Vero细胞的微载体培养_放大过程中的接种工艺
【2019年整理】使用微载体在生物反应器中制备Vero细胞狂犬病疫苗的试验(1)
使用微载体在生物反响器中制备Vero 细胞狂犬病疫苗的试验一、资料1、微载体GE 企业 Cytodex 1 ，25g2、生物反响器上海日泰企业 Cellipower 5L，工作体积 3.5L加微载体 25g（约 7g/L ）3、细胞、毒种、培育液二、操作过程1、微载体办理、反响罐准备取微载体 25g 用 PBS溶液清洗几次后室温下浸泡膨胀留宿。
弃去上清液，将载体转移到 2L 瓶内加入 PBS约 1L，灭菌后备用。
将微载体装到生物反响罐内，换上新的PBS溶液4L，安装好生物反响罐灭菌（126℃*80min ）。
2、生物反响器校订、调试反响罐灭菌前调试生物反响器，保证能正常运转，各参数正常。
用 pH 为 7.0/10.0的标准缓冲液校订 pH电极 2 次。
灭菌后，温度 37℃校订 DO电极。
3、预培育DO 电极校订完后，封闭进气，停止搅拌，过15 分钟待载体沉降后排空上清液，加入 199 培育液 3 L 浸泡办理载体，浸泡 3 小时后相同封闭进气停止搅拌 15 分钟后排空上清液，加入 7.5%重生牛血清培育液 3L ，设置温度 37℃、 pH7.2、DO 50、搅拌转速 60RPM，预培育留宿，留神反响器运转能否正常，各参数能否稳固能调控。
4、接种细胞接种细胞当日先排空反响罐内预培育的 7.5%重生牛血清培育液，从头加入 7.5% 重生牛血清培育液 3L ，设置温度 37℃、 pH7.2、DO50、搅拌转速 60RPM。
待温度稳固在 37℃后取样校订 pH 值，而后准备接种细胞。
封闭温度、 pH、DO 控制，封闭进气，搅拌转速设为 30RPM，将适当细胞悬液慢慢加入反响罐内，接种细胞总数为 1.8*10 9个（密度约 5*105个/ml ），温度慢慢调回 37℃，接种细胞后 2 小时开始进气，开启 pH、DO 控制，设置温度 37℃、 pH7.2、DO50、搅拌转速 30RPM。
搅拌转速在接种细胞 4 小时后设为 40RPM、5 小时后设为 50RPM、6 小时后设为 60RPM，开始进入细胞培育阶段。
VERO细胞培养
对数生长期 细胞数随时间变化成倍增长，活力最佳，最适合进行实验研究
平台期
细胞长满瓶壁后，细胞虽有活力但不再分裂 机制：接触抑制、密度依赖性 相互接触后，如培养的是正常细胞，由于细胞的相互接触能抑制细胞的运动，这种现
象称接触抑制（Contact Inhibition）。 当细胞密度进一步增大，培养液中营养成分减少，代谢产物增多时，细胞因营养的枯
VERO细胞培养
细胞培养技术
从生物体内取出组织或细胞，在体外(in vitro)模拟体内生理环境，在无菌、适当温度 和一定营养条件下，对这些组织或细胞进行孵育培养，使之保持一定的结构和功能，以 便于我们观察研究，这种方法就是细胞培养（cell culture）。有时细胞培养也称为组 织培养（tissue culture)。
意大利I.A.Z. 欧洲细胞实验室列表（大全）
上海午立生物技术有限公司细胞株
意大利IZSLER细胞库
中国医学科学院基础医学研究所细胞中心保藏细 胞目录 上海华大天源生物科技有限公司提供高
细胞库
ATCC:American Type Culture Collection (美国标准培养物收集所) ECACC:European Collection of Cell Cultures(欧洲动物细胞库 ) JCRB:Japanese Collection of Research Bioresources(日本细胞库) CCTCC:China Center for Type Culture Collection (中国典型培养物保藏中心)
塑料制品特点：质软、易出现划痕；耐腐蚀能力强、但不耐热。
1、针式滤器帽不能泡酸液,用2％氢氧化钠泡6-12小时,或者煮沸20分钟,在包装之前要装好滤膜两 张，安装滤膜时注意光面朝上(凹向上)，然后将螺旋稍微拧松一些，放入铝盒中在高压锅内 15磅30分钟消毒，再烘干备用。
大规模培养细胞技术
[9]张立,严春,范卫民,等.Vero细胞的微载体培养——放大过程中的接种工艺[J].华东理工大学学报,1998,24:659~663
[10]Zhang L,Zhang Y,Yan C,et al.The culture of chicken embryo fibroblast cells on microcarriers to produce infectious bursal disease virus[J].App Biochem Biotechnol,1997,62:291~30
2.1.3
巨载体培养，是相对微载体和细胞而言的。在这种培养方式中，细胞虽然也像微载体一样贴附于固定的表面生长，但巨载体在生物反应器中是固定的，不因为搅拌而跟随培养液一起运动。
2.2悬浮培养
细胞悬浮培养是指在反应器中自有悬浮生长的过程。悬浮培养系统主要用于非贴壁依赖性细胞的培养。杂交瘤细胞的悬浮培养是研究得最广泛和透彻的动物细胞培养过程，培养规模最大，操作最成熟。近年来，随着无血清培养技术的发展，越来越多的贴壁依赖性细胞被驯化适合于无血清悬浮培养，例如重组CHO细胞和BHK细胞的大规模悬浮培养都获得了成功[11]。
大规模
