 记录实验结果，并依据相关标准对抑菌效力进行评估。
四、实验结果分析1. 对每个样品进行菌落计数，统计不同条件下菌落的数量和形态特征。
2. 将实验结果与对照组进行比较，判断样品的抑菌效力是否达到要求。
3. 如果样品的抑菌效力未达到要求，可以继续进行进一步的研究和优化，以提高其抑菌效力。
4. 根据实验结果和分析，撰写实验报告，包括实验目的、方法、结果和结论等内容。
五、实验安全注意事项1. 操作人员应穿戴适当的实验服和个人防护用品，如手套、口罩和护目镜等。
2. 操作过程中要注意实验室内的卫生和消毒，避免交叉感染。
3. 各种试剂和培养基应按照规定存放和处置，避免对环境和人员造成危害。
4。
严禁食用实验中使用的试剂和培养基。
5. 在实验操作过程中，如有任何异常情况发生，应立即停止操作，并及时采取相应的安全措施。
杀菌实验操作规程
杀菌实验操作规程杀菌实验是一项重要的科学实验，用于测试抑菌剂或消毒剂对细菌和其他微生物的杀灭能力。
为了确保实验结果的准确性和安全性，有必要制定一套详细的操作规程。
以下是杀菌实验的一般操作规程，供参考：一、实验前准备1. 阅读相关文献，熟悉实验目的、方法和操作步骤。
2. 准备所需材料：培养基、试管、移液器、培养皿、显微镜片等。
3. 准备实验器械和试剂：灭菌器、杀菌灯、试剂瓶等。
4. 检查实验设备和器材的工作状态，确保正常使用。
5. 按照实验要求准备细菌菌株或其他微生物。
二、实验操作1. 操作前进行严格的个人卫生，包括洗手和穿戴实验服、手套和口罩等防护措施，确保实验环境的洁净。
2. 准备培养基：称取适量的培养基粉末，加入适量的蒸馏水，充分搅拌溶解，然后加热灭菌。
3. 准备培养物：取一定量的细菌菌液，加入培养基中，混匀，然后将混合溶液分装到培养皿或试管中。
4. 杀菌处理：将试管或培养皿中的细菌培养物分成多组，每组加入不同浓度的抑菌剂或消毒剂。
5. 混合均匀后，置于恒温箱或恒温培养箱中进行培养。
相应的培养条件（温度、湿度、光照等）需按照实验要求进行调节和控制。
6. 观察细菌生长：在培养的过程中，定期观察每组培养物中细菌的生长情况，包括菌落数量、形态、色素等方面的变化。
7. 实验结束后，将培养皿或试管进行杀菌处理，以防止细菌的传播和污染。
三、实验安全注意事项1. 实验过程中要注意消毒和灭菌。
操作前和操作结束后，使用消毒剂对实验台面、设备和器材进行彻底清洁。
2. 实验操作时要佩戴个人防护用品，包括实验服、手套、口罩等，以避免个人受到细菌感染。
3. 注意实验器材的选择和使用，确保其材质对于实验中使用的试剂和溶液具有稳定性和耐受性。
4. 在操作过程中要尽量减少试剂和细菌的飞溅和喷溅，以防止污染和伤害。
5. 实验结束后，将实验室清洁干净，实验废弃物正确处理。
以上是一套较为常见的杀菌实验操作规程，实验者应根据具体需求和实验要求进行相应的调整和补充。
微生物实验室消毒灭菌要求和流程及注意事项
微生物实验室消毒灭菌要求和流程及注意事项微生物实验室是一个高度敏感且容易受到污染的环境，因此进行消毒和灭菌是非常重要的。
当人们进行微生物实验时，可能会接触到各种微生物，包括病原菌和致病菌。
这些微生物可能会在实验室内传播，并对工作人员和实验结果造成严重的危害。
因此，营造一个干净，无菌的实验室环境非常重要。
以下是微生物实验室消毒灭菌的要求、流程和注意事项。
1.消毒灭菌的要求：1.1无菌状态的要求：实验室内表面、设备和试剂应保持无菌状态，以防止交叉污染和实验结果的偏差。
1.2安全操作：实验人员在进行消毒灭菌时，必须采取相关的安全措施，包括佩戴实验室服装、手套和面罩。
1.3有效性：选择合适的消毒剂和灭菌方法，确保能有效地杀死各种细菌和病毒。
2.消毒灭菌的流程：2.1分析和评估：首先，对实验室内的表面、设备和试剂进行分析和评估，确定哪些区域和物品可能受到细菌和病毒的污染。
2.2清洁：在进行消毒灭菌之前，确保将实验室的表面、设备和试剂进行彻底的清洁。
使用清洁剂和适当的工具将表面上的灰尘和污垢清除干净。
2.3选择合适的消毒剂：根据实验室的需求和要求，选择合适的消毒剂。
常见的消毒剂包括酒精，氧化剂（如过氧乙酸）和氯化物（如次氯酸钠）等。
确保选用的消毒剂能有效地杀灭细菌和病毒。
2.4消毒程序：根据所选的消毒剂，按照相关的程序和指南进行消毒。
这可能包括将消毒剂直接喷洒或涂抹到表面上，或将消毒剂与适当的浓度稀释后浸泡或浇洗物品。
