第三章 细胞培养专用微载体

细胞培养技术的快速发展阶段

（1）20世纪40年代抗生素的发展、无菌技术的 成熟，为动物细胞规模化的培养奠定了基础。
（2）1962 年，以Capstick等成功进行BHK细胞 （幼年仓鼠肾细胞）的悬浮培养为标志，动物细 胞进入了规模化生产阶段， 发展至今已成为生物、 医学研究和应用中广泛采用的技术方法。
●微载体的大小：增大单位体积内表面积（S/F） 百度文库细胞的生长非常有利。使微载体直径尽可能小， 最好控制在100-200μm之间。 ●微载体的密度：一般为1.03-1.05g/cm3，随着细 胞的贴附及生长，密度可逐渐增大。 ●微载体的表面电荷：据研究，控制细胞贴壁的 基本因素是电荷密度而不是电荷性质。若电荷密 度太低，细胞贴附不充分，但电荷密度过大，反 而会产生“毒性”效应。
论证实验：
1907年，美国胚胎学家Harrison，把蛙胚神 经管区的一片组织植入蛙的淋巴液凝块中， 组织不仅存活几个星期，而且从培养的细 胞中长出轴突。 成功：在于实验方法的设计，防止了细菌 的污染；Harrison被称为“细胞培养之父”。
改进实验：
（1）1910年，Burrows在悬滴培养法中用鸡血浆作为 鸡胚组织的支持和营养物质。事实证明它比淋巴要好 得多，能使神经组织、心脏组织及皮肤生长良好。 （2）Burrows继续与其他同事Alexis Carrel合作，成 功地培养了成年狗、猫、小鼠、豚鼠等动物的组织。 （3）Burrows和Carrel还证明，若把胚胎提取液（鸡 胚匀浆的组织“汁”）与血浆混合使用，培养物可存 活与生长得更好一些。
第三章 细胞培养专用微载体
有关细胞培养的基本概念
1．细胞培养(Cell culture) ：细胞（包括单个细胞）在体外条 件下的生长。 2．组织培养（Tissue Culture）：是指从体内取出组织和细 胞，模拟体内生理环境，在无菌、适当温度和一定营养条件 下，使之生存和生长并维持其结构和功能的方法。 3．器官培养（Organ Culture）：指的是应用和组织培养相 似的条件，培养的是器官的原基、器官的一部分或整个器官， 使之在体外生存、生长和保持一定功能的方法。
三个阶段
贴壁依赖的动物细胞在微载体表面上 增殖，可分为贴壁、生长和扩展成单层 三个阶段。
细胞能否贴在微载体表面上？
一、取决于细胞与微载体接触的机率 二、取决于细胞与微载体的相融性 ，这又 是与基质表面的化学、物理性质相关。
细胞在微载体表面贴附的影响因素
1. 搅拌转速：由于动物细胞无细胞壁，对剪切力敏 感，因而无法靠提高搅拌转速来增加接触概率。通 常的操作方式是：在贴壁期采用低搅拌转速，时搅 时停；数小时后，待细胞附着于微载体表面时，维 持设定的低转速，进入培养阶段。微载体培养的搅 拌非常慢，最大速度75r/min。 2.细胞与微载体的相融性：是与微载体表面理化性 质有关。一般细胞在进入生理pH值时，表面带负电 荷。若微载体带正电荷，则利用静电引力可加快细 胞贴壁速度。若微载体带负电荷，因静电斥力使细 胞难于黏附贴壁，但培养液中溶有或微载体表面吸 附着二价阳离子作为媒介时，则带负电荷的细胞也 能贴附。
最新研究结果表明
促使细胞贴壁的蛋白质分子，是冷析球蛋 白 （ cold insoluble globulin ） 或 纤 粘 素 （Febronectin），两者均属于糖蛋白的一种 蛋白质，都是血清中含有的成分。某些动物细 胞，如人的成纤维细胞，能合成大量纤粘素， 在无血清的情况下，也能贴壁。相反，某些细 胞，如许多细胞系或转化细胞，合成这种糖蛋 白的量很少，只有在培养基中外加糖蛋白，才 能促使细胞迅速贴壁。在这种情况下，可以在 培养基中补加血清，来提高糖蛋白含量。所以， 无论微载体表面是带正电荷还是带负电荷，表 面都可涂一层能吸附细胞的物质，如冷析球蛋 白或纤粘素，用来加快细胞贴壁速度。
细胞在微载体表面的生长的影响因素