摘要：细胞培养工作始于20世纪初，现已广泛应用于生物学、医学各个领域，成为细胞与组织研究的重要技术之一。近年来，随着基因工程和细胞工程技术的不断发展，动物细胞培养已成为大规模生产一系列有商品价值的生物制品的重要宿主，当前人们已经能够生产多种单克隆抗体、激素、细胞因子、病毒疫苗和具有特殊功能的效应细胞等。但是，实验室采用的细胞培养技术获得的细胞量有限，不能满足生产的需求，必修改用超产培养技术方法方可获得大量细胞，目前这种技术种类繁多，归纳起来有三大类：①贴壁培养法；②悬浮培养法；③固定化培养法。细胞体外培养技术的不断发展和完善，为组织和器官培养以及现代生物技术前沿的转基因动物技术、克隆技术、干细胞定向分化、体外受精、性别控制等一系列技术的发展奠定了基础。
Vero细胞在微载体上生长的形态变化的电镜观察
Vero细胞在微载体上生长的形态变化的电镜观察邵曼君，姜蕾(中国科学院化工冶金研究所，多相反应开放实验室，北京100080) 高洪亮、丛威(中国科学院化工冶金研究所，生化工程国家重点实验室，北京100／)80)摘要使用环境扫描电镜(ESEM)．现察了Vcro细^邑在C：mxlex-3微栽体表面上贴卅铺展过程厦增殖生长过程中的形态变化，显示了细胞在微巍体上的贴附与蝻展的过程和行为，发现了细目雌微栽体上的增殖生长以细胞群落延伸扩展的形式进行；通过对细胞同步化前后细胞形态的对比，发现在同步化后太多数处于分裂期时的细胞体积大于同步化前正常培养的细胞(大多数处于生长前期)体积．考察了外i臣的屡街粘连蛋白对妇幢铺曩彤托的影响．关犍词Vcro细胞生长细胞形态变化环境扫描电镜1引言细胞行为和细胞的生理状态密切相关，观察细胞生长过程中的细胞形态及其变化．可以分析细胞行为，得到状态的信息，是细胞培养研究中的主要环节之一。
特别是在贴壁依赖性动物细胞(Veto细胞．一非洲绿猴肾细胞)的微载体培养系统中，细胞在微载体上的贴附及铺展，与细胞的分裂及生长有关；细胞在微载体上的贴附概率及贴附位置对细胞的生长有影响，这些问韪吸引着众多科学家们进行着有关的研究【I。
l。
光学显微镜是观察细胞形态最常用的仪器，但光学显微镜因其放大倍数的局限性t很难观察到细胞的细节。
随着科学仪器的发展，常规的扫描电子显微镜(SEM)及透射电子显微镜(TEM)已被用于观察细胞的形态和内部的细微结构。
这两种电镜虽然有放大倍数高，SEM还有景深大的优点．得到的高倍图象十分清晰、信息量很大，但是生物样品的制备过程十分复杂，使其应用受到了限制。
90年代开发的环境扫描电子显微镜(ESEM)是一种新型的扫描电子显微镜，特别适用于生物样品(含水样品)的观察。
它的主要优点是非导体样品可咀不经过表面金属化而直接观察【3J．这就使生物样品的制备十分简单。
在国外，ESEM已被广泛地应用于生命科学研究中。
吉林农大动物微生物学试卷【B】【答案】【5108】
课程名称：动物微生物学（B）考试时间：2012年7 月18 日学生所在学院：动科专业：动医班级：5108-1、2、3、4 教师所在学院：动科学院教师姓名：胡桂学一、解释概念（共20题，每题1分，计20分）1．菌苔：菌落连成片形成的结构，称为菌苔。
2．细菌素：某些菌株产生的一类具有抗菌作用的蛋白质，其作用范围狭窄，仅对与产生菌有亲缘关系的细菌有杀伤作用。
3．细菌的条件致死突变株：在某种条件下，某菌株经基因突变后可正常生长、繁殖并实现其表型，而在另一条件下却无法生长、繁殖的突变类型。
4．过路菌：有的微生物是从动物所接触的自然环境或食物中污染的，称为过路菌。
5．细菌的株：又称品系，是指同种细菌中不同来源的纯培养物。
6．条件性病原微生物：有些病原微生物长期生活在动物体内，只在一定条件下才表现除致病作用，这类微生物称为条件性病原微生物，如肠道内的大肠杆菌、禽巴氏杆菌和人肺炎双球菌。
7．防腐：应用各种化学药品防止和抑制微生物生长繁殖的方法叫防腐，也称抑菌。
8．病毒粒子：也叫毒粒（Virion），是专指结构上和功能上完整的成熟的病毒颗粒，有固定的形态和大小，而且一般都有侵染性。
9．细胞的微载体培养：通过搅拌作用，使微载体处于悬浮状态，但以微载体为支架，细胞贴壁于微载体的表面。
10．病毒吸附蛋白（Virus attachment Protein，VAP）：是指存在于病毒表面，能够被受体蛋白识别的病毒结构。
如衣壳蛋白或包膜上的糖蛋白突起。
其与病毒的宿主范围、组织嗜性及致病性有关。
11．病毒的感染复数（multiplicity of infection，m.o.i）：是指用以起始病毒感染的每个细胞所需的病毒颗粒数目，单位（PFU/cell）。
12．病毒的缺陷干扰颗粒：缺陷病毒不能复制，能干扰同种成熟病毒体进入细胞，被称为缺陷干扰颗粒（defective interfering particles，DIP）。
13．传代细胞：是指能在体外持续增殖传代的细胞，大多数由癌细胞（如HeLa细胞）或二倍体细胞突变（如中国地鼠卵巢细胞系，CHO）而成。
Vero细胞的微载体培养_放大过程中的接种工艺
79
90
100
100
贴壁率, 结果如表 2。从表中 3 U nder the m icro scope, 1 000 m icrocarriers w ere num bered random ly and the
p lating rate w as defin ited as:
可以看出, 当新球比例增加 时, 细胞贴壁率降低, 同时贴
三次, 再用戊二醛固定, 样品由华东理工大学分析测试中心电镜室处理后拍照。
2 结果与讨论
2. 1 细胞生长状态对球转球的影响 转瓶中微载体浓度为 3g L , 当微载体上细胞分别长到: ① 微载体上没有完全被细胞贴