2.5灭菌程序：对于一些高度敏感和重要的物品，如培养基，需要进行灭菌处理。
常见的灭菌方法包括高压蒸汽灭菌（Autoclave）和热气灭菌。
根据物品的大小和材质，选择合适的灭菌设备和程序。
2.6消毒时间和周期：根据消毒剂的要求和指南，确保将消毒剂留在表面上足够的时间，以确保细菌和病毒被彻底杀灭。
此外，定期定时进行消毒灭菌是非常重要的，以保持实验室的无菌状态。
3.消毒灭菌的注意事项：3.1遵循安全操作规程：进行消毒灭菌时，务必遵守实验室的安全操作规程和指南，佩戴适当的个人防护装备，避免直接接触消毒剂和灭菌设备。
检验操作规程(抑菌试验)
5.1 抑菌片的制备
按照要求将抑菌剂配置成试验所需浓度。取干燥备用的滤纸片，每片滴加20ul抑菌剂置37℃温箱或室温干燥备用。（溶出性抗抑菌产品，可直接制成直径为5mm，厚不超过4mm圆滤纸片，每片滴加无菌蒸馏水或抑菌剂溶剂20ul，干燥备用。
5.3 试验菌的接种
7.3 应保持琼脂浓度的准确性，否则可影响抑菌环的大小。
7.4 培养时间不得超过18h。培养时间过久，部分细菌可恢复生长，抑菌环变小。
7.5 抑菌环直径可受抑菌剂的量、抑菌性能和干湿度影响。故抑菌剂滤纸片应在试验当天制备。
6 判定规则
6.1抑菌环直径大于7mm者，判为有抑菌作用
6.2抑菌环直径小于或等于7mm者，判为无抑菌作用
6.3所有抑菌剂试验样片均有抑菌作用者，判为合格
6.4阴性对照组应无抑菌环产生，否则试验无效
7 注意事项
7.1 每次试验均应设置阴性对照，不可省略。报告中亦必须将对照组结果列出。
7.2 接种用细菌悬液浓度应符合要求。浓度过低，接种菌量少，抑菌环常因之增大，浓度过高，接种量过多，抑菌环则可减少。
用无菌棉拭子蘸取浓度为5×105cfu/ml～5×106cfu/ml试验菌悬液，在营养琼脂培养基平板表面均匀涂抹3次。盖好平板，置室温干燥5min。
5.4 抑菌剂样片贴放
每次试验贴放4个染菌平板，其中3个平板每个贴放1片试验样片，另外一个平板贴放1片阴性对照样片，用无菌镊子取样片贴放于平板表面。贴放好后，盖好平皿，置37℃培养箱培养16～18h观察结果。用卡尺测量抑菌环的直径（包括贴片）并记录。（测量抑菌环时，应选均匀而完全无菌生长的抑菌环进行。测量其直径应以抑菌环外沿为界）
文件修订对照表
版次
修订日期
抑菌试验
1.2方法L2.1菌液制备将试验菌分别接种于肉汤培养基(金葡菌和大肠杆菌接种于营养肉汤,无乳链球菌接种于叠氮化钠葡萄糖肉汤)于37e培养箱培养18小时后,以倾注平板法培养计数,用无菌生理盐水稀释到含菌数为106cFu加LL备用"1.2.2药液稀释每组取8支试管,在一支试管加入smL原/乳炎康注射液,,药液,然后用灭菌肉汤进行倍比稀释,第2管至第6管中先后各加入2.smL灭菌肉汤,从第1管中取2.smL药液至第2管,混匀后取2.smL至第3管,依次类推,至第6管取2.smL弃之"使得第1至第6管药液浓度分别为50Omg/mL!250mg/mL!125mg/mL!62.5m留mL!31.25m留mL!巧.625mg/mL,第7管为smL无药液肉汤对照管,第8管为药液对照管"1.23细菌接种和琼脂平皿培养各试管中分别加入上述制备的菌液0.lmL,摇匀后置于37e恒温培养箱内培养24h,再于各试管中取样分别接种于各琼脂平皿,金黄色葡萄球菌接种于普通营养琼脂平皿;无乳链球菌接种于羊鲜血琼脂平皿;大肠杆菌接种于麦康凯琼脂平皿"置于37e恒温箱内再培养18一48h,在培养1811,24h和48h分别观察细菌生长情况"1.2.4最小抑菌浓度的判定以琼脂平皿中无细菌生长的试管药液浓度判定为/乳炎康注射液0的最低抑菌浓度(MIC)"2结果金黄色葡萄球菌在含药液浓度为50omg/mL浓度的肉汤中不生长,低于此浓度以下时生长良好;无乳链球菌在125m岁m工浓度以上的肉汤中不生长;大肠杆菌在25Omg/mL浓度以上肉汤中不生长"/乳炎康注射液0在肉汤中对金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度(Mlc)为500mg/mL,对无乳链球菌的MIC为125mg/mL,对大肠杆菌的呱C为25Om留mL"制备工艺金银花!蒲公英加水浸泡后.蒸馏.收集300ml蒸馏液"蒸馏后的药物渣与其他药物加水煎煮两次,第一次1.几.