影响细胞在微载体表面生长的因素很多，主要有 三个方面。 ●在细胞方面，如细胞群体、状态和类型。 ●在微载体方面，如微载体表面状态、吸附的大分子 和离子；微载体表面光滑时细胞扩展快，表面多孔则 扩展慢。 ●在培养环境中，如培养基组成、温度、pH、氧以及 代谢废物等均明显影响细胞在微载体上的生长。如果 所处条件最优，则细胞生长快；反之生长速度慢。
Carrel的巨大贡献——细胞的传代
①把无菌技术方面的知识引入细胞培养中 ②发明设计了卡氏培养瓶（Carrel flask)
③在没有抗生素的情况下，使鸡胚心脏细胞 维持生存34年，先后传代3400多次 ④为细胞的传代培养奠定了基础。
（4）两位美国科学家W.H.Lewis 和 M.R.Lewis从 另一个角度研究了培养技术。他们最先试图用已 知成分的合成培养基取代不能正确确定其成分的 天然培养基（血浆及胚胎提取液）。 （5）1955年，Eagle采用一种成分确定的培养基 （DMEM培养基）在添加血清的基础上，成功替 代了当时普遍采用的生物体液进行细胞培养。
4．以上三个层次的培养，又可统称之为体外培养。
5．细胞培养技术：就是选用最佳生存条件对活细胞 进行培养和研究的技术。 6．动物细胞培养技术：从动物体内取出细胞或者组 织，分散成单个细胞，模拟体内的生理环境，在 无菌、适温和丰富的营养条件下，让其在体外的 培养瓶或培养基上继续生长和增殖的技术 。
动物细胞培养技术的发展史
冷析球蛋白和纤粘素，都是微载体和 细胞间架桥的蛋白质。 二价阳离子所起的作用，是作为细胞与 糖蛋白结合的媒介。细胞是通过二价阳离 子结合到糖蛋白上。由以上所述，细胞能 通过血清中糖蛋白的架合作用，贴在带正 负电荷微载体的表面上。如微载体带的是 正电荷，还可通过附加的静电吸引力，使 贴壁速度加快。因此，若在接种细胞株之 前，预先用有血清的培养基培育微载体， 能加快细胞的贴壁速度。
从国际上动物细胞培养技术的发展趋势 看, 主要有6个方面的发展方向:
(1) 开发细胞培养反应器和培养系统;
(2) 开发培养贴壁细胞的载体;
(3) 开发微囊技术 (4) 开发杂交、重组技术; (5) 开发无血清和化学合成的培养基; (6) 蛋白质浓缩和提纯技术。
第一节 采用微载体培养贴壁细胞是当前最 有发展前途的一种培养模式
使用较多的反应器有两种：贝朗公司的BIOSTAT B反应器，使 用双桨叶无气泡通气搅拌系统；NBS公司的CelliGen、CelliGen PlusTM和Bioflo3000反应器，使用Cell-lift双筛网搅拌系统。两 种系统都能实现培养细胞和收获产物的有效分离。
悬浮培养的局限性
1、大部分哺乳动物细胞为贴壁依赖性细胞，需要附 壁培养。 2、在培养过程中细胞易变异，潜在着致癌危险，培 养病毒细胞有时会失去标记，使免疫能力降低， 因此悬浮培养的动物细胞或生物制品主要用作诊 断试剂，不宜直接用于人体。 3、悬浮培养的细胞密度低。
3. 病毒研究 举例：SARS病毒的发现 病料——选择敏感宿主细胞——细胞培养 ——形态观察研究分析——疫苗制备
4.毒性检测实验 （1）药物筛选 （2）化学物质、放射性物质等的毒性检测
5.疾病诊断、治疗
（1）遗传病的产前检查 （2）利用培养病毒进行基因缺损治疗 （3）器官、组织培养移植 举例： 皮肤移植、功能细胞培养植入 日本用骨髓细胞培养皮肤 德研究人员用骨髓干细胞培养出精原细胞 不易引发排异反应的“万能细胞”培养成功 （4）生产重组蛋白
微载体培养应用 此技术于1967年被用于动物细胞大规模培养。 经过几十余年的发展，该技术目前已渐日趋完善和成熟，并广 泛应用于生产疫苗、基因工程产品等。微载体培养是目前公认 的最有发展前途的一种动物细胞大规模培养技术，其兼具悬浮 培养和贴壁培养的优点，放大容易。目前微载体培养广泛用于 培养各种类型细胞，生产疫苗、蛋白质产品，如293细胞、成 肌细胞、Vero细胞、CHO细胞。
2. 单克隆抗体制备