满, ② 微载体上已被细胞贴满, ③ 微载体上的细胞已长成多层时, 补加新的微载体 2g L , 以后 每天取样计数光球数和满球率, 结果如表1。从表1可以看出, 当微载体上细胞已长到致密单 层时补加微载体, 可使新的微载体上较快地有细胞贴附, 贴壁率很快达到 100% , 其他两种情 况需要较长时间贴壁率才能达到 100%。 这可能由于球间转移方式是通过细胞粘附搭桥生长 或单个细胞迁居生长[6]。 当细胞生长旺盛时, 细胞搭桥生长或迁居生长能力强; 当微载体上细 胞长满时, 细胞向外生长的趋势明显, 因而更易进行球转球 (见图 1)。因此, 当微载体上已被细 胞贴满时, 补加适量微载体进行球转球时机最好。
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第6期
张 立等: V ero 细胞的微载体培养
·661·
2. 2 新老球比例对球转球 的影响
3∶3 3∶2 2∶1
vero细胞生产流感疫苗
在滚瓶中的接种准备 （代数133－138）
在Cytodex3微载体上的细胞扩增 （生物反应器步骤1、2、3）
病毒繁殖 （裂解过程）
细胞分离 （收获）
大流行流感和季节性流感疫苗的生 产工艺
用于生产的病毒株的准备是关键的一步。病毒扩增按三步进 行，命名为病毒种子库、工作库和生产库。这使得我们可以确 保一种为商业生产持续和长期的病毒供应。最后，生产病毒库 被用于感染6000升规模的生物反应器生产，紧接着进行许多 已经建立完善的下游单元操作 (图4)。
1988年，传代数为124
MCB (主要种子细胞库) 传代数为128 (全面检测为无致
瘤性、无外源因子，同源一致性/遗传学稳定性)
细胞库:
WCB (工作种子细胞库) 传代数为133 标准质量控制检测项目： - 细菌和真菌无菌检测 - 支原体 - 外源因子
Vero细胞在过去的二十多年里已获准用于生 产人用疫苗 (例如脊髓灰质炎和狂犬病疫苗)。 虽然Vero细胞对多种病毒敏感，可是最初流 感病毒在Vero细胞上的努力失败了 (1，2)。 Baxter Healthcare现已开发出一种能够生产高 效价的季节性流感和禽流感人用疫苗的技术 (表2)，也可以生产大多数其他的人用和兽用 疫苗 (表3)。在文献 (3，4，5) 中描述了Vero细 胞技术用于疫苗开发和生产的原理和前景。
流感病毒能够在多种动物细胞内繁殖, Baxter公司专注于Vero细胞， 一种可传代的猴肾细胞，其特征如表1所述。
表1.Baxter的Vero细胞平台背景资料
从ATCC (美国典型微生物菌种保藏中心) 获得的非洲
来源:
绿猴 (Cercopithecus aethiops) 肾细胞ATCC CCL81，
微生物报告
1.产品的意义：目前恶性肿瘤已超过心脑血管类疾病成为首位人类致死性疾病, 采用Vero细胞培养技术生产的重组溶瘤性Ⅱ型单纯疱疹病毒(HSV-Ⅱ)具有良好的溶源性、靶向性和安全性, 具有重要的应用价值。
国内人类肿瘤疫苗的有关研究处于刚起步状态，面临多重难题，建立高效的肿瘤疫苗生产工艺具有非常重要的社会和经济价值。
经过重组减毒的Ⅱ型溶瘤单纯疱疹病毒作为高效新型病毒疫苗有望用于肿瘤的临床研究。
图1.溶瘤病毒的作用机制2.生产材料：①细胞培养：Vero 细胞②病毒株：重组Ⅱ型溶瘤单纯疱疹病毒HSV—II，中国医学科学院肿瘤研究所提供。
③微载体：Cytodex 1④生物反应器图2.产品外观图3. Cytodex 1微载体图4.Vero细胞图5.生物反应器3.经济效益：经查阅ATCC，Vero细胞为免费（不包邮）；病毒株需向中国医学科学院肿瘤研究所申请提供（几乎免费）；微载体Cytodex 1市价为3元/瓶；生物反应器可租借。
成本保守估计（不算设备使用费）：每支成本约为6元，预售价为98元，除去设备费和人工生产费，约可净得利润30RMB/支（1ml）。
4.生产工艺流程：图6.生产车间流程图在反应罐培养间中进行重组HSV—Ⅱ病毒疫苗的微载体悬浮培养，步骤如下：①Cytodex 1微载体制备：称取一定量Cytodex l置于二甲基二氯硅烷硅化的转瓶／瓶子内，加入PBS(pH 7．2)水化，比例约为80～150 mL／g Cytodex 1，约3h后将PBS倾去，加入新PBS继续水化约3 h(可过夜)，倾去并用新的PBS洗涤一次。
高压灭菌121℃ ，30min，冷却后倾去PBS，用培养基洗涤一次后倾去，重新加入新鲜培养基置4℃ 冰箱平衡过夜，待用。
PBS继续水化约3 h(可过夜)，倾去并用新的PBS洗涤一次。
高压灭菌121℃ ，30 min，冷却后倾去PBS，用培养基洗涤一次后倾去，重新加入新鲜培养基置4~C冰箱平衡过夜，待用。
细胞培养vero实验报告
细胞培养vero实验报告Vero细胞传代培养实验报告一、实验原理体外培养的原代细胞或细胞株要在体外持续地培养就必须传代，以便获得稳定的细胞株或得到大量的同种细胞，并维持细胞种的延续。
培养的细胞形成单层汇合以后，由于密度过大生存空间不足而引起营养枯竭，将培养的细胞分散，从容器中取出，以1:2或l:3以上的比率转移到另外的容器中进行培养，即为传代培养。
细胞“一代”指从细胞接种到分离再培养的一段期间，与细胞世代或倍增不同。
在一代中，细胞培增3～6次。
细胞传代后，一般经过三个阶段：游离期、指数增生期和停止期。
细胞接种2～3天分裂增殖旺盛，是活力最好时期，称指数增生期(对数生长期)，适宜进行各种试验。
二、器材和液体的准备①.细胞培养器材：培养箱、超净工作台、倒置显微镜、25m培养瓶、5ml移液管、1ml枪头；②. 细胞培养溶液：配制好的PBS液、DMEM培养液（10%血清）、胰酶溶液。