第二次1.Oh,合并煎液,#放冷,加入95%乙醇,使得药液乙醇浓度为85%,密闭冷藏24h,过滤,回收乙醇,药液冷却后再加入95%乙醇,使得酒精浓度达75%,冷藏抖11,j二滤,回收乙醇.药液减压浓缩至400耐"与蒸馏液合并,加入2%药用碳作用10二ill后过滤,调pH值至药液澄清,加入2%吐温一80和0.01%EDTA,静止后过滤.分装.灭菌.活菌平板计数法将被检菌株分别划线接种于固体培养基,金黄色葡萄球菌接种于却莆曼琼脂培养基,大肠杆菌接种于麦康凯琼脂培养基,无乳链球菌接种于绵羊鲜血琼脂培养基,置37e培养24h"在大肠杆菌麦康凯琼脂培养基平皿上挑选光滑!圆整的红色菌落1个,接种普通肉汤培养基中,置37e振荡培养16一20h"在一排小嫩底试管中先加稀释液灭菌生理盐水,第1管加1.smL,从第2管起各管加0.gmL,取0.2mL细菌原液加入第1管中,作为第1个稀释浓度,接下来从第1管中取0.lmL加入第2管,作为第2个稀释度,依次类推进行一系列稀释,从第1管10倍稀释到10.9,然后取106,107,105,109四个稀释度中菌液0.lmL进行涂板,每个稀释度涂3块板,置37e倒置培养24h"选取菌落数介于30一300之间的平板作为有效计数平板,取3块板的细菌平均数乘以稀释倍数再乘以10,即为被检细菌原液中每mL细菌活菌数"金黄色葡萄球菌和无乳链球菌同大肠杆菌的计数方法进行平板计数".用无菌生理盐水稀释到含菌数为106cFu/mL备用.药物敏感试验在倒好的M一H琼脂平板上倒入0.2mL以校正好的细菌悬液(1护CFu/mL),用无菌棉拭子涂匀"平板加盖放置干燥至少3min,但不得超过巧min,用无菌镊子将药敏纸片贴在涂好菌液得平板上,各纸片中心相距至少24Inlll,两纸片中心至少30~"在15min内将平板置37oC培养18一24h"最低抑菌浓度(MIC)的测定按微量稀释法(microdilution)进行:先准备13支灭菌试管,每管加肉汤回,第1管加药物稀释液Inil,混合后取Inil加入第2管,依次倍比稀释到第13管(此时第1一13管药液浓度依次为:1280一0.3125u留而)"取u型底96孔聚苯乙烯微孔板,经紫外消毒,用微量移液器在每孔中加入上述稀释好的药液,浓度由低到高,每孔50ul,至第13孔,第14孔加肉汤IO0ul(空白对照),第15孔加药液100ul(药物对照),第16孔加肉汤SOul(菌液对照),1一13孔及第16孔加入上述制备好的应用菌液,每孔SOul,加液完毕盖上消毒玻板,振荡混匀,放入垫有湿纱布的方盘内,36e培养18一24h,观察结果"中药制备每味中药及方剂均按水提法进行制备。
抑菌实验步骤
抑菌实验：待测菌金色葡萄球菌；枯草芽孢杆菌；大肠杆菌；绿脓杆菌菌种活化：菌种，进行活化，可以划线，也可以涂布，划线：直接用接种环在酒精灯上烧过之后，等之冷却，蘸取进行划线！涂布：用枪头吸取100ul的菌液涂布既可！本实验采用涂布法1.金色葡萄球菌最佳生长条件(过夜培养一般为12h)2. 枯草芽孢杆菌培养条件（过夜培养）3.绿脓杆菌最佳培养条件（14-17h）培养基MH（A）培养基( Mueller-Hinton Agar)成分：牛肉浸粉（牛肉膏） 5g；酪蛋白水解物 17.5g；淀粉 1.5g；琼脂 12.5gMH液体培养基配制方法：称取本品36.5克，加入1000ml蒸馏水中，加热煮沸溶解，分装，121℃高压灭菌15分钟备用。
牛肉膏蛋白胨固体培养基（LB培养基）：牛肉膏10 g，蛋白胨10 g，琼脂15g，NaCl 5 g，双蒸水1000mL，pH 7.2-7.5，121℃灭菌20min。
牛肉膏蛋白胨液体培养基：不加琼脂，其他同牛肉膏蛋白胨固体培养基。
菌悬液的配制将冰箱保存的大肠杆菌移接到牛肉膏蛋白胨固体培养基上，置于37℃恒温培养箱中培养24 h ，用接种环挑取少许菌体与装有无菌生理盐水的试管中，震荡均匀，制成菌悬液。
具体为用接种环挑取一环（本实验是吸取100uL 菌悬液）于5 mL 的无菌生理盐水中，每10倍稀释一次地逐级稀释，取（10-8、10-9、10-10 、10-11）的浓度100μL 做涂布实验，每个梯度平行三组，加100μL 药品溶剂（二甲基亚砜）的空白对照3个平板，完全不加任何样品即只是LB 培养基的完全空白对照1个平板，调整菌悬液浓度，用平板菌落法测定其菌液浓度，使其含菌体数为103 cfu/mL ，即为供试菌悬液。
