茶氨酸的制备及应用研究进展)

茶氨酸的制备及应用研究进展

江春柳“2孙云1岳鹏翔2

(1福建农林大学园艺学院茶学系福建福州350002

2大闽食品(漳州)有限公司博士后科研工作站福建漳州 363000) 茶叶含有多种活性成分，其中有三大茶叶提取

物已得到公认，即茶多酚(儿茶素)、茶多糖和茶

氨酸。被称为“天然镇静剂”的茶氨酸已成为近几

年国际市场上最热销的天然保健产品“新宠”之一。

茶氨酸(L．Theanine)系统命名为：N．乙基吖一L一谷氨

酰胺Ⅲ一ethyl—L—glutamine)，是1950年日本学者酒户

弥--fig在研究玉露茶鲜爽滋味成分的过程中，从新

梢中分离鉴定出的非蛋白特征氨基酸?。迄今为

止，除在茶梅、山茶、油茶、蕈等四种天然植物中

检测出其微量存在外，其他植物中尚未发现茶氨酸删。

茶氨酸占干茶总重的l％～2％，占茶树体内游离

氨基酸总量的50％以上口1。自然界存在的茶氨酸均

为L型，纯品为白色针状结晶，熔点217～218℃，

比旋光度【Q】％=o．70，极易溶于水，其味阈值为0．06％，具有焦糖香和类似味精的鲜爽味，能消减咖啡碱和

儿茶素引起的苦涩味，是茶叶中的重要呈味物质，

还可以缓解其它食品的苦味和辣味，达到改善食品

风味的目的u’2。1。

1茶氨酸的制各方法

自然界中L．茶氨酸含量极少，近20年来对茶

氨酸的制备开发得到了茶学、食品、精细化工及制

药等领域众多研究者的关注，并通过各种途径制备

和生产茶氨酸。茶氨酸的主要制备途径有：化学合

成法、微生物发酵制备法、植物组织培养法和天然

茶氨酸的提取分离法。

1．1化学合成法

化学方法合成茶氨酸，已有大量的研究报道和

专利发表，比较成熟的主要有以下三种：

(1)L．谷氨酸加热脱水生成L一吡咯烷酮酸，

加铜盐后，与无水乙胺反应，最后进行脱铜反应生

产L-茶氨酸。谷氨酸的吡咯烷酮化法采用无水乙

胺(沸点为17℃)为原料，在高压条件下合成茶

氨酸，对生产设备、安全性都提出很高要求，且反

应时间长。

(2)用N．取代的L．谷氨酸酯的乙胺解反应产

生N．取代L．茶氨酸，再脱除保护基获得L一茶氨酸。

酒户弥二朗嗡1于1950年提出以L．谷氨酸．丫．乙基酯

为原料，采用氯甲酸苄酯保护氨基后，与乙胺水溶

液反应，再用Pd／C催化还原合成L一茶氨酸。该法

的缺点是需要用贵金属钯作催化剂，生产成本高。

王三永，李晓光m1等受此方法启示，改用三苯基氯

甲烷保护氨基，在40℃脱去下反应48 h，接着与

乙胺水溶液在室温下反应48 h，再在乙酸水溶液中

回流5 min脱去三苯甲基，得到L．茶氨酸，产率为

39％，质量分数大于98％。此法存在反应时间过

长，产率低等缺点。

(3)L．谷氨酸甜氨基用保护基保护，使其分子

内脱水生成环状L．谷氨酸酐后，直接与乙胺作用

生成N．取代L．茶氨酸，再除去保护基得到L．茶氨

酸。钱绍松，陈然m等以廉价的L一谷氨酸为原料，

采用邻苯二甲酰基作为保护基，保护L一谷氨酸的

小氨基，醋酐回流10 rain使其分子内脱水生成N一

邻苯二甲酰．L．谷氨酸酐，在常温、常压条件下，

分别与2 mol／L氨水和2 mol／L乙胺水溶液反应生

成中间产物N．邻苯二甲酰．L一谷氨酰胺、N-邻苯二

甲酰．L广茶氨酸，中间产物在室温条件下与0．5 moI_IL

水合肼反应48 h脱除保护基，分别以57％、61％

的回收率得到L一谷氨酰胺和L．茶氨酸。

化学合成法具有价格低、成本低、易于工业化

的优点。但是化学合成法存在原料不易得、有污染、

有毒性和难于提纯等缺点。而且化学合成直接得到

的茶氨酸都是D，L．型消旋体，需要进行拆分才能

得到L．型产品【l】。利用微生物发酵生产的酶拆分

D，L广茶氨酸一定程度上解决了化学合成茶氨酸的技术难题。郭丽芸，刘毅埔1等人已成功的利用刺孢