（均已过滤灭菌，37℃预热）③．其他器材及灭菌用品：计时器、无菌手套、75%酒精、镊子、棉球、废液缸。
三、实验操作①．将长成单层的Vero细胞从二氧化碳培养箱中取出，在超净工作台中吸出瓶内的培养液，加入3~5ml的PBS溶液洗涤一次后吸出，加入1ml胰酶溶液，左右晃动培养瓶使胰酶溶液平铺在细胞表面。
放入37℃，5%二氧化碳培养箱中放置3分钟。
②.在倒置显微镜下观察被消化的细胞，如果细胞变园，相互之间不再连接成片，这时应立即在超净台中将消化液吸出，加入2ml新鲜培养液，反复吹打，制成细胞悬液。
③．将细胞悬液吸出1ml废弃后，将培养瓶中培养液添加至5ml 左右，盖好瓶塞，送回37℃，5%二氧化碳培养箱中，继续进行培养。
④. 记录细胞生长情况。
四、无菌操作的注意事项①．在无菌操作中，一定要保持工作区的无菌清洁。
为此，在操作前要认真地洗手并用75％乙醇消毒。
将要放入超净工作台的器材均需放入前喷洒75%酒精灭菌。
操作前30分钟起动超净台紫外灭菌后打开吹风，酒精棉球擦拭超净工作台面。
狂犬疫苗介绍
成大生物狂犬病疫苗一) 技术来源1984年11月，世界卫生组织（WHO）和洛克菲勒基金会（RF）开始一项合作项目——以V ero细胞为基质工业化生产狂犬病疫苗。
历时15年的努力，科学有效地解决了生产、纯化中的诸多问题。
1999年，该技术生产的高品质人用狂犬病纯化疫苗首先被批准在哥伦比亚使用，经过5年的实践，证明具有卓越的安全性和免疫效果。
该技术的核心在于实现了细胞的悬浮培养。
(二) 主要技术1、高密度微载体技术1) 微载体的诞生实现了细胞从贴壁生长到悬浮培养的革命。
成大速达®的微载体技术指标：1个微载体= 180μm1克微载体（干重）= 4,400cm2500克微载体= 1,000转瓶（3升转瓶）7.5升反应器= 150 克微载体= 350 转瓶30升反应器= 750 克微载体= 1,750 转瓶细胞密度: 10 x 106个细胞/ml细胞生长30 L 生物反应器= 7 天病毒生长天数= 20 天从上图我们可以看到细胞在微载体表面生长的非常好，细胞密度达107/ml。
刚才已经谈过，巴斯德PV2061狂犬病固定毒毒株是WHO公认的免疫原性高的V ero细胞适应株，因此，接种病毒后，连续收获病毒的滴度很高，这样从技术上就保证了成大速达®0.5ml的小剂量里面，能够含有较高的抗原蛋白和较少的杂蛋白。
2) 生物反应器为大规模细胞培养提供了设备支持。
全自动、封闭式、管道化的生物反应器3) 比照传统生产工艺，微载体高密度细胞培养的优势：* 高细胞密度* 高病毒收获* 低污染的机会* 生产工艺可控性强* 微载体投放量高达25g/L，细胞密度高达1.1-1.5x107/ml，远超过其他工艺（转瓶、细胞工厂、其他类型反应器）。
2、四柱层析纯化系统从前面的工艺流程中，我们已经知道，收获的病毒液必须经过无菌连接的管道化的澄清过滤和超滤浓缩后，灭活，然后，进行层析纯化。
下面的图中显示先进的纯化设备和训练有素的工作人员在操纵全自动的装备，经过这道关键的工艺后，有效地去除99.95%的杂蛋白和V ero 细胞DNA，保证了成大速达®具有卓越的安全性。
Vero细胞微载体放大培养技术研究
Vero细胞微载体放大培养技术研究毕军;王强;孙文【期刊名称】《中国医药生物技术》【年(卷),期】2016(011)003【总页数】3页(P275-277)【作者】毕军;王强;孙文【作者单位】430081 武汉科技大学医学院; 200080 上海聆海生物科技有限公司;430081 武汉科技大学医学院;430207 武汉生物制品研究所有限责任公司【正文语种】中文作者单位：430081 武汉科技大学医学院（毕军、王强）；200080 上海聆海生物科技有限公司（毕军）；430207 武汉生物制品研究所有限责任公司（孙文）目前，国内大部分疫苗企业仍采用传统的转瓶细胞培养工艺来生产病毒性疫苗，该方法存在细胞密度低、病毒滴度低、劳动强度大等缺点。
20 世纪 70 年代，建立了微载体/生物反应器培养动物细胞的工艺［1］，把悬浮培养和贴壁培养两种培养工艺融合在一起，兼有两者的优点，使得动物细胞工业化的大规模、高密度培养，以满足生物技术发展的需要，而细胞微载体放大培养就是其中的关键技术之一［2］。
本文通过胰酶消化微载体上 Vero 细胞，实现了 5 L 到 50 L 生物反应器的放大培养，为后续更大规模的生物反应器培养 Vero 细胞，生产病毒性疫苗奠定基础并积累经验。
1.1 材料1.1.1 细胞株Vero细胞，编号为 CCL-81，来自美国典型菌种保藏中心（ATCC）。
1.1.2 微载体Cytodex-1 购于美国 GE Healthcare 公司，经 PBS 水化处理后使用。
生物反应器应用中，微载体密度为 10 g/L。
1.1.3 主要试剂细胞培养基 DMEM 购自美国 Gibco公司，加 8% ～ 10% 小牛血清，pH 7.0 ～ 7.2；细胞消化液为 0.25% 胰酶加 0.01% EDTA，其中胰酶购自美国 Gibco公司；EDTA 购自美国 Sigma 公司。
1.1.4 主要设备C-Bio 型生物反应器为法国 Sysbiotech公司产品，工作体积 5 L 和 50 L。
激流_灌注式反应器大规模培养Vero细胞工艺研究_宋羚羚
量）大大限制了规模的进一步扩大，而昂贵的设备及
Vero细胞，由华北制药集团新药研究开发有限
酯片价格，极大地提高了疫苗产品的投资成本及生 责任公司提供。
产成本。