1975年英国科学家Milstein和Kohler将产生抗 体的淋巴细胞同肿瘤细胞融合，成功建立了单克隆 抗体技术，而获得1984年诺贝尔医学和生理学奖。 单克隆抗体技术的最主要优点是可以用不纯的抗原 分子大量制备纯一的单克隆抗体。 杂交瘤技术：将骨髓瘤细胞与B淋巴细胞融合， 建立能分泌均质抗体的杂交瘤细胞系。 杂交瘤技术优点：每个B淋巴细胞仅专一地产生、 分泌一种针对某 种抗原决定簇的特异性抗体，而肿 瘤细胞可以无限增殖，因此杂交瘤细胞可在体外培 养或移植到体内条件下分泌大量单克隆抗体。
微载体 是指直径在60-250μm，能适用于贴壁细胞
生长的微珠。一般是由天然葡聚糖或者各种合成的聚 合物组成。自Van Wezel用DEAE-Sephadex A 50 研制 的第一种微载体问世以来，国际市场上出售的微载体 商品的类型已经达十几种以上，包括液体微载体、大 孔明胶微载体、聚苯乙烯微载体、PHEMA微载体、甲 壳质微载体、聚氨酯泡沫微载体、藻酸盐凝胶微载体 以及磁性微载体等。常用商品化微载体有三种： Cytodex1、2、3，Cytopore和Cytoline。
（3）细胞培养始传我国是20世纪30年代。至50 年代以后，细胞培养在我国逐步开展起来。

动物细胞培养技术的应用
1. 疫苗制备：
疫苗工业早期：普遍使用人工病毒感染的兔子和牛 作为病毒疫苗的来源； 培养细胞为病毒的增殖提供了场所。 举例： （1）Vero细胞和狂犬病毒的培养工艺 （2）2005年11月，美国国会紧急拨款71亿美元用 于预防疾病疫苗的研制，其中28亿用于细胞培养， （3）科技日报2006年7月13日讯，美国密西根州 动物科学实验室的科研小组日前宣布，他们利用细 胞培养技术，开发出制造人类流感疫苗的新方法。
萌芽实验：
（1）1885年，德国人W Roux把鸡胚组织放在温热的盐 水中维持其存活了10天。
（2）1887年，Arnold把白细胞收集在盛有盐水的小碟 子里，观察到白细胞的运动，并存活了一段时间。
实验缺陷：由于当时的培养基不理想，实验难以重复， 不能断定观察到的是真正存活的健康组织或细胞。
6.其它方面
生物科学的基础研究等。
Vero细胞被成功的用来培养狂犬病疫苗、乙脑疫苗 等多种疫苗，在非典期间又为研究冠状病毒做出贡 献，在医药研究种广泛应用。
来源： 非洲绿猴肾细胞 形态：上皮细胞 生长特性：贴壁 注释：该细胞是日本千叶大学的Y. Yasumura和Y. Kawakita于 1962年3月27日从一只正常的成年非洲绿猴肾组织培养出来的 。 培养液：MEM（ 含 2 mM L-谷氨酰胺 和 Earle's BSS，1.5 g/L NaHCO3, 0.1 mM 非必需氨基酸, 1.0 mM 丙酮酸钠）， 10%胎 牛血清 传代：吸去培养液。 用 0.25% (w/v) Trypsin- 0.53 mM EDTA 洗一次，以去除血清（血清会抑制胰酶的活性）。 加2-3毫升 Trypsin-EDTA，放在37℃培养箱内约5分钟，直到细胞全部脱落 。 加6-8毫升培养液，用移液器把细胞吹散。 加适量的细胞到 新的培养器皿中。（以1:3至1:6为宜，传代期间培养液每周更换 2-3次） 冻存： 95%培养液+5%DMSO冻存于液氮。
第二节 动物细胞在微载体上贴壁生长机理
原理：其原理是将对细胞无害的颗粒-微载体加入
到培养容器的培养液中，作为载体，使细胞在微 载体表面附着生长，同时通过持续搅动使微载体 始终保持悬浮状态。
贴壁依赖性细胞在微载体表面上的增殖，要经历 黏附贴壁、生长和扩展成单层三个阶段。细胞只 有贴附在固体基质表面才能增殖，故细胞在微载 体表面的贴附是进一步铺展和生长的关键。黏附 主要是靠静电引力和范德华力。细胞能否在微载 体表面黏附，主要取决于细胞与微载体的接触概 率和相融性。
微载体培养优点
●表面积/体积（S/V）大，因此单位体积培养液 的细胞产率高； ●把悬浮培养和贴壁培养融合在一起，兼有两者 的优点； ●可用简单的显微镜观察细胞在微珠表面的生长 情况； ●简化了细胞生长各种环境因素的检测和控制， 重现性好； ●培养基利用率较高； ●放大容易； ●细胞收获过程不复杂； ●劳动强度小； ●培养系统占地面积和空间小