抑菌作用初步筛选将灭菌固体培养基加热至熔化，待冷却至50℃时，每20ml 培养基倒入无菌培养皿中。
待平板自然晾干后，分别移取0.1ml 待测药品，0.1 mL 供试菌悬液，均匀涂布于加药平板上，每个处理3次重复。
抑菌实验检测操作规程
文件编号： SC-SOP-00300 第 1 页共 1 页
1. 目的：规范抑菌实验检测操作
2. 范围：适用于抗菌肽抑菌实验检测
3. 职责：实验室人员对本操作规程的实施负责。
4. 内容：
准备待检液：于离心管中按照300ul待检液加入1.2ml甲醇，浸提60min，然后3500rpm 离心15min，取上清液用孔径为0.22um的一次性过滤器过滤，滤液置于无菌容器待用待用。
准备培养基：LB液体培养基、NA固体培养基（胰蛋白胨5g/L、蔗糖10g/L、酵母浸粉2g/L、牛肉浸膏4g/L、氯化钠3g/L、琼脂粉20g/L），NA液体培养基（胰蛋白胨5g/L、蔗糖10g/L、酵母浸粉2g/L、牛肉浸膏4g/L、氯化钠3g/L），（备注：此处指示菌为黄单胞菌，如以其他菌作为指示菌请使用对应培养基。
灭菌：NA培养基115℃灭菌20min，LB培养基、移液枪头、打孔器等121℃灭菌20min。
活化：将黄单胞菌菌种转接到NA固体培养基上，30℃过夜培养然后转接到NA液体培养基中30℃、200rpm培养至液体浑浊待用。
抑菌：吸取黄单胞菌菌液50ul滴在NA固体培养基上，用灼烧过的涂布棒或灭菌过的玻璃珠涂布均匀，然后将打孔器灼烧后冷却，在该培养基上打孔四个，用灭菌牙签将琼脂块挑出，往一个孔中加入20ul无菌水或生理盐水作为对照，其他三个孔加入20ul待检液，30℃培养24小时观察
∗100%
抑菌率：抑菌率=对照菌落直径−菌落直径
对照菌落直径−打孔器外直径
5. 注意事项
5.1 注意无菌操作
5.2 必须进行重复以增加数据准确性。
抑菌试验操作规程
抑菌试验操作规程1．范围本规程适用于所有益生菌抑菌活性的测定。
2．试验前准备设备及器材：高温蒸汽灭菌锅，超净工作台，酒精灯，恒温摇床，恒温水浴锅，恒温培养箱，平皿（直径9cm），牛津杯（内径6mm，外径8mm，高10mm），移液管（10ml），微量移液器及吸头（1ml、200ul）。
3．操作步骤3.1 病原菌的制备3.1.1 病原菌：鸡致病性大肠杆菌，鸡致病性大肠杆菌，金黄色葡萄球菌。
3.1.2病原菌扩培：在超净工作台内，挑取一环病原菌接种于100 ml无菌的营养肉汤培养基中，接种完毕，将三角瓶置于摇床内固定，37℃，200 rpm，培养8~12h，即为扩培好的病原菌悬液。
3.2 检测样品的制备3.2.1 乳酸菌扩培：在超净工作台内，用5ml无菌生理盐水洗下菌苔，按1%的接种量，接种于一定体积的适宜培养基中，接种完毕，将三角瓶置于恒温培养箱内，37℃静置培养24~48h，即为扩培好的乳酸菌菌悬液。
3.2.2 芽孢杆菌扩培：在超净工作台内，用5ml无菌生理盐水洗下菌苔，按1%的接种量，接种于一定体积的适宜培养基中，接种完毕，将三角瓶置于恒温摇床内固定，在适宜条件下培养14~18h，即为扩培好的芽孢杆菌菌悬液。
3.2.3 无细胞发酵上清液的制备：在超净工作台内，吸取扩培好的乳酸菌（或芽孢杆菌）菌悬液10ml，移入到无菌的50ml离心管中，旋紧离心管盖，于8000 rpm/min，离心15min，离心结束后，于超净工作台中，吸取5ml上清液，用孔径为0.22μm的无菌滤器过滤，即为无细胞发酵上清液。
3.3 双层平板的制备3.3.1 制备琼脂含量为2.0%的MH肉汤培养基，冷却至60℃左右，用无菌吸管准确量取10ml该培养基，加入到水平放置的无菌平皿中，洁净工作台中晾干；3.3.2 用无菌镊子取6个事先灭过菌的牛津杯均匀放在上述倒有琼脂的平皿中，放置牛津杯时动作要轻；3.3.3 制备琼脂含量为1.0%的MH肉汤培养基，冷却至55℃左右（琼脂培养基可置于55℃的恒温水浴锅中保温），每100ml MH软琼脂培养基接种0.1ml指示菌，混合均匀；用无菌吸管准确量取10ml该培养基，加入到事先放好牛津杯的平板上，于超净工作台中晾干后，立即进行抑菌试验。
卫生部消毒技术规范-抗菌部分
抗菌测试方法抗菌测试前期准备1. 各种溶液的配置100ml液体培养基溶液：1.8g营养肉汤+100ml去离子水。
100ml固体培养基溶液：1.8g营养肉汤+1.5g琼脂粉+100ml去离子水。