葡萄糖测定试剂盒，上海荣盛生物科技有限公
本实验采用全部国产的细胞载体和一次性激 司，CAT 261500。
12 中国制药装备·2011 年 6 月·第 6 辑
工程工艺与设备◆Gongcheng Gongyi yu Shebei
激流—灌注式反应器大规模培养Vero
细胞工艺研究
宋羚羚 李峦峰 郭芝香 杨 凡 孙仁峰 杜春玲 李丽文 惠觅宙
（杭州安瑞普生物科技有限公司，浙江 杭州 310019）
摘 要：反应器培养Vero细胞以微载体（Cytodex等载体）及NBS公司CellGen310酯片培养为主，培养工艺对设备、技 术要求高，一次性投资大，微载体和酯片处理繁琐，耗材价格昂贵，生产成本高。实验采用一次性激流—灌注式生物反应 器大规模培养Vero细胞，通过控制DO、pH等条件，开发出便捷、稳定的大规模培养工艺，为疫苗工业采用大规模细胞培养 工艺生产疫苗奠定基础。
工业化生产［２］，虽然已成为很有效的模式［３］，但目前 体，600 L反应器含7 200 g细胞载体。
常用的微载体使用前后处理麻烦，价格昂贵，并且该
培养模式对设备和微载体的要求都很高，细胞的生 1 材料与方法
长代谢常常受到微载体浓度的限制［４］。NBS吊篮生
物反应器是目前另一种被广泛采用的生物反应器， 1.1 主要试剂与材料
日糖耗趋于平稳，使用胰酶消化［弃去生长液，加入 终止实验。
20 mL PBS浸没润洗两次，弃去，加入胰酶15 mL，放
入微型反应器旋转，37 ℃，20 min，取出转管震荡，收 2 结果
悬浮培养Vero细胞及利用其生产病毒疫苗的方法[发明专利]
![悬浮培养Vero细胞及利用其生产病毒疫苗的方法[发明专利]](https://img.taocdn.com/s3/m/c1823b22f08583d049649b6648d7c1c708a10bb8.png)
(10)申请公布号 CN 102453697 A(43)申请公布日 2012.05.16C N 102453697 A*CN102453697A*(21)申请号 201010517544.7(22)申请日 2010.10.18C12N 5/10(2006.01)C12Q 1/68(2006.01)G01N 33/53(2006.01)A61K 39/12(2006.01)(71)申请人北京清大天一科技有限公司地址102200 北京市昌平区科技园区白浮泉路11号(72)发明人王建超 陈文庆 张韧(74)专利代理机构北京银龙知识产权代理有限公司 11243代理人钟晶(54)发明名称悬浮培养Vero 细胞及利用其生产病毒疫苗的方法(57)摘要本发明提供一种悬浮培养Vero 细胞的方法，其包括如下步骤：(1)利用包含能减弱细胞粘附性能基因序列的表达载体稳定转染Vero 细胞；(2)筛选并分离稳定转染细胞克隆；(3)检测稳定转染细胞克隆中的基因表达；(4)稳定转染细胞克隆的悬浮培养。
本发明进一步涉及利用所述悬浮培养的Vero 细胞生产病毒疫苗的方法。
(51)Int.Cl.权利要求书2页 说明书7页 附图1页(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请权利要求书 2 页 说明书 7 页 附图 1 页1.一种悬浮培养Vero细胞的方法，其包括如下步骤：(1)利用包含能减弱细胞粘附性能基因序列的表达载体稳定转染Vero细胞；(2)筛选并分离稳定转染细胞克隆；(3)检测稳定转染细胞克隆中的基因表达；(4)稳定转染细胞克隆的悬浮培养。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述步骤(1)中利用含有siat7e基因的表达载体稳定转染Vero细胞。
3.根据权利要求1所述的方法，所述转染的方法包括二乙氨乙基-葡聚糖介导法，磷酸钙介导法，脂质体介导法，聚阳离子-DMSO转染法，生物粒子介导法，电穿孔转染法，显微注射法，病毒介导法。
Vero细胞微载体悬浮培养生产工艺研究
Vero细胞微载体悬浮培养生产工艺研究摘要】目的：对微载体悬浮培养Vero细胞的生产工艺进行研究。
方法：通过调整生物反应器关键参数（转数）来研究并优化微载体悬浮培养Vero细胞工艺。
结果：优化工艺后可更好的应用于生产。
结论：优化后的工艺可以适用于生物反应器载体悬浮培养Vero细胞的生产。
【关键词】Vero细胞培养；生物反应器；生产工艺优化【中图分类号】R91 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2018）02-0384-02Study on the Production Technology of Vero Cell Microcarrier Suspension Culture Wang Jingqing, You Song, Sun Feifei.Shenyang Pharmaceutical University 10163【Abstract】Objective Studies on production process for a microcarrier suspension culture of Vero cells. Methods The production process for a microcarrier suspension culture of Vero cells was optimized by adjusting the key parameters(stir speed) of bioreactor. Results The optimized process will be better used in production. Conclusion The optimized process can be applied to bioreactor microcarrier suspension culture of Vero cells.【Key words】Culture of Vero cells; Bioreactor; Optimization of production process 动物细胞的体外培养已经广泛应用于药品特别是疫苗的生产中，通过生物反应器对Vero细胞和病毒进行大规模、高密度培养，并通过此方式进一步生产狂犬、乙脑等疫苗在国内已经为主流技术[1]。