小克银汉霉9980(Cunnighamelia echinulata 9980，

CE 9980)，拆分N．乙酰一D，L．茶氨酸获得光学纯

的L．茶氨酸，此外米曲霉氨基酰化酶旧1也可以用于

D，L一茶氨酸的拆分。

1．2徽生物发酵制各法

近几年来，随着生物技术的发展和应用，利用

微生物发酵来生产酶，再利用酶的提取物来生产茶

氨酸的方法被广泛应用。日本最初从硝基还原假单

孢菌(Pseudomonas nitroreducens)中提取谷氨酰

胺酶。谷氨酰胺酶具有水解谷氨酰胺和谷氨酰基转

移能力，能将谷氨酰胺基团转移到乙胺上，形成茶

氨酸。通过添加1．5 moFL的乙胺，使其与0．7 moFL

的谷氨酰胺反应，可以生成茶氨酸270 mmol／L(47

g／L)n0‘。此外，日本立木隆等从自然界的土壤中

分离、选定的香茅醇假单孢菌GEA是属于假单孢

菌属香茅种(Citrondlosis)，具有Y一谷氨酰基转移

反应的茶氨酸生产菌。该菌在pH 9～10，O．3 moFL

的乙胺和0．9 moFL的谷氨酰胺条件下反应，能得

到40 g／L的茶氨酸[Ill。茶氨酸的合成还可以运用

细菌中的谷氨酰胺合成酶提取物在特殊的条件下

(高乙胺浓度和特定的pH值)进行非特异反应?，

但谷氨酰胺属于连接酶，需要提供能量ATP。在

200 mmol／L谷氨酸钠，1．2 m01／L乙胺，300 mmol／L 葡萄糖，50 nunol／L磷酸钾缓冲盐的条件下，通过

添加1 00 U／mL的谷氨酰胺合成酶和60 mg／mL的

酵母细胞，48 h内就能合成170 mmoFL(30 g／L)

茶氨酸u“。

随着人们对丫．谷氨酰转肽酶(丫．Glutamyltran speptidase，7-GGT)催化机理及分子结构的不断深

入，利用GGT制备系列卜谷氨酰基类化合物的研

究已成为生物催化领域的热点u引。，／-GGT，是生物

体内谷胱甘肽代谢的相关酶之一。1，．GGT既可以

催化转移丫．谷氨酰基化合物上的丫一谷氨酰基到氨

基酸、多肽等受体上，也可以催化Y一谷氨酰基化

合物水解反应生成r谷氨酸n利。1986年日本京都

大学的Hideyuki Suzuki分离纯化了大肠杆菌K一12

中的p谷氨酰基转肽酶，通过基因工程方法构建得

到产酶的菌株Escherichia coli K．12strain SH642，

在200 mmoFL L-谷氨酰胺，1．5 mol／L乙胺，0．4

U／mL GGT，37℃，2 h合成L．茶氨酸，得到120 mmoFL茶氨酸，谷氨酰胺转化率达60％n副。2007

年王丽鸳，王贤波“刮等人将E．coli DH5a的7-GGT

基因，转入到pET-32ar中，构建了具有较高茶氨

酸生物合成能力的基因工程菌，以L．谷氨酰胺和

盐酸乙胺为底物可生产29．40 g／L的茶氨酸，L．谷

氨酰胺转化率为48．22％，低于Suzuki等60％的

谷氨酰胺转化率u“。

利用微生物发酵或酶法生产茶氨酸涉及到酶

活性的保持及反应条件，如底物浓度、温度和pH

等的调控问题。这些条件与转化率、产率及生产效

率关系密切。技术条件要求高，操作复杂，工业化

生产难度较大。

1．3植物组织培养法生产茶氨酸

植物组织培养法生产茶氨酸就是采用茶树细

胞培养来产生茶氨酸，或者采用茶树愈伤组织培养

来产生茶氨酸，然后通过离子交换法从茶树愈伤组

织中提取茶氨酸Ⅲ1。

人们用14C标记的方法早已证实了茶树中茶氨

酸的合成前体是谷氨酸和乙胺n1。茶树愈伤组织有

合成茶氨酸的能力。日本学者已经证实向培养基中

添加盐酸乙胺时，可大幅度提高愈伤组织中的茶氨

酸合成量n8“引。吕虎口0。、钟俊辉但¨等研究也表明，添加盐酸乙胺后对茶氨酸合成量的影响非常明显。