100ml氯化钠溶液：1g氯化钠+100ml去离子水。
2. 高压灭菌为保证灭菌质量，高压灭菌时间适宜控制在20至30分钟之间。
3.乙醇消毒所有样品包括人手在进入超净工作台前，须用75%的乙醇彻底擦洗一遍。
4. 活化菌种用移液枪头挑取一个典型菌落，至于3ml液体培养基的试管中。
把试管放置于恒温培养箱中，37℃，培养24小时。
三种抗菌测试方法1．抑菌圈法取活化过的菌种100μl滴于含有固体培养基的平板中，并用涂布棒涂均匀，涂干（涂至表面没有水分为止）。
取抗菌膜（直径5mm左右），把含有抗菌成分的一面紧紧地压于涂干的平板上。
把平板倒置放于恒温培养箱中，37℃，培养18至24小时。
抑菌圈法示意图。
大圆为平板，四个小圆中有三个为抗菌膜，另外一个为不含有抗菌成分作为空白对照的膜。
2．平板计数法取活化过的菌种30μl滴于含有30ml液体培养基的锥形瓶中，在恒温摇床中培养2.5至3小时（细菌数约至于108个/ml)。
从锥形瓶中取100μl菌液分别均匀涂于含有抗菌膜和空白对照膜上，放置于恒温培养箱中，培养10小时。
取生理盐水10ml把膜上的细菌冲洗下来，用振荡器使其充分均匀分散。
从生理盐水中取100μl用十倍稀释法逐步稀释至细菌数为10到100个/ml（此梯度为最小梯度）。
从十倍稀释法稀释过后的细菌数（最小梯度）往上推两个梯度，分别为103个/ml和104个/ml，从此三个梯度中取100μl滴于含有固体培养基的平板中，并用涂布棒涂均匀，涂干（涂至表面没有水分为止）。
把平板倒置放于恒温培养箱中，37℃，培养18至24小时。
没有抗菌剂对照样按以上相同方法进行。
抗菌率计算：A为对照样的细菌数，B-为加有抗菌剂的细菌数。
3．吸光度法从活化过的菌种中取一定量的菌液分别滴于含有抗菌剂和不含有抗菌剂的液体培养基的锥形瓶中，使其在600nm波长的吸光度（OD600）在0.1～0.2。
作业指导书--抑真菌,抑细菌试验 (证明所采用的方法适合于该产品的无菌检查)
工 作 指 引名称:抑真菌,抑细菌试验1 适用范围适用于产品无菌检查时操作方法的验证,以证明所采用的方法适合于该产品的无菌检查.2 参考文件2.1 ISO11737-2 Sterilization of medical device — Microbiological — Part2: Tests ofsterility performed in the definition, validation and maintenance of a sterilization process. 2.2 ISO 13485 Medical devices — Quality management systems — Requirements forregulatory purposes2.3 中华人民共和国药典2015年版 二部 附录XI H 无菌检查法 2.4 COP093 定义3.1 无菌测试 test of sterility:灭菌开发,确认或重新确认的一部份,确定产品上是否存在活微生物的技术操作.3.2 抑细菌/抑真菌测试 bacteriostasis/fungistasis test:在无菌测试中,选择特定的微生物检定样品中存在的某些物质对特定微生物的抑制作用.3.3 样品份额sample item portion(SIP):从产品上取的用于测试的规定部分. 3.4 CFU:菌落形成单位colony-forming unit.4 职责4.1 实验员:具备微生物方面知识,熟悉测试操作. 4.2 实验工程师:熟悉测试,指导实验员测试.5 指引5.1 测试准备5.1.1 检测设备a) 生物安全柜 b) 恒温培养箱 c) 细菌过滤器 d) 高压蒸汽灭菌锅工 作 指 引名称:抑真菌,抑细菌试验5.1.2 检测用品a) 稀释液,冲洗液:0.1%蛋白胨水溶液,0.9 %NaCl,PH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液; b) 营养肉汤或胰蛋白胨大豆肉汤,胰蛋白胨大豆琼脂培养基,液体硫乙醇酸盐培养基;c) 剪刀,镊子,接种棒,微孔滤膜(0.45μm); d) 酒精灯,75%酒精,培养皿,培养缸/管,试管;5.1.3 根据检测需要,按规定要求配制好培养基,稀释液和冲洗液;5.1.4 