VERO细胞生物反应器放大培养初探
VERO细胞生物反应器放大培养初探许刚;周景明;付欣;马兰;王文乐【期刊名称】《生物技术》【年(卷),期】2010(20)2【摘要】目的:研究用生物反应器放大进行Vero细胞微载体培养,实现生物反应器之间Vero细胞放大培养。
方法:5L微载体生物反应器以10g/L微载体浓度培养Vero细胞,96h时经漂洗、消化、接种于30L微载体生物反应器,实现放大后的30L微载体生物反应器细胞快速增殖,期间对不同时期的微载体细胞进行细胞计数、细胞代谢分析和形态观察。
结果:5L生物反应器细胞经过96h灌注培养,平均细胞密度达到7.81×106cells/mL。
5L微载体细胞放大到30L微载体生物反应器,平均细胞收获率为32.3%;放大到30L生物反应器后经过144h培养,细胞密度达到9.19×106cells/mL;放大后的细胞代谢途径依然以葡萄糖氧化代谢乳酸为主。
结论:生物反应器由5L到30L进行Vero细胞放大培养是可行的。
【总页数】4页(P53-56)【关键词】Vero细胞培养;微载体;生物反应器;接种【作者】许刚;周景明;付欣;马兰;王文乐【作者单位】华兰生物疫苗有限公司;郑州大学生物工程系【正文语种】中文【中图分类】Q813.11【相关文献】1.易操作且具有高细胞量的密闭系统——一种培养Vero细胞生产副粘病毒的新型生物反应器 [J], 申斐;王玮;谢萍;2.生物反应器培养Vero细胞制备狂犬病毒 [J], 韩中山3.生物反应器悬浮培养Vero细胞制备水貂犬瘟热活疫苗 [J], 冯二凯;程悦宁;罗国良;易立;王振军;郭利;陈立志;程世鹏4.生物反应器培养Vero细胞的生长代谢与限制因素研究 [J], 史秀山因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
Vero细胞在WAVE反应器中的微载体球转球放大
Vero细胞在WAVE反应器中的微载体球转球放大陆丽芳，Christain Kaisermayer, 姚钰舜，隋礼丽通用电气医疗集团生命科学部，Fast Trak研发中心，上海概要Vero细胞能被广泛应用于疫苗的生产。
Vero细胞的培养技术能否成功放大对于该技术能否大规模应用于疫苗生产至关重要。
作为贴壁细胞，我们的经验证明Vero细胞能够成功地用微载体技术在WAVE反应器中生长。
为了进一步寻求放大培养的可能性，我们在WAVE反应器中进行了细胞从微载体Cytodex 1上的球转球实验。
一系列的实验都相当成功。
Vero细胞首先在10 L的培养袋中用Cytodex 1微载体培养到一定密度，生长在微载体上的细胞随后用胰蛋白酶消化，经消化后基本脱离微载体的细胞最终和旧的微载体根据一定的传代密度转移到新的微载体培养体系中并开始新一轮细胞培养。
我们的结果显示，几次这样的转移传代前后，细胞的生长速度基本一致。
Vero细胞的微载体培养技术在WAVE反应器中放大完全可能。
进一步的实验显示，在现有的工作条件下，Vero细胞在Cytodex上的培养以及球转球工艺可以达到10倍的放大倍率。
这为基于细胞培养的疫苗大规模工业化生产新前景提供了可靠的支持。
概要 · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · ·1前言 · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · ·2方法 · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · ·2 WAVETM 反应器中Vero细胞的培养 · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · 2 在瓶子内进行球转球实验 · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · 2 在WAVETM培养袋内进行球转球实验 · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · 3结果 · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · ·3 各次球转球实验情形· · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · 3 球转球前后细胞生长曲线· · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · ·4 球转球前后细胞在微载体上的生长形态· · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · 4讨论· · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · ·8结论· · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · ·8参考文章· · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · 9陆丽芳博士：通用电气医疗集团生命科学部，Fast Trak研发中心，科学家前言Vero细胞最初起源于非洲绿猴肾，已知对多种病毒如SV40、 SV-5、麻疹病毒、虫媒病毒、呼吸道肠道病毒、风疹、猿腺病毒、脊髓灰质炎病毒、流感病毒、副流感病毒、牛痘病毒等等，都敏感。
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3∶3 3∶2 2∶1
胞, 通过换液和罐注的方法, 培养
3∶1
8d, 细 胞 密 度 达 1. 1 × 107cells
4∶1
mL (见图 2) , 然后接种狂犬病
毒, 连续培养 10d, 病毒滴度超过国家标准。
2. 3 球转球动力学模型的建立
T he p lating rate after add ing m icrocarriers (% )
p lating
ra te=
the
num ber of m icrocarriers w ith 1 000
ce lls ×100%
壁率达到100% 的时间也相
应加长。为了增加放大规模, 同时
表 2 新老球比例对球转球的影响
有较高的细胞贴壁率和较短的贴 Table 2 T he influence of the new o ld m icrocarrier ratio on
adding m icroca rriers
参考文献
1 Beale A J. T he p roduction of viru ses fo r hum an vaccines from an im al cell in cu ltu re. In: Sp ier R E, Griffith s J B ed s. A n im al Cell B io techno logy. L ondon: A cadem ic P ress, 1992. 5: 189～ 200
当培养规模较小 (如 1. 5L , 2. 5L ) 时, 游离的种子细胞可从方瓶或滚瓶中获得; 当培养规模 较大, 就需要一级甚至多级种子反应器, 这时的细胞就不是游离细胞, 而是贴在微载体上的, 这 就使得放大培养产生困难。为了解决此困难, 可以将贴在微载体上的种子细胞用胰蛋白酶消化 下来, 再重新接到更多的微载体上[5], 该方法在理论上可行, 但在实际生产中, 细胞经过消化, 活性受到一定伤害, 消化后的微载体部分被破坏, 不能被细胞再贴附, 即使没有被完全破坏, 其 贴壁率也明显下降, 影响细胞的生长, 不适合大规模培养。 另一种方法是通过球转球方法 (bead s2to 2bead s) , 让老的微载体上的细胞通过球间架桥, 转移到新的微载体上, 使细胞在新的 微载体上生长[6, 7]。这种方法操作步骤简单, 污染机会相对较少, 细胞活性高, 微载体损失少, 可 以连续使用, 但至今很少见到报道微载体培养过程中球转球的具体工艺条件, 多数是凭经验。 本文研究了球转球的工艺条件, 并建立了球转球的动力学模型, 为大规模生产奠定了基础。
隔 45m in 转动 2m in, 3h 后正常运行, 观察细胞生长状态对球转球的影响。
(3) 用 CelliGen 1. 5L 细胞培养用生物反应器, 当微载体上细胞已长成致密单层时, 补加
一定的微载体, 使新老微载体的比例分别为 2∶3、3∶3、3∶2、2∶1、3∶1、4∶1, 进行球转球实
验, 测定新老球比例对球转球的影响。
提要: 概述了用微载体系统培养贴壁细胞放大过程中的接种方法, 研究了球转球 的工艺条件, 并建立了球转球的动力学模型。 用此方法成功地在国产 50L 生物反应 器中培养V ero 细胞, 细胞密度达 1. 1×107cells mL。
关键词: 细胞培养; V ero 细胞; 接种技术; 微载体; 放大培养 中图分类号: Q 951. 6, R 978. 19
通过培养转化的哺乳动物细胞生产病毒疫苗, 是令人关注的科技发展领域[1], 但这些病毒 疫苗或蛋白产品的唯一生产途径是细胞的大规模培养。自从 1967 年V an W ezel AL [2]成功地 利用D EA E 2Sep hadex○RA 250 培养贴壁依赖性细胞以来, 让贴壁依赖性细胞贴附在微体上在生 物反应器中培养是迄今最常用、最有效的模式[3]。 80 年代, 开发了多种有效的微载体, 如 Pha rm acia L TD (Sw ede) 的 Cytodex21、Cytodex23, 90 年代开发了巨孔载体及相应的生物反应 器[4]。 同时, 科研人员对培养工艺也进行了研究。
1 材料和方法
1. 1 材料 细胞: 非洲绿猴肾V ero 细胞 (A TCC) : 150～ 180 代。 培 养基: DM EM (D u lbecco’s M od ified Eag le M ed ium , G IBCOL ) , 加 5%～ 10% 小牛血
收稿日期: 1998202218 © 1994-2010 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved.