将配制好的培养基,稀释液和冲洗液分装到三角瓶中密封并用白纸包住封口,微孔滤膜用水润湿放入培养皿中,剪刀,镊子,接种棒,培养皿,培养缸/管,试管,细菌过滤器不锈钢杯用分别用白纸包好,所有物品经121℃高压蒸气灭菌30min; 5.1.5 超声清洗机和细菌过滤器用75%酒精擦洗干净;5.1.6 实验前两小时打开生物安全柜,阳性对照室,更衣室的紫外灯进行环境消毒30min,在开启紫外灯时人员必须远离,以免灼伤眼睛和皮肤造成人身伤害; 5.1.7 所有检测用品,样品由传递窗递入阳性对照室.5.2 菌种及菌液制备5.2.1 菌种● 金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus) 〔ATCC 6538〕 ● 铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa) 〔ATCC 9027〕 ● 枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) 〔ATCC 6633〕● 生孢梭菌(Clostridium sporogenes) 〔ATCC 19404〕 ● 白色念珠菌(Candida albicans) 〔ATCC 10231〕 ● 黑曲霉(Aspergillus niger) 〔ATCC 16404〕 ● 大肠埃希菌(Escherichia coli) 〔ATCC 25922〕5.2.2 菌液制备a) 接种金黄色葡萄球菌,铜绿假单孢菌,枯草芽孢杆菌,大肠埃希菌的新鲜培养物至营养琼脂培养基上,接种生孢梭菌的新鲜培养物至液体硫乙醇酸盐培养基中,30～35℃培养18～24小时;b) 接种白色念珠菌新鲜培养物至改良马丁琼脂培养基或胰蛋白胨大豆琼脂培养基上,23～28℃培养24～48小时;c) 上述培养物用0.9无菌氯化钠溶液制成每1ml 含菌数小于100cfu 的菌悬液;工 作 指 引名称:抑真菌,抑细菌试验d) 接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂培养基或胰蛋白胨大豆琼脂培养基斜面上, 23～28℃培养5～7天,加入3～5ml 含0.05%吐温80的0.9%无菌氯化钠溶液,将孢子洗脱,然后用适宜的方法吸出孢子悬液至无菌试管内,用含0.05%吐温80的0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml 含孢子数小于100cfu 的孢子悬液;e) 菌液制备后若在室温下放置,应在2小时内使用,若保存在2～8℃,可以24小时内使用,黑曲霉孢子悬液可保存在2～8℃,在验证过的贮存期内使用.5.2.3 培养基接种a) 取每管装量为12ml 的液体硫乙醇酸盐培养基9支,分别接种小于100cfu 的金黄色葡萄球菌,铜绿假单孢菌,生孢梭菌,大肠埃希菌各2支,另1支不接种作为空白对照,培养3天,逐日观察结果;b) 取每管装量为9ml 的胰蛋白胨大豆肉汤7支,分别接种小于100cfu 的白色念珠菌,枯草芽孢杆菌,黑曲霉各2支,另1支不接种作为空白对照,培养5天,逐日观察结果.5.2.4 结果判断:空白对照管应无菌生长,若加菌的培养基管生长良好,判该培养基的灵敏度检查符合规定.5.3 薄膜过滤法5.3.1 取每种培养基规定接种的供试品总量按薄膜过滤法过滤,冲冼,在最后一次的冲洗液中加入小于100cfu 的试验菌,过滤;5.3.2 取出滤膜接种至液体硫乙醇酸盐培养基或胰蛋白胨大豆肉汤培养基中,或将培养基加至滤筒内;5.3.3 另取一装有同体积培养基的容器,加入等量试验菌,作为对照; 5.3.4 置规定温度培养3～5天.各试验菌同法操作.5.4 直接接种法5.4.1 取符合直接接种法培养基用量要求的液体硫乙醇酸盐培养基8管,分别接入小于100cfu 的金黄色葡萄球菌,大肠埃希菌,生孢梭菌,铜绿假单孢菌各2管;5.4.2 取符合直接接种法培养基用量要求的胰蛋白胨大豆肉汤培养基6管,分别接入小于100cfu 的白色念珠菌,枯草芽孢杆菌,黑曲霉各2管;5.4.3 其中1管接入每支培养基规定的供试品接种量,另1管作为对照,置规定的温度培工 作 指 引名称:抑真菌,抑细菌试验养3～5天.5.5 结果判断5.5.1 与对照管比较,如含供试品的各容器中的试验菌生长良好,则说明供试品的该检验量在该检验条件下无抑菌作用或其抑菌作用可以忽略不计,照此检查方法和检查条件进行供试品的无菌检查;5.5.2 如含供试品的任一容器中的试验菌生长微弱,缓慢或不生长,则说明供试品的该检验量在该检验条件下有抑菌作用,应采用增加冲洗量,增加培养基的用量,使用中和剂或灭活剂,更换滤膜品种等方法,消除供试品的抑菌作用,并重新进行方法验证试验.备注:方法验证试验可与供试品的无菌检查同时进行,或外发至具有微生物检验资质的实验室进行.6 文件保存期限相关检测报告保存10年.7 附录:无工 作 指 引名称:抑真菌,抑细菌试验修订履历。