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关于游离细胞在微载体上的贴壁动力学研究已有不少报道[11, 12], 但关于球转球动力学的
研究较少, 以下对球转球动力学进行初步探讨。假设: (1) 由于微载体浓度较小 (新球和老球的
1d
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4d
为 2g L 和 3g L , 补加一定 M icrocarriers w ith no t fu ll cells
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量的微载体, 进行球转球实 M icrocarriers w ith fu ll cells
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验, 以后每天取样, 观察计算 M icrocarriers w ith m u ltilayer cells
(4) 以 CelliGen 5L 细胞培养用生物反应器作为种子罐, 当细胞生长到一定密度时, 将细
胞和新的微载体一起移入CellCu l250A 细胞培养反应器中, 进行球转球操作, 然后进入正常培
养阶段[7]。整个培养过程为自动控制, 温度控制在 37±0. 1°C, 溶解氧为 50% 空气饱和度, 转速
转瓶: 500mL 转瓶 (W hea ton, U SA ) 装液 200mL。
反应器: 1. 5L、5L CelliGen 细胞培养反应器 (NB S. CO. U SA ) , 50L CellCu l250A 细胞培养
生物反应器 (华东理工大学研制)。
1. 2 实验方法
(1) 微载体的预处理和灭菌见参考文献[ 8 ]。
定义新球的转球率为 7 : 7 = (C 0 - C ) C 0 =
1- C C 0= 1- e- kt
图 3 补加微载体后的球转球过程
计算机拟合表 2 的数据, 有较好的相容性, 见 F ig. 3 T he p rocess of beads2to 2beads after
图 3。 同时拟合文献[ 6 ]的数据也有较好的一致性。
三次, 再用戊二醛固定, 样品由华东理工大学分析测试中心电镜室处理后拍照。
2 结果与讨论
2. 1 细胞生长状态对球转球的影响 转瓶中微载体浓度为 3g L , 当微载体上细胞分别长到: ① 微载体上没有完全被细胞贴
满, ② 微载体上已被细胞贴满, ③ 微载体上的细胞已长成多层时, 补加新的微载体 2g L , 以后 每天取样计数光球数和满球率, 结果如表1。从表1可以看出, 当微载体上细胞已长到致密单 层时补加微载体, 可使新的微载体上较快地有细胞贴附, 贴壁率很快达到 100% , 其他两种情 况需要较长时间贴壁率才能达到 100%。 这可能由于球间转移方式是通过细胞粘附搭桥生长 或单个细胞迁居生长[6]。 当细胞生长旺盛时, 细胞搭桥生长或迁居生长能力强; 当微载体上细 胞长满时, 细胞向外生长的趋势明显, 因而更易进行球转球 (见图 1)。因此, 当微载体上已被细 胞贴满时, 补加适量微载体进行球转球时机最好。
壁时间, 根据本实验结果, 新老球
beads2to 2beads
的比例以 3∶1 为优。
N ew bead s∶o ld bead s
用球转球方法, 以CelliGen
5L 细胞培养用生物反应器作种
2∶3
子罐, 在国产 50L CellCu l250A 细 胞 培 养 反 应 器 中 培 养 V ero 细
- dC d t = kC 式中: C —没有细胞生长的微载体的浓度 (g L ) ; k — 反应速度常数, 与环境温度, 转速, 微载体浓度, 新 老球比例等因素有关。
上式积分, 得
lnC C 0 = - k t 或 C C 0 = ekt
当 t= 0 时, C = C 0
式中: C 0—补加新球的微载体浓度 (g L )。
V o l. 24 N o. 6 1998212
华 东 理 工 大 学 学 报 rnal of East Ch ina U n iversity of Science and T echno logy
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Vero 细胞的微载体培养
——放大过程中的接种工艺
张 立3 严 春 范卫民 张元兴 俞俊棠 (华东理工大学生物化工研究所, 上海 200237)
© 1994-2010 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved.
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华 东 理 工 大 学 学 报
第 24 卷
最大浓度为 5g L ) , 可假设瞬间球与球随机碰撞时, 只有两个球相撞。(2) 满球与满球接触时, 不发生球间转移作用, 只有当满球与空球接触时细胞发生球间转移作用。 根据文献报道[13～ 15 ], 该过程符合一级反应, 即