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杀菌和抑菌试验操作规范
一、总则
适用范围：本方法适用于医疗、卫生、食品等行业的杀菌和抑菌试验。
引用标准：消毒技术规范2002
二、术语
消毒 disinfection
杀灭或清除传播媒介上病原微生物,使其达到无害化的处理。
灭菌 sterilization
杀灭或清除传播媒介上一切微生物的处理。
消毒剂 disinfectant
用于杀灭传播媒介上的微生物使其达消毒或灭菌要求的制剂。
灭菌剂 sterilant
可杀灭一切微生物(包括细菌芽孢)使其达到灭菌要求的制剂。
杀灭时间 killing time, KT
用于生物指示物抗力鉴定时, 指受试指示物样本，经杀菌因子作用不同时间后, 培养后的全部样本均无菌生长的最短作用时间 (min)
杀灭率 killing rate, KR
在微生物杀灭试验中，用百分率表示微生物数量减少的值，以其表达杀灭效果。
灭对数值 killing log value
微生物数量以对数表示时，消毒后与消毒前比较, 以其减少的对数值来表达杀灭效果。
三、菌悬液与菌片的制备
(一) 试验前应选择合适的细菌，在下述规定中表中‘+’为必做试验的微生物，根据消毒剂特定用途或试验特殊
需要，还可增选其他菌株。
(二) 试验器械
A. 无菌蒸馏水
B. 细菌培养基：胰蛋白胨大豆琼脂培养基（TSA），胰蛋白胨大豆肉汤培养基（TSB）和营养肉汤培养基等
C. 刻度吸管（1.0ml、5.0ml、10.0ml），毛细吸管。
D. 数字可调移液器（10μl~200μl）及配套用一次性塑料吸头。
E. 浊度计
F. 游标卡尺
(三) 细菌繁殖体悬液的制备
1 取冻干菌种管，在无菌操作下打开，以毛细吸管加入适量营养肉汤，轻柔吹吸数次，使菌种融化分散。
取含 5.0 ml～10.0ml 营养肉汤培养基试管，滴入少许菌种悬液，置 37 ℃培养18h～24h。
用接种环取第 1 代培养的菌悬液，划线接种于营养琼脂培养基平板上，于 37℃培养 18h～24h。
挑取上述第
2 代培养物中典型菌落，接种于营养琼脂斜面，于 37℃培养 18h～24h，即为第
3 代培养物。
2 取菌种第 3代～14 代的营养琼脂培养基斜面新鲜培养物（18h～24h），用 5.0ml 吸管吸取 3.0 ml～5.0ml 稀释液加入斜面试管内，反复吹吸，洗下菌苔。
随后，用5.0ml 吸管将洗液移至另一无菌试管中，用电动混合器混合（振荡）20s，或在手掌上振敲 80 次，以使细菌悬浮均匀。
3 初步制成的菌悬液，先用细菌浓度比浊测定法粗测其含菌浓度，然后以稀释液稀释至所需使用的浓度。
4 细菌繁殖体悬液应保存在 4℃冰箱内备用。
应当天使用不得过夜。
5 怀疑有污染时，应以菌落形态、革兰染色与生化试验等法进行鉴定。
四、菌片的制备程序
1 滴染法染菌时，先用浊度计测定的菌悬液浓度，调至含菌量为1～5×108cfu/ml将经灭菌的载体片平铺于无菌平皿内，菌液滴加量每片为10μl。
用10μl移液器接灭菌塑料吸头，滴染菌液，并用接种环涂匀整个载体表面。
滴染菌液后，染菌载体可置37℃温箱内烤干（约20min～30min），或置室温下自然阴干后再使用。
2 每个菌片的染菌量，即回收菌数，按活菌培养计数所得结果，应为 5×105 cfu/片～5×106 cfu/片。
3 配制菌悬液和制备菌片时，保持环境的洁净和安静，严格按无菌要求操作，以防污染杂菌，影响随后杀菌试验的结果。
五、活菌培养计数技术
1 取含 5.0ml 稀释液无菌试管，对菌片或小型固体样本直接投入即可，对棉拭则将其采样端剪入管内，每管一份样本。
而后，用手掌上用力振敲 80 次，形成菌悬液。
2 将试管按需要数量分组排列于试管架上，每管加入 4.5ml 稀释液。
各组由左向右，逐管标上 10-1、10-2、10-3......等。
3 将菌悬液样本在手掌上用力振敲 80次，吸取 0.5ml加至 10-1 管内。
4 将 10-1 管依前法在手掌上用力振敲 80次，混匀，再吸取出 0.5ml 加入10-2 管内。
如此类推，直至最后一管。
5 选择适宜稀释度试管（以预计生长菌落数每平板为 30cfu～300cfu 者为宜），吸取混合均匀的悬液 1.0ml 加于无菌平皿内。
每一稀释度接种 3个平皿。
需接种2个～3个不同稀释度。
6 将冷至 40℃～45℃的熔化营养琼脂培养基，倾注于已加入样液的平皿中，每平皿 15ml～20ml。
置 37℃温箱内培养
7）每日观察细菌生长情况。
培养至规定时间（细菌繁殖体为 48h，白色念珠菌与细菌芽孢为 72h），计数最终结果的菌落数。
六、杀菌试验
1 首先按产品说明书要求配制消毒液。
一律使用无菌硬水配制，配制的浓度为待测浓度的1.25倍，置20℃±1℃水浴备用。
取已配制浓度为1×108cfu/ml～5×108cfu/ml,(实际作用时菌浓度为107cfu/ml）。
在无菌大试管，先加入0.5ml有机干扰物质，再加入0.5ml试验用菌悬液，混匀，置 20℃±1℃水浴中5min后，用无菌吸管吸取上述浓度消毒液 4.0 ml 注入其中，迅速混匀并立即记时。
2 待菌药相互作用至各预定时间，分别吸取 0.5ml 菌药混合液加于 4.5ml 经灭菌的中和剂中，混匀。
3 各管菌药混合液经加中和剂作用 10min 后，分别吸取 1.0ml样液，按活菌培养计数方法测定存活菌数，每管样液接种 2 个平皿。
如平板上生长的菌落数较多时，可进行系列10倍稀释后，再进行活菌培养计数。
4 同时用稀释液代替消毒液，进行平行试验，作为阳性对照。
5 所有试验样本均在 37℃温箱中培养，对细菌繁殖体培养48h 观察最终结果；对细菌芽孢需培养 72h 观察最终结果。
6 试验重复3次，计算各组的活菌浓度（cfu/ml），并换算为对数值（N），并按下式计算杀灭对数值：
杀灭对数值 (KL)＝对照组平均活菌浓度的对数值（No）-试验组活菌浓度对数值（Nx）
1) 在悬液定量杀灭试验中,各次试验阴性对照无菌生长，阳性对照回收菌数在1×107cfu/ml～5×107cfu/ml范围内，各次试验的杀灭对数值均≥5，为消毒合格。
2) 在载体定量杀灭试验中，各次试验阴性对照无菌生长，阳性对照回收菌数在5×105cfu/片～5×106 cfu/片范围内，各次试验的杀灭对数值均≥3，为消毒合格。
3) 空气消毒实验室试验和模拟现场试验，各次试验阴性对照无菌生长，阳性对照菌数均在5×104 cfu/m3～5×105cfu/m3范围内，各次试验的杀灭率≥99.90%，现场试验各次自然菌消亡率≥90.00%,为消毒合格。
七、抑菌试验
1) 抑菌片的制备：取无菌并干燥的滤纸片。
每片滴加抑菌剂溶液 20μl，后将滤纸片平放于清洁的无菌平皿内，开盖置温箱(37℃) 中烤干，或置室温下自然干燥后备用。
溶出性抗（抑）菌产品，可直接制成直径为 5mm，厚不超过 4mm圆片(块)，每 4 片(块) 一组。
2) 阴性样片的制备：取无菌干燥滤纸片，每片滴加无菌蒸馏水 20μl，干燥后备用。
溶出性抗（抑）菌产品的阴性对照样本，取同种材质不含抑菌成份的相同大小的样品。
3) 试验菌的接种：用无菌棉拭子蘸取浓度为 5～5×106cfu/ml 试验菌悬液，在营养琼脂培养基平板表面均匀涂抹3次。
每涂抹1次，平板应转动 60°，最后将棉拭子绕平板边缘涂抹一周。
盖好平皿，置室温干燥 5min。
4) 抑菌剂样片贴放：每次试验贴放1个染菌平板，每个平板贴放4片试验样片，1 片阴性对照样片，共 5 片。
用无菌镊子取样片贴放于平板表面。
各样片中心之间相距 25mm以上，与平板的周缘相距 15 mm 以上。
贴放好后，用无菌镊子轻压样片，使其紧贴于平板表面。
盖好平皿，置37℃温箱，培养16h～18h 观察结果。
用游标卡尺测量抑菌环的直径 (包括贴片) 并记录。
试验重复3次。
5) 测量抑菌环时，应选均匀而完全无菌生长的抑菌环进行。
测量其直径应以抑菌环外沿为界。
6)评价规定
抑菌作用的判断：
抑菌环直径大于 7mm 者, 判为有抑菌作用。
抑菌环直径小于或等于 7mm 者, 判为无抑菌作用。
3 次重复试验均有抑菌作用结果者, 判为合格。
阴性对照组应无抑菌环产生。
否则试验无效。